第三章 核 酸 技 术.

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1 第三章 核 酸 技 术

2 核酸的分离和纯化 核酸电泳 染色体DNA电泳 DNA限制酶切反应和限制酶谱绘制 DNA的连接 PCR技术 分子杂交技术 核酸序列的测定

3 第一节 核酸的分离和纯化

4 一、一般程序 1、供体的核酸分离 收集(菌体)细胞 细胞破碎 分离总DNA 分离细胞器 分离总RNA
供体细胞培养 收集(菌体)细胞 细胞破碎 分离总DNA 分离细胞器 分离总RNA 分离细胞器DNA RNA poly(A)RNA 特异性RNA 染色体DNA(组建基因组文库)

5 2、载体DNA分离 3、DNA片段的分离 载体DNA 感染或转染细胞（病毒型） 转化细菌细胞（质粒型） 分离病毒颗粒 培养转化细胞、收集菌体
感染或转染细胞（病毒型） 转化细菌细胞（质粒型） 分离病毒颗粒 培养转化细胞、收集菌体 病毒载体DNA分离与纯化 破碎细胞 质粒DNA分离与纯化 3、DNA片段的分离 DNA 限制酶切 凝胶电泳分离 特定DNA片段的回收

6 二、细胞裂解 4、质量评估 利用某些细胞壁裂解酶使细胞变为原生质体，然后加去垢剂使原生质体裂解。 2）光密度值测定 3）限制酶切分析
1） 凝胶电泳 2）光密度值测定 3）限制酶切分析 二、细胞裂解 1. 酶法： 利用某些细胞壁裂解酶使细胞变为原生质体，然后加去垢剂使原生质体裂解。 1) 细菌：溶菌酶 2) 酵母：蜗牛酶、Novozyme234、glusulase、zymolase 等 3) 丝状真菌：Novozyme234、溶壁酶、纤维素酶 4) 植物细胞：纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶 酶法裂解时要注意细胞的生长条件和生长时间，反应时尽可能满足酶的最佳反应条件。

7 三、DNA的分离与纯化 2. 机械法 1) 压力剪切法：French压力机，酵母细胞，细菌（芽孢和G+球菌除外）
2. 机械法 1) 压力剪切法：French压力机，酵母细胞，细菌（芽孢和G+球菌除外） 2)射击破碎法：Braun破碎机，搅切器（blender），混合器（mixer）， mm玻璃球 3)固体研磨法：将待破碎细胞与玻璃球（0.1~0.45mm）同时致冷，在未融熔前用研杵磨成粉末 4)反复冻融法 三、DNA的分离与纯化 1、供体DNA的分离与纯化 要求：尽可能地保持其高分子量，无其它污染物。 1)    基因组大小：

8 染色体 细菌 ~4200kb 酵母 ,000 kb 果蝇 x105 kb 人 x106 kb 植物 x105~1x108 kb 天花病毒 kb 痘病毒 kb 质体 几~100以上kb 线粒体 藻类 线状 kb 酵母 环状 ~78 kb 植物 环状 ~150 kb 动物(扁虫到人)环状 15~18 kb 锥虫 网状 kb(幼体) 短膜虫 网状 ,000 kb(幼体) (Kinetoplast） 叶绿体 双子叶植物 （菠菜）~154kb（豌豆） 单子叶植物 （玉米）~182kb（浮萍） 藻类 （裸藻）~191kb（衣藻）

9 1)    DNA分离纯化过程 破碎细胞 + DNA抽提液(EDTA、去污剂、还原剂) ℃温育 20’ 冰浴冷却 离心去细胞碎片 苯酚抽提法① CsCl密度梯度离心② 1) 苯酚抽提法 上清液 缓冲液用水饱和苯酚抽提2~3次 上层液相用氯仿抽至界面无蛋白变性物 上层液相用两倍体积冷乙醇沉淀 沉淀物用70%冷乙醇洗涤,干燥 溶于缓冲液 加入RNAase处理除去RNA 苯酚氯仿抽提 沉淀干燥

