动物产品中微生物检测技术 王 娟 中国动物卫生与流行病学中心 2009-3-11.

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1 动物产品中微生物检测技术 王 娟 中国动物卫生与流行病学中心

2 内容 沙门氏菌 金黄色葡萄球菌 O157︰H7 单核增生性李斯特氏菌 存在问题

3 沙门氏菌

4 沙门氏菌（Salmonella） DANIEL ELMER SALMON, ( ) 美国兽医微生物和病理学家。是美国授予的第一位兽医学博士。1884年任美国农业部畜牧局 首任局长。他首次从病猪中分离出猪霍乱沙门氏菌。在医学微生物中通用的沙门菌一词，就是为纪念他而以 他的名字命名的。

5 沙门菌（Salmonella） 沙门菌属（Salmonella）是一大群寄生于人类和动物肠道内生化反应和抗原构造相似的革兰氏阴性杆菌统称为沙门杆菌。

6 沙门氏菌生物学性状 大小0.6～1.0×2～3um，无芽胞，一般有鞭毛(鸡沙门菌除外)，无荚膜，多数有菌毛，革兰氏阴性杆菌，需氧或兼性厌氧，最适生长温度为35～37℃，最适pH值为6.8～7.8。

7 沙门菌生物学性状 不分解乳糖（亚利桑那菌除外）。分解葡萄糖产酸产气（伤寒沙门菌产酸不产气）。多数产生H2S，不产生靛基质，不液化明胶，不分解尿素，不产生乙酰甲基甲醇，多数能利用枸橼酸盐，能还原硝酸盐为亚硝酸盐，在氰化钾培养基上不生长。

8 国内外沙门菌检测方法（传统方法） 国家标准 GB/T 4789.4-2003 行业标准
FDA （Food & Drug Administration） AOAC (Association of Official Analytical Chemists) FSIS （FOOD SAFETY AND INSPECTION SERVICE） ISO 加拿大官方食品微生物分析方法

9 TSI（排除A/A H2S－结果 ），靛基质，尿素，KCN，赖氨酸
中华人民共和国国家标准 微生物学检验 沙门氏菌检验 GB/T 冻肉、蛋品、乳品及其他加工食品 鲜肉、鲜蛋、鲜乳或其他未经加工的食品 前增菌法 25g＋BPW225mL 36 ℃ ± 1 ℃ 一般4h，干蛋品18h～24h 直接增菌法 25g＋灭菌生理盐水25mL 检样匀液25mL ＋MM （或TTB）100mL 检样匀液25mL ＋SC100mL 10mL＋MM （或TTB）100mL 10mL＋SC100mL 42 ℃ 18h～24h 36 ℃ ± 1 ℃ 18h～24h 36 ℃ ± 1 ℃ 18h～24h BS DHL（或HE、WS、SS） 36 ℃ ± 1 ℃ 40h～48h 36 ℃ ± 1 ℃ 18h～24h TSI（排除A/A H2S－结果 ），靛基质，尿素，KCN，赖氨酸 H2S＋ 靛＋ 尿－ KCN－ 赖＋ H2S－ 靛－ 尿－ KCN－ 赖＋/－ 非如左述的各种反应结果 甘露醇 山梨醇 ONPG － 沙门氏菌血清学试验 沙门氏菌血清学试验 沙门氏菌 非沙门氏菌

10 出口食品沙门氏菌属（包括亚利桑那菌）检验方法
检验检疫行业标准 SN 0170－92 出口食品沙门氏菌属（包括亚利桑那菌）检验方法 肉类、蛋品 前增菌 直接选择性增菌 缓冲胨水（BPW） 亚硒酸盐胱氨酸（SC） 四硫磺酸盐煌绿（TTB） 37 ℃ 4h or 20～24h 37 ℃ 24± 2h 四硫磺酸盐煌绿（TTB） 亚硒酸盐胱氨酸（SC） 42 ℃ 20 ± 2h BS & DHL (亚利桑那菌琼脂) 37 ℃ 24～48h TSI & 赖氨酸脱羧酶 TSI & 尿素酶 37 ℃ 24～48h 37 ℃ 24～48h 生化试验 结果判定 血清学试验（“O”抗原，“Vi”抗原）

