第四章 微生物的营养和培养基 本章的学习目的与要求：

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1 第四章 微生物的营养和培养基 本章的学习目的与要求：   了解微生物的6类营养要素和各要素在培养基中的作用；掌握微生物营养类型的划分及其依据，相应营养类型的能源、氢供体及基本碳源和代表微生物举例；掌握营养物质进入微生物细胞的方式，各种运输方式的主要特点及相互间的区别；了解选用和设计培养基的原则和方法，熟练掌握培养基的划分依据和各类培养基的特点，特别是选择性培养基、鉴别性培养基的定义、设计原理及用途。

2 营养物： 能为机体生命活动提供结构物质、能量、代谢调节物质和良好的生理环境的物质称为营养物。 营养： 指生物体从外部环境摄取其生命活动所必须的能量和物质，以满足其生长和繁殖需要的一种生理功能 。

3 第一节 微生物的六类营养要素 第二节 微生物的营养类型 第三节 营养物质进入细胞的方式 第四节 培养基

4 第一节 微生物的六类营养要素 一、细胞化学组成 1、元素水平
主要是C、H、O、N（占干重90-97%），和各种矿物质元素（依次为P、S、K、Mg、 Ca、Fe、Zn、Mn等）。 2、化合物水平 水分、蛋白质、碳水化合物、脂肪、核酸和无机盐 等。

5 二、微生物的六种营养要素及其功能 主要功能：提供合成原生质和代谢产物原料；产生合成反应及生命活动所需能量；调节新陈代谢。 （一）碳源：
1、定义：凡可构成微生物细胞和代谢产物中碳架来源的营养物质称为碳源。 2、生理功能： 构成细胞物质，供给微生物生长发育所需要的能量。

6 3、碳源谱 (1)碳源谱特点 1）微生物能利用的碳源类型大大超过了动物界或植物界所能利用的碳化合物。 2）不同种的微生物其具体碳源利用范围是很悬殊的。 3）凡必须利用有机碳源的微生物，就是为数众多的异养微生物，凡能利用无机碳源的微生物，则是自养微生物。 4）对异养微生物来说，它的碳源同时又充作能源，这时，可认为碳源是一种双功能的营养物。

7 (2) 利用顺序 对异养微生物来说，其最适碳源则是“C.H.O”型。其中，糖类是最广泛利用的碳源，其次是醇类、有机酸类和脂类等。在糖类中，单糖胜于双糖和多糖，己糖胜于戊糖，葡萄糖、果糖胜于甘露糖、半乳糖；在多糖中，淀粉明显地优于纤维素或几丁质等纯多糖，纯多糖则优于琼脂等杂多糖和其他聚合物。

8 （二）氮源 1、定义：凡是构成微生物的细胞物质或代谢产物中氮素来源的营养物质称为氮源。 2、生理功能： 主要是提供合成原生质和细胞其他结构的原料，一般不作能源。

9 3、氮源谱 (1)氮源谱特点 1）微生物的氮源谱大大广于动物或植物的。 2）氨基酸自养型和异养型生物： 氨基酸自养型生物：不需要氨基酸作为氮源的，它们能把非氨基酸类的简单氮源自行合成所需要的一切氨基酸。 氨基酸异养型生物：需要从外界吸收现成的氨基酸作氮源。 3）无机的氮源物质一般不提供能量，只有极少数的化能自养细菌如硝化细菌可利用铵态氮和硝态氮作为氮源和能源。 4）速效氮源和迟效氮源： 含蛋白质的有机氮源称为迟效性氮源；而无机氮源或以蛋白质的各种降解产物形式存在的有机氮源则被称为速效氮源。 5)生理酸性、碱性、中性盐

10 (2) 利用顺序 一般说来，异养微生物对氮源利用的顺序是：“N．c．H．o”或“N．c．H．o．x”类优“N．H”类，更优于“N．o”类，而最不易被利用的则是“N”类。

11 （三）能源 1、定义：能源是指能为微生物的生命活动提供最初能量来源的营养物或辐射能。 2、能源谱 （1）能作化能自养微生物能源的物质都是一些还原态的无机物质，能氧化利用这些物质的微生物都是细菌。 （2）一种营养物常有一种以上营养要素功能，即除单功能营养物外，还存在双功能、三功能营养物的情况。