10 2) CsCl密度梯度离心 上清液 加入固体CsCl与EtBr溶液 室温下超速离心(45,000rpm）16小时 穿孔取出DNA（320nm） 异丙醇抽提溴乙锭 缓冲液透析除去残余CsCl 两倍体积冷乙醇沉淀DNA 离心、洗涤、干燥 *两种方法比较： CsCl法操作步骤少，分离DNA分子量大，耗财多，且需超速离心机。 苯酚法耗时少，不需昂贵仪器，但操作步骤多，易使DNA分子断裂。 若 小心操作，所获DNA亦符合要求。 ** 上述两种分离方法都包含了下述四个分离步骤 ⅰ.可溶与不可溶物分离：高速离心除去细胞碎片，保留上清液。 ⅱ. 使蛋白质分离：苯酚抽提或超速离心 ⅲ. 使RNA分离：RNase处理或超速离心 ⅳ. 使DNA与其它可溶物分离

11 2. 载体DNA的分离与纯化 3) 细胞器DNA的分离
植物组织 用核分离缓冲液匀浆 过滤 滤液离心(2000g, 10’,4℃) 核缓冲液使核裂解(含0.5%Triton X-100) 抽提DNA 植物组织 细胞器缓冲液匀浆 离心(100g, 10’,4℃)除去细胞核 离心(1800g, 10’,4℃)分离叶绿体 离心(10,000g, 10’,4℃)分离线粒体 DNase除去细胞器外DNA 加入EDTA使DNase失活 纯化细胞器 细胞器裂解 提取DNA 2. 载体DNA的分离与纯化 1) 质粒载体DNA的分离 关键：如何使质粒DNA与宿主染色体DNA分开 原理：质粒DNA比染色体DNA 小得多，在DNA抽提过程中，染色体DNA断裂成小片段(线状)，质粒DNA仍保持超螺旋构型

12 方法： ⅰ. 超速离心：利用两种DNA分子的大小和空间构型 ⅱ. 变性法：在变性条件下使染色体DNA变为单链，而质粒DNA仍保持环状结构，当变性条件发生迅速变化时，前者仍不能复性，而后者又可回复到天然构型。 变性条件可采用加热煮沸法或碱变性法 上述方法亦可用于ss环状病毒DNA RF型的分离, 质粒DNA的氯霉素扩增使用并不广泛（菌株和载体） 2) 噬菌体载体DNA的分离 纯净病毒颗粒 病毒载体DNA M13mp载体可采用质粒DNA的分离方法

13 二、RNA的分离与纯化 1. 制备RNA的关键—防止内外源RNase的作用 1)  RNase的特点：抗酸抗碱,具很广pH作用范围; 抗高温严寒(0~65℃均具活性）；抗变性剂 2)  解决办法：外源RNase—高温，焦磷酸二乙酯(DEPC)处理所有溶液（Tris·HCl除外）和器皿，操作者带手套 内源RNase—高温抽提，强蛋白质变性剂，RNase抑制剂，蛋白酶K等 2. 总RNA的制备 根据所用蛋白质变性剂种类不一样分为以下三种制备方法： 1）热苯酚抽提法 2）胍盐法：异硫氰酸胍和硫氰酸胍 3）LiCl/尿素法

14 其中以胍盐法最好，对于从那些RNase含量很高的组织（胰脏）中提取RNA特别有效，可使RNase迅速变性，制备的RNA有较高翻译活性。在RNA制备中，细胞破碎与蛋白质变性是同步进行的。
1)    多聚核糖体的分离 ① 超速离心法（30-40万g，离心2-3 h） ② 镁盐沉淀法（0.1 M Mg++） ③ 分级分离法—分离特异性多聚核糖体     

15     i. 结合与游离核糖体的分离，这种方法可避免溶酶体破裂。
ii. 核糖体大小分级分离，利用连续密度梯度分离特大和特小的 多聚核糖体 iii.核糖体免疫沉淀法 *直接免疫沉淀法 新生肽链+抗体 蔗糖密度梯度离心 **间接免疫沉淀法 新生肽链+抗体+抗-抗体（二抗） 不可 溶复合物 离心分离

