液相色谱的方法开发 分离方法.

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1 液相色谱的方法开发 分离方法

2 第一步干什么? 想办法得到各种信息 对色谱柱有足够的了解 充分了解您自己的样品 向同行了解是否做过此类样品，或有否类似样品的分析方法
查文献，如CA(化学文摘) 仪器制造商的文献，如Waters 对色谱柱有足够的了解 掌握分离机理，自己开发方法 充分了解您自己的样品

3 分析时要了解哪方面的情况？ 灵敏度的要求有多高? 样品的本底是否很复杂? 有多少组份要分析? 对分析的精确度、准确度等有多高要求?
是否因是日常检验，而要求方法容易使用?

4 分离时要了解哪方面的情况？ 要分离（即制备）的样品量有多大? 要分离的组份在样品中的含量很高? 还是微量? 是否需要保持生物活性?
对分离产物纯度的要求有多高? 纯度或活性的鉴定如何完成?

5 一般的具体步骤 先用一根短的色谱柱 用相对较高的流速 使用尽可能纯度高的标准品 先用高强度的洗脱液 调节k’ 值改变保留值
调节a值改变选择性 调节柱长度改变柱效及分离速度

6 使用文献方法 色谱柱填料的种类、品牌是否相同? 注意文献方法的流动相 注意色谱柱的规格：内径、柱长 注意梯度条件 了解系统的滞后体积（梯度）
是否损害色谱柱? 如色谱填料品牌不同，需要调整流动相 注意色谱柱的规格：内径、柱长 需要调整流速、进样量 注意梯度条件 了解系统的滞后体积（梯度）

7 色谱方法转换 如果没有与文献或要求相近的色谱柱 转换进样量 转换流速

8 反相色谱的方法开发 开发过程实例 色谱条件∶ 样品： 色谱柱：C18，4mm×30mm
流动相：乙腈/水，不同的溶剂强度，60/40、50/50、40/60，由强渐弱 流速：2ml/min 样品： ① 对羟基苯甲酸甲酯(Methyl Paraben) ② 对羟基苯甲酸丙酯(Propyl Paraben) ③ 对羟基苯甲酸丁酯(Butyl Paraben)

9 改变容量因子 K' 谱图

10 改变选择性∶a 通过改变流动相改变选择性 同样强度的不同溶剂 改变色谱柱

11 离子型化合物的分离方式 使用离子交换柱∶离子交换法 使用反相柱 主要用于“强”阴、阳离子 离子抑制色谱法 离子对色谱法
通过改变流动相的pH值，使样品成中性 离子对色谱法 加入“对离子”，使样品呈中性

12 离子抑制色谱 离子型化合物在反相色谱柱上不保留 改变流动相的pH值，抑制样品离子的电离 适用于弱酸性化合物的分离
使用硅胶基质C18填料 使用条件应在填料基质的范围内 硅胶柱的pH在2-8（较保险值3-7）内

13 常用缓冲液及其pH值

14 离子抑制色谱实例 在乙腈/水及pH=7时， 多数保留时间很短，无 法完全分离。

15 离子抑制色谱的使用范围 如果： 一些酸在pH低于2时还保持离子化 一些碱在pH高于7时还保持离子化 可以有以下的选择 离子交换色谱
使用“离子对色谱法”

16 在高pH值下用离子抑制 色谱柱：D18-613(聚合物基质)，室温 流动相：乙腈/0.01M NH4OH + 0.01M TBA
流 速：1.0ml/min 检 测：UV-240nm 样 品：巴比妥的衍生物 ① 巴比妥 ② 己琐巴比妥 ③ 甲基苯巴比妥 ④ 速可巴比妥

17 离子对色谱法 在反相色谱流动相内加入“离子对”试剂 离子对试剂的类型 与样品中可电离的组份形成“对离子” 在反相色谱柱上分离离子型化合物
PIC A：磷酸季丁铵，适用于弱酸 PIC B：烷基磺酸盐，适用于弱碱 烷基长度不同，形成对离子的能力不同 通常有：B5，B6，B7，B8 PIC D4：磷酸二丁胺，适用于弱碱

18 离子对色谱机理

19 用离子对？还是离子抑制？

20 离子对色谱的应用 抗组胺及减充血剂药物的分析

21 使用五烷基磺酸盐 Packing: Bondapak C18 Column: 4 mm ID x 30cm
Solvent: Methanol/H2O with 0.005M PENTANE Sulfonic Acid & 1% HOAc (50/50) Flow Rate: 2.0 ml/min Detector: UV, 254 nm, 0.1 AUFS 1. Maleic Acid 2. Phenylephrine 3. Phenylpropanol- amine 4. Naphazoline 5. Phenacetin 6. Pyrilamine

22 使用六烷基磺酸盐 1. Maleic Acid Packing: Bondapak C18 2. Phenylephrine-HCl
3. Phenylpropanolamine-HCl 4. Naphazoline-HCl 5. Phenacetin 6. Pyrilamine Maleate Packing: Bondapak C18 Column: mm ID x 30cm Solvent: Methanol/Water with 0.005M HEXANE Sulfonic Acid & 1% HOAc (50/50) Flow Rate: 2.0 ml/min Detector: UV, 254 nm, 0.1 AUFS

23 使用七烷基磺酸盐 1. Maleic Acid 2. Phenylephrine Packing: Bondapak C18
3. Phenylpropanolamine 4. Naphazoline 5. Phenacetin 6. Pyrilamine Packing: Bondapak C18 Column: mm ID x 30cm Solvent: Methanol/Water with 0.005M HEPTANE Sulfonic Acid & 1% HOAc (50/50) Flow Rate: 2.0 ml/min Detector: UV, 254 nm, 0.1 AUFS

24 样品浓度对分析的影响

25 离子对色谱分析水溶性维生素

26 用不同的离子对试剂

27 离子对色谱 - 水溶性维生素

28 方法开发的其他因素 以上因素均影响分离度 流速对柱效的影响 样品的进样量(浓度)对柱效的影响 样品的进样体积对柱效的影响
不同内径的色谱柱有自己的最佳流速 样品的进样量(浓度)对柱效的影响 样品的进样体积对柱效的影响 溶剂粘度对柱效的影响 以上因素均影响分离度

29 结论 充分用已知样品结构确定以哪种方法开始 观察流动相条件改变时色谱峰的移动 改变参数时要合理，每次只改动其中一个变量！
普通反相? 离子抑制? 离子对? 还是其他 观察流动相条件改变时色谱峰的移动 根据变化的方向及大小决定下一步干什么 改变参数时要合理，每次只改动其中一个变量！ 色谱柱的改变影响最大