12 （四）生长因子 1、定义：一类对微生物正常代谢必不可少且又不能从简单的碳、氮源自行合成的所需极微量的有机物。 2、作用：辅酶或酶活化。 3、种类：维生素、AA、base、FA等。 (1)维生素：因为它只是作为酶的活性基，所以需要量一股很少。 (2)氨基酸：需要量较大，比维生素的需要量大几千倍。 ⑶嘌呤、嘧啶及它们的衍生物：主要功能是构成核酸和辅酶。 (4)脂肪酸等组成细胞膜的类脂成分。

13 4、生长因子与微生物的关系 (1)生长因子自养型微生物： 不需要外界提供生长因子的微生物，包括多数真菌、放线菌、霉菌。 (2)生长因子异养型微生物 需要多种生长因子的微生物，包括乳酸菌、动植物致病菌、原生动物、支原体等。 (3)生长因子过量合成微生物 指在其代谢活动中不仅能合成而且可以在自己细胞中大量累积维生素等生长因子的微生物。在实践上将它们作为维生素等的生产菌。 5、来源：酵母膏、玉米浆、黄豆饼粉、动植物组织液、麦芽汁等，复合维生素。

14 （五）无机盐 1、种类 (1)大量元素：凡是生长所需浓度在10-3～10-4mol/L范围内的元素，可称为大量元素，包括P、S、K、Mg、Ca、Na和Fe等。 (2)微量元素：凡是生长所需浓度在10-6～10-8mol/L范围内的元素，则称为微量元素，包括Cu、Zn、Mn、Mo、和Co等。 2、功能：构成细胞的组成成分；调节细胞渗透压；作为酶的激活剂；调节氢离子浓度pH、氧化还原电位Eh等；作为无氧呼吸时的氢受体以及某些自养微生物的能源等。

15 3、无机元素来源： （1）大量元素：加入有关化学试剂，其中首选的是K2HPO4及MgSO4 。一些无机元素加入盐： （2）微量元素：除配制精细培养基，一般不加入。

16 （六）水 1、生理功能：组成成分；反应介质；物质运输媒体；热的良导体。 2、存在状态：游离态（溶媒）和结合态（结构组成） 。 游离水的多少可用水活度aw来表示。水活度是指在相同的温度和压力下，体系中溶液的水的蒸汽压与纯水的蒸汽压之比，即：

17 第二节 微生物的营养类型 营养类型是指根据微生物生长所需的主要营养要素即能源和碳源的不同而划分的微生物类型。 一、微生物营养类型的分类
第二节 微生物的营养类型 营养类型是指根据微生物生长所需的主要营养要素即能源和碳源的不同而划分的微生物类型。 一、微生物营养类型的分类 依碳源不同： 异养型：不能以CO2或可溶性碳酸盐为主要或唯一碳源。 自养型：能以CO2或可溶性碳酸盐为主要或唯一碳源。 依能源不同： 光能营养型：光反应产能。 化能营养型：物质氧化产能。 依氢供体不同： 无机营养型：以无机化合物为氢供体。 有机营养型：以有机物作为氢供体。

18 二、微生物的营养类型 1、光能自养型（光能无机营养型）微生物 利用光能为能源，以二氧化碳(CO2)或可溶性的碳酸盐(CO2-3)作为唯一的碳源或主要碳源。以无机化合物(水、硫化氢、硫代硫酸钠等)为氢供体，还原CO2，生成有机物质。 光能自养型微生物主要是一些蓝细菌、红硫细菌、绿硫细菌等少数微生物，它们由于含光合色素，能使光能转变为化学能(ATP)，供细胞直接利用。 2、化能自养（化能无机营养型）微生物 以无机物氧化所产生的化学能为能源、以各自合适的无机化合物为氢供体，去还原CO2或者可溶性碳酸盐合成有机物质。如亚硝酸细菌、硝酸细菌、铁细菌、硫细菌、氢细菌就可以分别利用氧化NH3、NO2-、Fe2+、H2S和H2产生的化学能来还原CO2，形成碳水化合物。