11 第五章 沙门氏菌属 43±0.2℃ or 35±2.0℃ 24±2h & 细菌学分析手册（FDA/BAM） 样品25g
第五章 沙门氏菌属 样品25g 225mL 乳糖肉汤（LB）or 胰酪胨大豆肉汤（ TSB）or 煌绿溶液 （BG）or 通用前增菌肉汤（UPB）or营养肉汤（NB）or 再造脱脂奶粉 or 四硫酸盐煌绿（TT） pH6.8± ±2 h 35℃ RV TT 43±0.2℃ or 35±2.0℃ 24±2h 24±2h 42±0.2℃ BS & XLD & HE 24±2h 35℃ TSI & LIA LIA+ LIA－ TSI K/A LIA－ TSI A/A & 尿素酶，H抗原（多价H抗血清或Spicer- Edwards flagellar (H) test ），赖氨酸脱羧酶， 酚红卫矛醇肉汤，色氨酸肉汤（KCN， 丙二酸盐，吲哚），O抗原 酚红乳糖肉汤，酚红蔗糖肉汤，MR－VP,西蒙氏柠檬酸盐 5种商业生化鉴定系统（API 20E, Enterotube II, Enterobacteriaceae II,MICRO-ID, or Vitek GNI） &O抗原&H抗原 非沙门菌 非沙门菌 沙门菌

12 肉、禽和蛋品中沙门菌的分离和鉴定 USDA/FSIS MLG 4.02 样品 BPW or BPW（含结晶紫） 35±1℃ 20-24h
＋10mL TT 0.1 ± 0.02mL ＋10mL mRV 42± 0.5℃ 22~24h 42± 0.5℃ 22~24h BGS & DMLIA or XLT4 35± 1℃ 18~24h & 48h 此方法不鉴定伤寒沙门氏菌 TSI & LIA 血清学试验 商业生化试剂盒或自动鉴定系统 or 传统生化鉴定（AOAC Official Method or "Edwards and Ewing's Identification of Enterobacteriaceae"） 报告结果

13 肉制品中沙门菌的分离和鉴定 FDA&USDA/FSIS
乳糖肉汤 缓冲蛋白胨水 TTB肉汤 RV肉汤 TTB肉汤 RV肉汤 XLT4 BS XLD HE 2倍改良LIA BGS 生化筛选 （LIA,TSI） 鉴定及确证试验 葡萄糖 脲酶试验 卫矛醇 动力试验 吲哚 MR-VP测试 氰化钾 粉红酒石酸盐琼脂 乳糖 水杨苷 赖氨酸脱羧酶 西蒙氏枸橼酸盐 丙二酸 蔗糖 血清学试验

14 AOAC沙门菌检测方法 AOAC Official Method 967.25 Salmonella in Foods
Preparation of Culture Media and Reagents AOAC Official Method Salmonella in Processed Foods Detection AOAC Official Method Identification AOAC Official Method Serological Tests

15 H抗原，LIA，酚红卫矛醇肉汤，色氨酸肉汤 酚红乳糖肉汤，酚红蔗糖肉汤，MR－VP,西蒙氏柠檬酸盐
AOAC －967.28 食品中的沙门菌检测方法 处理样品 35℃ 24±2h 1mL+10mLSC 1mL+10mLTT 35℃ 24±2h XLD & HE & BS 35℃ 24±2h（BS 24h&48h） TSI & LIA 35℃ 24±2h 不纯培养物 纯培养物 For dried active yeast,substitute LST for SC. 少数沙门氏菌在XLD上呈黄色，有或没有黑色中心。 MAC or XLD or HE 尿素酶＋ 尿素酶－ 纯培养物 吲哚＋ & H血清－ H抗原，LIA，酚红卫矛醇肉汤，色氨酸肉汤 （KCN，丙二酸盐，吲哚），O抗原 非沙门菌 非沙门菌 KCN＋ & LIA－ 非沙门菌 补充生化试验 沙门菌 酚红乳糖肉汤，酚红蔗糖肉汤，MR－VP,西蒙氏柠檬酸盐 非沙门菌