16 ***免疫亲和层析法 新生肽链-抗体复合物 不溶性交联抗原基
质亲和层析柱吸附 洗脱 免疫沉淀法优点：可分离到含量仅为1%的mRNA，但必须使用高纯度的抗体，不能发生交叉反应和污染核酸酶 2)    多聚核糖体RNA的分离 纯化多聚核糖体+SDS 蔗糖密度梯度离心或蛋白酶K-苯酚抽提 4. RNA的分级分离 1) 分子量大小分级分离 i. 蔗糖密度梯度离心 ii. 凝胶电泳 2) 核酸序列分级分离 i.  分子杂交法：适用于同源性很高的RNA的分离 DNA分子变性 结合到NCF RNA·DNA杂交 洗涤 洗膜 乙醇沉淀

17 ii.  亲和层析法： 低聚dT纤维素: 用于poly(A)较长的mRNA； 多聚U琼脂糖: 用于poly(A)较短的mRNA（<20A） RNA进样吸附 洗涤 洗脱 收集260nm处吸收峰样品 乙醇沉淀 iii.  无poly(A) mRNA的分离 纯化多聚核糖体 核糖体亚基+mRNP 离心 mRNP 蛋白酶K mRNA 低聚（dT）纤维素层析 洗出液 乙醇沉淀（无多聚A mRNA） 5.  RNA的质量评估方法 1) 光密度值测定法 A260/A280=2.0 2) 凝胶电泳 3) 体外蛋白质翻译

18 全部多聚核糖体 细胞裂解物 胍盐法 总RNA 分子杂交法— 特异RNA分子 热苯酚法 凝胶电泳 围RNA 大小分级分离 大小范 蔗糖密度
大小分级分离 大小范 蔗糖密度 梯度离心 一定 LiCl/ 核酸序列 尿素法 离心 分级分离 亲和层析法— poly（A）RNA分子 高速离心法 全部多聚核糖体 上清液 镁盐沉淀法 蔗糖密度梯度离心—结合与 游离多聚核糖体 分级分离法 蔗糖连续密度— 一定范围大小核糖体 多聚核糖体RNA 免疫沉淀法—— 特异性多聚核糖体

19 第二节 核 酸 电 泳

20 二、DNA电泳 1. 种类 2. 用途 3. 凝胶电泳的一般程序
1.  种类 1) 按凝胶材料分: 聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖凝胶电泳(普通琼脂糖和低熔点琼脂糖) 2) 按电泳装置分: 水平式/琼脂糖凝胶; 竖式/聚丙烯酰胺凝胶 3) 两种方法比较：分离效果和分离范围; 操作难易 2.  用途 琼脂糖凝胶用于DNA和RNA的常规分析；聚丙烯酰胺凝胶常用于小分子核酸分析。 3.  凝胶电泳的一般程序 制胶 点样 电泳 染色 观察 二、DNA电泳 1.  DNA分子种类 1) 线状DNA—单链与双链，ss-DNA电泳时要注意局部区域形成ds-DNA，造成迁移距离不确定 2) 环状DNA—单链（如M13mp）和双链（质粒DNA）       3) 线状ds-DNA电泳—使用频率最高的一种电泳

21 这类DNA分子在电泳过程中迁移的距离受以下几个因素的影响：
i.  分子量 的大小: 迁移距离与分子量的常用对数成反比 ii. 凝胶浓度: 浓度越高，移动距离越短，适合分离低分子量DNA浓度越低，移动距离越长，适合分离高分子量DNA iii.电压: 低电压时，迁移率与电压成正比；电压增高时，不同大小DNA片段迁移率增大是不同的。 iv.碱基组成与温度: 不受影响,温度高可导致DNA带变形或解链。

22 4) 环状ds-DNA电泳: 常用于质粒DNA的初步鉴定 5) 线状ss-DNA电泳
核酸定序凝胶(染料指示剂)：为避免局部区域产生二级结构，可采用各种变性措施，如煮沸样品，提高电泳温度，凝胶中加入变性剂（尿素、甲醛、甲胺等）

23 三. RNA凝胶电泳 方法：不同的RNA电泳方法是依据使RNA分子变性所采取的方法。这些方法不仅要使RNA分子在点样时是一级结构，而且在整个电泳过程中也保持一级结构。 1.  乙二醛/二甲基亚砜法 原理：乙二醛可以与核酸、核苷酸及碱基发生反应，特别是鸟苷形成一个稳定的附加环，从而阻止GC碱基的互补作用发生 步骤：RNA+10mM羟甲基醛和50% DMSO混合 ℃、1 h变性 点样 电泳 染色 观察 2. 羟甲基汞法 原理：羟甲基汞可与RNA分子的嘌呤或嘧啶碱基发生反应，反应部位是在可形成氢键的亚氨基处。 步骤：RNA+10mM羟甲基醛 点样在含4mM羟甲基醛的琼脂糖凝胶上 电泳 染色观察