19 3、光能异养型（光能有机营养型）微生物 以光能为能源，利用有机物作为供氢体，利用CO2或一些简单有机物作碳源，合成细胞的有机物质。 4、化能异养型（化能有机营养型）微生物 其能源和碳源都来自于有机物，能源来自有机物的氧化分解，ATP通过氧化磷酸化产生，碳源直接取自于有机碳化台物。它包括自然界绝大多数的细菌，全部的放线菌、真菌和原生动物。

20 第三节 营养物质进入细胞的方式 营养物质进入微生物细胞的方法和速率取决于以下诸因素：
第三节 营养物质进入细胞的方式 营养物质进入微生物细胞的方法和速率取决于以下诸因素： (1)营养物质的性质：包括分子大小、电荷、结构及光学异构类型等。 大分子：先水解为小分子，再吸收。　　 脂溶性物质：易透过。 离子化合物：弱快强慢（极性） （2）细胞(即质膜)所处的环境条件：即渗透压、pH、温度、氧分压、表面活性剂等。 (3)细胞的结构和功能：如种类、表现形态、菌龄、生理状态及代谢活性等。

21 一、单纯扩散 1、概念：单纯扩散又称被动运送，是指细胞膜这层疏水性屏障可通过物理扩散方式让许多小分子、非电离分子尤其是亲脂性的分子被动地通过。 2、特点：依靠胞内外溶液浓度差，顺浓度梯度运输，不消耗代谢能，不需要载体蛋白，无特异性。以单纯扩散方式运送的物质主要是水、二氧化碳、氧气、甘油、乙醇等。 二、促进扩散 1、概念：促进扩散是在不需要任何能量的情况下，利用细胞膜上的底物特异性载体蛋白在膜的外侧与溶质分子结合。而在膜的内侧释放此溶质而完成物质的输送。 2、特点：借助载体蛋白顺浓度梯度运输，不耗能，有特异性。

22 三、主动运送 1、概念：主动运送是指需要能量和载体蛋白的逆浓度梯度积累营养物质的过程，是微生物吸收营养物质的主要机制。 2、特点：吸收营养物的主要机制。逆浓度梯度运输，耗能，需载体蛋白，有特异性。氨基酸、乳糖等糖类、钠、钙等无机离子。 四、基团移位 1、概念：基团移位是一种既需要特异性载体蛋白又需耗能、且溶质在运送前后会发生分子结构变化的运送方式。 2、特点：基团移位由一个复杂的运输系统PTS（磷酸转移酶系统）来完成的耗能的逆浓度梯度的物质输送，运输过程中会发生化学变化，运输后不能跨膜运出，且细胞膜和细胞质的成分都参与了运输。基团移位主要用于糖的运输，此外在某些细菌里脂肪酸、核苷、碱基等物质也可通过这种方式运输。

23 3 、PTS系统组成 (1)热稳载体蛋白（HPr）：热稳载体蛋白是一种低分子量的可溶性蛋白质，它结合在细胞膜上，具有高能磷酸载体的作用（接受PEP的高能磷酸键并交给EII）。 (2)酶1：酶1是一种可溶性蛋白质，存在于细胞质中，不具有特异性（是通用的），其作用是使HPr被PEP磷酸化。 (3)酶2：酶2有三种IIa、IIb、IIc，IIa为细胞质蛋白，无底物特异性；IIb、IIc为膜蛋白，对底物有特异性选择作用，可诱导产生。酶2的作用是催化底物磷酸化。

24 4、基团移位运输糖的过程： (1)热稳载体的激活：HPr在酶1的作用下，被PEP磷酸化。 PEP+ HPr<=>丙酮酸+P-HPr (EI) (2)糖被磷酸化后运入膜内 糖+P-HPr<=>糖-P+HPr (EII)