16 酚红煌绿琼脂 （亮绿琼脂） & 第二种选择性平板 TSI，尿素酶，赖氨酸脱羧酶，ONPG，VP，吲哚
ISO 6579:1993(E) 微生物－沙门菌检测的通用方法 25g样品 225mL BPW 35℃ or 37℃ 16~20 h 0.1mL+10mL RV 10mL+100mL SC 42℃ 24h 35℃ or 37℃ 24h&48h 酚红煌绿琼脂 （亮绿琼脂） & 第二种选择性平板 35℃ or 37℃ 20~24h 典型菌落（pink red） 无典型菌落再培养18～24h 每个平板选5个菌落 营养琼脂纯化可疑菌落 35℃ or 37℃ 18~24h TSI，尿素酶，赖氨酸脱羧酶，ONPG，VP，吲哚 血清学试验 （O抗原，Vi抗原，H抗原） 报告结果 送参考实验室

17 食品中沙门菌的分离和鉴定 加拿大HPB方法 MFHPB-20 25g样品 营养肉汤or缓冲胨水or煌绿 水溶液 or胰蛋白酶大豆肉汤
1mL+9mL SC 1mL+9mL TBG 35 ℃ 24±2h 42.5 ℃ 24±2h BS & BGS 35 ℃ 24±2h & 48 ±2h 纯培养物 不纯培养物 MAC 纯培养物 TSI &LIA&尿素琼脂 商业生化试剂盒或自动鉴定系统 O多价血清， H多价血清 报告

18 判断标准 国标、无公害食品标准、绿色食品标准：沙门氏菌不得检出（未检出/25g）。 美国标准中规定：
沙门氏菌最大检出数——小公牛/小母牛：1/82；母牛/公牛：2/58； 碎牛肉5/53；嫩鸡12/51；猪6/55；碎火鸡肉29/53；碎鸡肉26/53。

19 沙门氏菌的危害 据美国疾病控制中心报告，沙门氏菌是美国食物中毒致死的主要原因，每年全国大约报告40000例沙门氏菌感染病例，据不完全统计，每年大约有1000人死于急性沙门氏菌感染。日本厚生省统计，在发生的670起细菌性食物中毒中，沙门氏菌占62起，排在第三位，中毒人数为2045人。有些国家，沙门氏菌食物中毒占细菌性食物中毒的40% - 60%以上。我国以沙门氏菌引起的细菌性食物中毒占首位。世界上最大的一起沙门氏菌食物中毒事件发生在1953年，瑞典人由于食用了被鼠伤寒杆菌污染的猪肉引起的中毒，中毒7717人，死亡90人。1972年青海市同仁县因圣保罗沙门氏菌污染牛肉引起的中毒事件，中毒1041人。沙门氏菌食物污染给国家造成巨大的经济损失，如1990年在向欧洲出口的生肉中检测到肠炎沙门氏菌，全部销毁的直接经济损失达3000万元。

20 OIE法典 2007年召开的陆生动物标准法典委员会会议上制定了《沙门氏菌的控制和预防指南 》
许多国家已经采取了沙门氏菌控制措施，并取得了良好的社会效益和经济效益。

21 我国的沙门氏菌防控措施 生鲜畜禽肉中的沙门氏菌污染状况 养殖场中健康动物带菌情况 养殖场环境中的沙门氏菌状况

22 动物产品中沙门氏菌污染

23 养殖场环境污染 空气、水源、饲料、土壤

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25 金黄色葡萄球菌

26 生物学特性 ---菌体形态及培养特征 革兰氏阳性球菌，直径为0.8-1.0微米，镜检时呈单个、成对、四联或不规则的簇群； 无芽孢，不运动；
兼性厌氧菌，在好氧条件下生长最好； 可在15%氯化钠和40%胆汁中生长

