第十五章 混合斑的检验.

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1 第十五章 混合斑的检验

2 基本概念：混合斑是指两名或两名以上个体的血液或体液、分泌液混合形成的斑痕
构成分类：不同个体同一种体液或分泌液混合而成----最常见的是混合血痕 不同个体的不同体液或分泌液混合而成----最常见的是精液阴道分泌液混合 检测方法：经典方法----直接检测混合斑的遗传标记，然后与案件相关个体进行比对 现代方法----分离混合斑中成分，分别进行遗传标记的检测 检验程序：确证检材是否是混合斑------然后检测遗传标记

3 一、精液与阴道液混合斑 1 混合斑的确证 精 斑：细胞学方法-----精子的检出 免疫学方法-----精斑确证最好试剂----抗P30血清
精 斑：细胞学方法-----精子的检出 免疫学方法-----精斑确证最好试剂----抗P30血清 生化学方法-----LDH-X 阴道斑：细胞学方法 阴道上皮细胞 HE染色：大而扁平、形态不规则、 细胞浆红染 嗜碘试验：斑痕沉淀涂片，干燥后+2滴Lugo’s碘 液---2~3min镜检呈红褐色或深黄褐色， （口腔上皮细胞不染色） 生化学方法 阴道肽酶（VP）是一种催化肽键水解的酶 仅存在女性生殖道分泌液中，与年龄、性活动、 月经周期无关。 方法：淀粉凝胶电泳 L-缬氨酸-L-亮氨酸 注意：阳性检出率只有64%，故阴性结果不能否定 阴道液存在检出期限为7个月。

4 2 混合斑中精液成分的个人识别 ABO血型检测 对比推断 中和试验、解离试验、ELISA法等
对照种类：嫌疑人、被害人及被害人丈夫的血液和唾液  结果分析： 注意事项：混合成分的比例影响不同种类血型物质的检出 分泌型的强弱，可以提供有用的信息 混合 斑 被害 人 精液可能 的血型 嫌疑人 ABSe se ASe ABSe、BSe BSe ABSe、ASe OSe ABSe、Ase、Bse、OSe

5 特异成分 精子ABO血型检验----混合凝集 原理：抗原与抗体发生特异性结合后，再加入相应的红细胞时，抗体又同红细胞结合，结果形成检材抗原-抗体-红细胞三者结合 试剂：抗体效价：256倍 指示红细胞：5% 精浆ABO血型检验----α2-精浆糖蛋白分子中的ABH抗原 糖链----ABH特异性抗原，用A、B、O红细胞和AB型人血清吸收 蛋白----有器官特异性抗原 解离试验 Y +混合斑的浸出液 ELISA夹心法

6 血清型、酶型 对比推断：血清型---- Gm、Km 酶 型----PGM1、Fu

7 关键---获得纯净的精子DNA-----差异裂解或二步抽提法
常染色体： 关键---获得纯净的精子DNA-----差异裂解或二步抽提法 原理：精子细胞的表面蛋白含有大量的二硫键，可以抵抗去垢剂SDS核蛋白酶K的消化，而其他组织的细胞膜则可以被这两种物质消化。 方法：第一步：检材+1%SDS+100ug/ml蛋白酶K---37度2~3h 500r/min离心15min、去上清，精子留在沉淀物中 第二步：+40Mm/L DTT+1%SDS+100ug/ml蛋白酶K---- 注意：消化条件选择----主要是第一步消化时间 消化不完全----当阴道上皮细胞过多，不能使两者彻底分离 过渡消化----可能消化一部分精子细胞，导致精子DNA减少 *** 实际操作前，应进行涂片检查，根据精子和阴道上皮 细胞的比例，对消化时间、温度、试剂的浓度等进行 适当的调整 提取方法选择----采用有机溶剂的方法比较好 酚-氯仿能够去掉混合斑中的精浆蛋白，阴道分泌液、细 菌污染严重的的,用有机溶剂提取后,用5%clekex100提1次。

8 优点 1不用分离精液成分和阴道液成分，两者1/100~2000时仍可正确检出精子DNA，避免了操作过程中精子DNA的损失，提高了检出阳性率
Y染色体： 优点 1不用分离精液成分和阴道液成分，两者1/100~2000时仍可正确检出精子DNA，避免了操作过程中精子DNA的损失，提高了检出阳性率 2 精子细胞比体细胞更稳定，保存25年的阴道式子Y-STR获得成功 3可以推测犯罪嫌疑人的数目----轮奸案 注意提取多个部位的检材或一个检材的 不同部位，分别提取DNA 注意 可以排除，但不可以肯定

9 3 混合斑中阴道液成分的个人识别 ABO血 型 同精斑的ABO血型检测 酶、血清型 PGM1、Gm、Km、GLOI DNA分 析 DNA提取-----二步抽提法的第一次消化后离心的上清液 遗传标记------进行常染色体STR分析

10 二、多个个体血液混合斑鉴定 1．ABO血 型 正反试验不一致 2．酶、血清型 发现3个或3个以上等位基因 3．DNA分 析 影响混合斑DNA检验结果分析的因素 影 子 带---引物延伸过程中TaqDNA酶发生滑脱所致，特别见于复合扩增 非特异性带---各等位基因的DNA片段变性后复性时，随机形成的杂合二聚体。 遗传异常---临床上的三倍体综合征 操作不当---相临泳道的样品渗漏 差异扩增---