25 五、四种运送营养物质方式的比较

26 第四节 培养基 培养基是一种人工配制的适合微生物生长繁殖或产生代谢产物用的混合养料，它具备微生物所需的六大营养元素，且其间比例合适。
第四节 培养基 培养基是一种人工配制的适合微生物生长繁殖或产生代谢产物用的混合养料，它具备微生物所需的六大营养元素，且其间比例合适。 一、选用和设计培养基的原则和方法 1、四个原则 (1)目的明确：培养什么微生物，获得什么产物，用途 1）培养哪种微生物： 细菌——肉汤蛋白胨培养基，真菌——马铃薯培养基，霉菌——察氏培养基，放线菌——高氏一号培养基。 2）培养何种营养类型的微生物; 3）培养的目的是为了获得菌体还是代谢产物;

27 4）是作为实验室研究还是大规模生产; 5）是作为种子培养基还是发酵培养基; 6）生产的代谢产物是主流代谢产物还是次生代谢产物。 (2)营养协调：恰当配比，尤其是C/N比（100/0.5-2） 1)确定培养基中各营养要素和比例的重要依据： a.在各微生物细胞中，其不同成分或元素间是有较稳定比例的； b.在异养微生物中，碳源还兼作能源，而能源的需要量是很大的。 2)化能异养菌各营养要素间的比例 a.水分含量最高； b.碳源含量其次；——双功能营养物，需求量大。

28 c.N、P、S、K、Mg的含量依次递减；——与其在细胞组分中的含量一致。
d.生长因子的量最少。 3)C/N比：所谓C/N是指在微生物培养基中所含的碳源中碳原子的摩尔数与氮源中氮原子的摩尔数之比。 (3)物理化学条件适宜 1)pH： a.各大类微生物都有它们合适的生长pH范围； 细菌—— ，放线菌—— ，酵母菌—— ，霉菌——

29 b. 培养基调节能力——pH的内源调节： a)采用磷酸缓冲液的方式： 调节KH2PO4和K2HPO4浓度可获得pH 间的一系列稳定的pH。 b)采用加入CaCO3做“备用碱”的方式。 也可用NaHCO3从而避免CaCO3在培养基中分配不均：

30 2)渗透压 a.概念： 当两种浓度不同的溶液同被一个半透性薄膜隔开时，稀溶液中的水分子会透过此膜到浓溶液中去，直到浓溶液产生的机械压力足以使两边的水分子进出达到平衡为止，这时由浓溶液中的溶质所产生的机械压力即为渗透压。 b.渗透压对微生物的影响 等渗溶液适宜微生物的生长，高渗溶液会使细胞发生质壁分离，而低渗溶液则会使细胞吸水膨胀，甚至破裂。 等渗溶液：0.85%的NaCL和0.1mol/L磷酸盐溶液。

31 3)水活度 a.概念 水活度是指在相同的温度和压力下，体系中溶液的水的蒸汽压与纯水的蒸汽压之比，即： 它表示在天然环境中，微生物可实际利用的自由水或游离水的含量。 b.水活度在实际应用中的意义： 各种微生物生长繁殖范围的aw值在0.998一0.6之间。在食品保藏中，当aw降低时，微生物死亡或脱水，或处于休眠状态，因此低aw环境能抑制微生物生长，延长食品保藏时间。

32 4)氧化还原势Eh： 是度量某氧化还原系统中的还原剂释放电子或氧化剂接受电子趋势的一种指标，其单位是v(伏)或mv(毫伏)。 好氧微生物+0.1v以上； 兼性厌氧+0.1v以上行好氧呼吸， +0.1v以下行发酵； 厌氧微生物+0.1v以下生长。 （4）经济节约 以粗代精、以废代好、以简代繁等。

33 2、四种方法 (1)生态模拟 (2)查阅文献 (3)精心设计 (4)试验比较

34 二、培养基的种类 1、按对培养基成分的了解来分： (1)天然培养基： 指利用动植物或微生物或其提取物制成的培养基。 1)特点：优点是取材方便、营养丰富、种类多样、配制方便；缺点是成分不稳定也不甚清楚，因而在做精细的科学实验时，会引起数据不稳定。 2)应用：只适合配制实验室用的各种基本培养基及大生产中的种子培养基或发酵培养基之用。