24 3.  甲醛法 步骤：RNA+2.2M甲醛+50%甲胺 点样在含2.2M甲醛琼脂糖凝胶上 MOPS缓冲液电泳 染色观察 其它变性剂，如尿素、甲胺等也可用于RNA电泳. 4.  三种方法的比较 第一种方法安全，但由于反应是不可逆的，由此回收的RNA样品用于体外翻译效果不好。第二、三种方法的反应可逆，回收RNA样品可用于体外翻译反应，但操作必须小心，因两种变性剂有毒。 五、蛋白质电泳 方法：变性与非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，前者常称之为SDS-PAGE。差别：有无变性剂 用途：非变性凝胶可用于蛋白质的分离纯化过程中，可直接用于酶促反应（颜色变化） SDS-PAGE可用于蛋白质分子量、亚基组成的测定。mRNA翻译产物，基因表达产物测定等。

25 五、核酸片段的分离与回收 1.方法 —用于DNA、RNA以及蛋白质的回收 1) 电洗脱法: 利用电泳方法将凝胶中的特定核酸分子到其它介质中；
1) 电洗脱法: 利用电泳方法将凝胶中的特定核酸分子到其它介质中； 2) 滤纸法 —核酸凝胶染色 长波紫外光确定位置 在分离带前方切一口子并插入滤纸条(其背面覆盖透析袋膜) 电泳至DNA带全部进入滤纸条 洗脱DNA 纯化、沉淀 3) 透析袋法—切下含DNA带琼脂块 放入透析袋，封口 放入电泳槽 电泳2~3小时至全部DNA离开凝胶块 反向电泳1分钟 取出DNA液 纯化、沉淀 4) 冻融法 5) 酶解法

26 回收DNA方法 待回收DNA 切口 DNA 切口 凝胶块 滤纸法 透析袋 待回收DNA 透析袋法 V-型槽 电洗脱槽法

27 2. 影响回收率的因素 3. 回收DNA片段质量 1）DNA分子大小—回收率与分子量大小呈负相关；
凝胶材料的质量，如琼脂糖中的硫酸盐 沉淀剂若改用精胺，它可有效地去除PEG、核苷酸、盐、聚丙烯酰胺及蛋白质等。

28 第三节         染色体DNA电泳

29 一、 DNA分子在凝胶电泳中的移动 1、常规电泳
将DNA分子置于凝胶中进行电泳，DNA移动距离与分子量有关。分子量小的移动快；反之则慢。大于20kb的DNA大分子，其移动距离与分子量无关。因为这些DNA分子要通过胶孔时必须发生变形，并沿分子长轴运动经过胶孔，它们都以相同速度前进，分辨率也就消失了。 2、脉冲场凝胶电泳(pulse-field gel electrophoresis，PFGE) PFG工作假说 1)    DNA松弛时间：大分子DNA改变形状和重新定向所需的时间。这个时间与DNA分子量呈正相关（Tr） 2)    DNA移动时间：DNA分子向前移动的时间（Tm） 3)    电场脉冲时间：其电场方向所持续的时间（Tp）

30 二．脉冲场凝胶电泳的种类 1．正交场脉冲凝胶电泳（OFAGE）
分子量大的DNA分子所需的松弛时间长，分子量小的则短。由于脉冲时间是一个人为的固定值，那么用于向前移动的时间则随分子量大小而变化。分子量大的用于向前运动的时间少，移动距离就短，分子量小的用于向前运动的时间多，移动距离就长。这就是使不同大小分子量DNA分离的假说。 Tp小 = Tm小+ Tr小 Tp大 = Tm大+ Tr大 因Tp小 = Tp大 ， Tr小< Tp小 ，故 Tm小 > Tm大 ，所以， S小> S大   显然，要使一个DNA样品中不同大小的DNA分子分离，脉冲时间应选在最大DNA分子所需的上限。 二．脉冲场凝胶电泳的种类 1．正交场脉冲凝胶电泳（OFAGE） 利用两个或多个交变电场，使 kb的DNA分子发生分离，其电极排列可以是双向非均匀，单向非均匀等。