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28 分布 在自然界中广泛存在，空气、水、灰尘及人和动物的排泄物中都可找到。
作为人和动物的常见病原菌，其主要存在于人和动物的鼻腔、咽喉、头发上，50%以上健康人的皮肤上都有金黄色葡萄球菌存在。因而，食品受其污染的机会很多。 传播媒介为被该菌污染的食品，主要为淀粉类(如剩饭、米面、粥等)、牛乳及乳制品，以及鱼、肉、蛋类等。被污染的食物在室温20℃-22℃放置5小时以上时，病菌大量繁殖，并产生肠毒素。

29 致病性 葡萄球菌性食物中毒是葡萄球菌肠毒素所引起的疾病，可引发不同程度的急性胃肠炎症状，恶心、呕吐最为突出而且普遍，腹痛、腹泻次之。
当金黄色葡萄球菌污染了含淀粉及水分较多的食品，如牛奶和奶制品、肉、蛋等，在温度条件适宜时，经8-10小时即可相当数量的肠毒素。

30 报告结果 微生物学检验 金黄色葡萄球菌菌检验 定性检测 25g样品+ 225ml 生理盐水
中华人民共和国国家标准 微生物学检验 金黄色葡萄球菌菌检验 GB/T 定性检测 25g样品+ 225ml 生理盐水 5mL样品匀液（1:10）+ 50mL胰酪胨大豆肉汤 36± 1℃ 24hr 血平板 BP平板 36± 1℃ 24hr 镜 检 36± 1℃ 24hr 血浆凝固酶实验 36± 1℃ 6hr 报告结果

31 选三个连续梯度，每个梯度分别取1mL接种之至表面干燥的BP平板（如0.4mL，0.3mL，0.3mL）
中华人民共和国国家标准 微生物学检验 金黄色葡萄球菌菌检验 GB/T 定量检测 （平板法） 25g样品+ 225ml 生理盐水 梯度稀释 选三个连续梯度，每个梯度分别取1mL接种之至表面干燥的BP平板（如0.4mL，0.3mL，0.3mL） 36± 1℃ 48hr 适用于检测金黄色 葡萄球菌数不小于 10/g（mL）的食品 平板计数（分别记录每种类型的菌落数） 每种类型至少选取一个菌落 镜 检 营养肉汤 36± 1℃ 24hr 血浆凝固酶实验 36± 1℃ 6hr 报告结果 金葡菌数/g(mL)

32 B-P平板

33 控制措施 防止带菌人群对各种食物的污染：定期对生产加工人员进行健康检查，患局部化脓性感染（如疥疮、手指化脓等）、上呼吸道感染（如鼻窦炎、化脓性肺炎、口腔疾病等）的人员要暂时停止其工作或调换岗位。 对肉制品加工厂，患局部化脓感染的禽、畜尸体应除去病变部位，经高温或其他适当方式处理后进行加工生产。

34 防止带菌人群对各种食物的污染：定期对生产加工人员进行健康检查，患局部化脓性感染（如疥疮、手指化脓等）、上呼吸道感染（如鼻窦炎、化脓性肺炎、口腔疾病等）的人员要暂时停止其工作或调换岗位。
防止金黄色葡萄球菌对奶及其制品的污染：如牛奶厂要定期检查奶牛的乳房，不能挤用患化脓性乳腺炎的牛奶；奶挤出后，要迅速冷至-10℃以下，以防毒素生成、细菌繁殖。奶制品要以消毒牛奶为原料，注意低温保存。

35 大肠杆菌O157︰H7

36 EHEC O157︰H7生物学特性 EHEC O157:H7属于肠杆菌科埃希氏菌属。革兰氏染色阴性，无芽胞，有鞭毛，动力试验呈阳性。其鞭毛抗原可丢失，动力试验阴性。。 EHEC O157:H7具有较强的耐酸性，pH ，37℃可耐受5小时； 耐低温，能在冰箱内长期生存；在自然界的水中可存活数周至数月； 不耐热，75℃ 1分钟即被灭活；对氯敏感，被1mg/L的余氯浓度杀灭。 EHEC 的最适生长温度为33-42℃，37℃繁殖迅速，44-45℃生长不良，45.5℃停止生长。 不能分解4-甲基伞形酮-β-D-葡萄糖醛酸苷（MUG）产生荧光，即MUG阴性。