35 (2)组合培养基： 又称合成培养基或综合培养基，是一类用多种高纯化学试剂配制成的，各组分（包括微量元素）的量都确切知道的培养基。 1)特点：优点是成分精确、重演性高；缺点是价格较贵、配制较烦。 2)应用：一般仅用于作营养、代谢、生理、生化、遗传、育种、菌种鉴定和生物测定等定量要求较高的研究工作上。 (3)半组合培养基： 指既含有天然成分又含有纯化学试剂的培养基。

36 2、按培养基外观的物理状态来分： (1)固体培养基 外观呈固体状态的培养基称为固体培养基。 1)种类： 固化培养基：由液体培养基加入适量凝固剂而得； 琼脂用作培养基凝固剂的优点：

37 非可逆性固化培养基：凝固后不能再融化的固化培养基；
天然固态培养基：由天然固态基质配制而成； 滤膜：醋酸纤维薄膜等。 2)应用：固体培养基在科学研究和生产实践上具有广阔的用途，例如，它可用于菌种的分离、鉴定，菌落计数，检验杂菌，选种、育种，菌种保藏，抗生素等生物活性物质的生物测定，获取大量真菌抱子，以及用于微生物产品的“土法生产”(一般指用固体培养法进行生产)，等等。 (2)半固体培养基： 在液体培养基中加入少量凝固剂，使培养基呈现出在容器倒置时不致流下，但在剧烈振荡后则能破碎的状态，这种培养基即为半固体培养基。半固体培养基主要用于观察细菌的运动特征、菌种保藏、噬菌体效价测定及各种厌氧菌的培养。

38 3)液体培养基： 指呈液体状态的培养基。在实验室中用于各种生理、代谢和获得大量菌体之用，在生产中，绝大多数发酵培养基都采用液体培养基。 (4)脱水培养基：含有除水以外的一切成分的商品培养基。 3、按培养基的功能来分： (1)种子培养基： 为了在较短时间内获得数量较多的强壮而整齐的种子细胞，而设计的一种培养基，其特点是营养丰富、全面，而氮源、维生素的比例较高。 (2)发酵培养基： 用来合成预定的发酵产物的培养基。碳源含量高。

39 (3)基础培养基： 含有一般微生物生长所需基本营养物质的培养基。 (4)选择性培养基： 根据微生物的特殊营养要求或其对某化学、物理因素的抗性而设计的培养基。其功能是使混合菌群中的劣势菌变成优势菌，从而提高该菌的筛选效率。 加富性选择培养基 ——投其所好 利用分离对象对某一营养物质有一“嗜好”的原理，专门在培养基中加入该营养物，成为一种加富培养基，使该微生物大大增殖，在数量上超过原有占优势的微生物，以达到富集培养的目的。

40 2）抑制性选择培养基——取其所抗 利用分离对象对某种制菌物质的抗性，在混合培养物中加入该抑制物质，经培养后，由于原来占优势的它种微生物的生长受到抑制，而分离对象却可趁机大大增殖，使之在数量上占据优势，从而达到富集培养的目的。 (5)鉴别性培养基： 1)概念：培养基中加入能于某一菌的无色代谢产物发生显色反应的指示剂，从而用肉眼就能使该菌菌落与外形相似的它种菌落相区分的培养基就称鉴别性培养基。

41 2)EMB培养基的成分及作用原理： a.成分：

42 b.原理 其中的伊红和美蓝两种苯胺染料可抑制革兰氏阳性细菌和一些难培养的革兰氏阴性细菌。在低酸度时，这两种染料结合形成沉淀，起着产酸指示剂的作用。因此试样中的多种肠道细菌会在EMB培养基上产生相互易区分的特征菌落，因而易于辨认。尤其是大肠杆菌，因其强烈分解乳搪而产生大量的混合酸，菌体带H+故可染上酸性染料伊红，又因伊红与美蓝结合，所以菌落染上深紫色，从菌落表面的反射光中还可看到绿色金属闪光：

43 微生物细胞的化学组成（以大肠杆菌为例） 元素 干重(%) 碳 50.0 钠 1.0 氢 8.0 钙 0.5 氧 20.0 镁 氮 14.0 氯 磷 3.0 铁 0 .2 硫 其他 0.3 钾

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