31 脉冲场凝胶电泳原理图 北 南 脉冲场电泳 常规电泳 两组电极，排列不均匀; 一组电极，电场方向不变，电极排列均匀，
脉冲场电泳 常规电泳 两组电极，排列不均匀; 一组电极，电场方向不变，电极排列均匀， 定时改变电场方向，DNA分子的净 DNA移动方向与电场方向相同。整个电泳 移动方向与两电场呈45o，在电泳过 过程保持电压稳定。常规方法制备DNA 程中，电压有时可随时间的增加而样 品增加， 制备DNA样品与常规方法 不同

32 2. 场倒置凝胶电泳（FIGE） 利用常规电泳槽进行电泳，但电场方向则是周期性地发生倒置，其正向和反向的脉冲时间长度之比为3或其它比值。该法可使 Kb或以上的DNA分子发生分离。 为了克服同移动现象产生（即不同大小DNA分子一起移动），可以采用转换时间递增法（swiching-interval ramps）, 即由电泳开始时的短脉冲时间逐渐递增到电泳结束时的长脉冲时间。如开始时为60：20，结束时可为180：60。 上述两种方法也可联合使用，使一些很难分开的大分子DNA分离。 3. CHEF(Contour-Clamped Homogeneous Electric Fields) 动态调控闭合均一电场电泳

33 CHEF(动态调控闭合均一电场电泳) 场倒置电泳 120

34 各种脉冲场凝胶电泳技术的比较 方法 染色体带 最大带 最小带 动态调节 直道 均匀电场 液体样品 机械转换
方法 染色体带 最大带 最小带 动态调节 直道 均匀电场 液体样品 机械转换 CHEF kb bp 是 是 是 是 不 OFAGE kb bp 不 不 不 是 不 TAFE kb bp 不 是 不 不 不 FIGE kb bp 不 是 是 是 不 RFGE ? bp 不 是 是 不 是

35 三．影响染色体DNA电泳的主要因素 四．染色体DNA样品的制备 1．固体块法 2．电泳槽电极的构型 3．电压：它与脉冲时间成反比
1．染色体的结构 2．电泳槽电极的构型 3．电压：它与脉冲时间成反比 4．脉冲时间：经过实验选择适合于某种生物染色体DNA完 全分离的最佳脉冲时间 5．其它因素：温度，离子强度等 四．染色体DNA样品的制备 染色体DNA电泳的关键之一是获得完整的DNA分子，其制备方法有： 1．固体块法 细胞培养，收集，洗涤，细胞悬液 与细胞壁裂解酶液和低熔点琼脂糖凝胶混合 倒平板 复盖裂解酶缓冲液 细胞壁裂解过夜 除去缓冲液 加入去污剂和蛋白酶K 反应过夜 换0.5MEDTA，4℃保存

36 2．微球法 制备细胞悬液 与石蜡油和低熔点琼脂糖凝胶迅速混合，形成小球 冰浴迅速冷却 离心，洗涤 加入原生质体形成液，37℃反应至细胞壁裂解 加入裂解液 ℃ 1 h 离心，小球保存于0.5M EDTA，4℃ 3．加样 切一小块样品凝胶块或吸取适量微球，置于电泳用凝胶块的样品孔中，用少许低熔点琼脂糖凝胶使样品与整块凝胶为一体，每一样品孔应含0.1-5μg DNA样品 4. 限制酶切 加样前取适量样品，置于EP管中，加限制酶缓冲液和限制酶进行酶切

37 五．染色体DNA电泳的用途 4. 疾病的诊断 1. 测定染色体数目：特别适合于低等真核生物
1）酵母细胞经X-射线照射，染色体发生断裂，可得弥散型。 但让其修复后，又可形成带，但有的发生了重排，导致 带型变化 2）非洲锥虫：变异表面糖蛋白基因的表达 4.  疾病的诊断 引起某种皮肤病的原生动物Leishmania, 具有其特征性的染色体。PFG便可用于诊断。