37 报告结果 检验检疫行业标准 进出口肉及肉中肠出血性大肠杆菌O157︰H7检验方法 25g样品+ 225ml EC肉汤 41℃ 24h
SN/T 进出口肉及肉中肠出血性大肠杆菌O157︰H7检验方法 25g样品+ 225ml EC肉汤 41℃ 24h 接种SMAC 37℃ 24h 接种MUG\LIST发酵管培养基 37℃ 24h 生化反应鉴定 血清凝集鉴定 或 EHEC 乳胶凝集试验 报告结果

38 EHEC O157 ︰H7在显色培养基上

39 O157︰H7的危害 有很强的耐酸和耐低温能力，可以产生大量的Vero毒素。1982年美国首次报道了由大肠杆菌O157:H7引起的出血性肠炎暴发。日本在1996年和2001年发生的大肠杆菌 O157:H7的暴发流行，引起出血性腹泻，感染人数较多，并造成12人死亡，引起了全世界的关注。此外，美国、加拿大、瑞典、澳大利亚、英国的苏格兰和威尔士等国家和地区也相继报道了大肠杆菌O157:H7的散发性感染和暴发流行。日本、加拿大及瑞士等国已将大肠杆菌O157:H7列为必须报告的传染病，予以高度重视。我国于1988年首次分离到大肠杆菌O157:H7，从已有的流行病调查资料来看，我国亦存在大肠杆菌O157:H7的散发病例，但尚未有暴发流行的报道。

40 我国动物产品中O157︰H7的污染状况 对市售生鲜猪肉和禽肉检测发现： 猪肉中均未发现O157︰H7； 有少部分禽肉污染O157︰H7。

41 单核增生李斯特氏菌

42 单核细胞增生李斯特氏菌：是李斯特氏菌的其中一种。世界卫生组织（WHO）关于单核细胞增生李斯特氏菌食品中毒报告中指出， 5%~10%的乳及乳制品均被该菌污染。由于该菌在4℃冰箱保存的食品中也能生长繁殖，使其危害性更进一步增大。根据记载，第一例确定由食品引起的李斯特菌感染是1981年发生在加拿大的一次较大规模的污染事件。在那次事件中，有41例被感染，7例致死。其后，在美国、瑞士、英国、法国又相继发生了李斯特菌的污染事件。牵涉到的食品有牛奶、乳酪、猪肉、生乳制品等。1983年6月在美国的马萨诸塞州发生了由于饮用含有李斯特氏菌的巴氏消毒奶引起的食物中毒事件。李斯特菌的感染最近呈上升趋势。

43 生物学特性 ---菌体形态及染色特征 革兰氏阳性；
小的、类似球形杆菌，0.4~0.5×0.5~2µm，在有些培养基中稍弯，两端钝圆，单个、成短链、细胞彼此连成V形，或成群的细胞沿长轴方向平行排列，在较老的或生长不良的培养物中，可能形成丝状； 20-25℃以4根周生鞭毛运动，在37℃只有较少的鞭毛或1根鞭毛； 无芽孢、无荚膜。

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45 流行病学 据报道，有1-10%的人类肠道中存在单核增生李斯特氏菌，4-8%的水产品、5-10%的奶及其产品、30%以上的肉制品及15%以上的家禽均被该菌污染。 相关食品：鲜奶、巴氏消毒奶、奶酪（尤其是软奶酪）、冰激凌、生的蔬菜、发酵过的生肉制作的香肠、生的和加工过的禽肉、各种生的肉类、生的和烟熏的鱼肉。约有85-90%的病例是由被污染的食品引起的。

46 1996年至1999年，因单核增生李斯特氏菌回收的食品种类（来源：USDA及FDA报告）

47 过氧化氢酶试验、革兰氏染色、溶血试验、糖发酵试验（木糖、鼠李糖）
单核增生李斯特氏菌检测流程 25g样品+225ml BLEB基础（加入丙酮酸钠） 30℃ 4hr 加入萘啶酮酸、盐酸吖锭黄、放线菌酮 30℃ 24hr和48hr 划线接种OXA平板 科玛嘉李氏菌显色培养基 35℃ 24hr-48hr 35℃ 24hr TSA-YE分纯 35℃ 24-48hr 过氧化氢酶试验、革兰氏染色、溶血试验、糖发酵试验（木糖、鼠李糖） 35℃ 18-24hr API Listeria 报告结果

48 各官方方法比较 方法名称 一次增菌 二次增菌 分离 鉴定 快速方法 SN 0184 -1993 加工 MBP 30℃，18-24h EB
MMA/ OXA （35℃，24-48h） 蓝色菌落；典型运动；过氧化氢酶；革兰氏染色；溶血试验；尿素酶试验；硝酸盐还原；MR-VP；三糖铁；糖发酵；动力试验；协同溶血*；血清学检验*；小鼠毒力试验* 无 未加工 （30℃，24/48h） GB/T （30±1℃，48h） MMA （30±1℃，24-48h） 蓝色菌落；三糖铁；动力试验；染色镜检（革兰氏染色、典型运动）；生化特性（溶血反应、硝酸盐还原、尿素酶、MR-VP、糖发酵）；小鼠毒力试验；协同溶血 LB1 （30±1℃，24h） LB2 FDA BLEB+Phy （30℃，4h） BLEB+Phy+三种抑菌剂 （30℃，20/44h） OXA/PALOM/MOX/LPM+七叶灵+Fe3+ 推荐BCM /ALOA / RapidL'mono /CHROMagar Listeria 蓝色菌落*；典型运动或动力试验；过氧化氢酶；革兰氏染色；溶血试验；硝酸盐还原*；糖发酵；协同溶血；血清学检验；小鼠毒力试验* 筛选、鉴定都可以使用快速方法 USDA UVM （30±2℃，22±2h） FB （35±2℃，26-48±2h） MOX 初步鉴定：纯菌菌落形态；典型运动； 生化鉴定：MICRO-ID® Listeria或Api® Listeria或BAM等方法中的传统生化反应；协同溶血 遗传鉴定：核糖体RNA检测；PFGE* 筛选用的快速方法必须经过确认后才可使用 鉴定中用到MICRO-ID® 、Api®、GenProbe AccuProbe®、GENE-TRAK®

49 各官方方法比较 方法名称 一次增菌 二次增菌 分离 鉴定 快速方法 CFIA MFHPB-30 LEB（UVM） （30℃，24/48h）
MFB （35℃，24-48h） OXA+LPM或MOX或PALCOM 典型运动或动力试验；溶血试验；甘露醇；木糖；鼠李糖；快速鉴定试剂盒*；过氧化氢酶*；革兰氏染色*；协同溶血*；血清学试验* 作为鉴定的可选步骤，允许使用快速方法，如Vitek或API、Micro ID Listeria、Listera Accuprobe™ ISO :1996（E） 半量Fraser肉汤 （30℃，24±2h） Fraser肉汤 （35或37℃，48±2h） OXA和PALCOM （30、35或37℃，24-48h，） PALCOM平板微需氧或好氧条件培养 蓝色菌落*；过氧化氢酶；革兰氏染色；动力试验或典型运动*；溶血试验；糖发酵试验；协同溶血；送参考实验室（血清或噬菌体分型） 无 NMKL No.136 2nd 1999 LBⅠ （30.0±1.0℃，24±3h） LBⅡ（30.0±1.0℃，24±3h）或Fraser肉汤（37.0±1.0℃，48±4h） （37.0±1.0℃，24±3/48±4h，好氧或微需氧） 溶血试验；过氧化氢酶；革兰氏染色；典型运动 动力试验；糖发酵试验；送参考实验室（血清、噬菌体、DNA或酶分型） 允许使用经过确认的商业化生产的单核增生李斯特氏菌菌株鉴定试验，但没列明具体试剂盒名称

50 OXA平板 单核增生李斯特氏菌 ATCC 19117 48h，35℃培养

51 血平板 单核增生李斯特氏菌 ATCC 19117 36h，35℃培养

52 面临的问题 样品的保存、运输 鸡蛋的检测 鸡蛋的保质期

53 谢谢！