军团菌的分离培养与鉴定 福建省疾病预防控制中心 原灵 2009年6月3日.

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1 军团菌的分离培养与鉴定 福建省疾病预防控制中心 原灵 2009年6月3日

2 军团菌 革兰阴性杆菌,浅红色的短杆菌，直径0.3～0.5μm，长约1.2～5μm或更长，菌体一端有鞭毛.
在含L-半胱氨酸和焦磷酸铁的BCYE琼脂培养基上生长，通常需要在37℃ 5%CO2培养箱培养2-10天。 生长形成的菌落一般呈白色，也可能会从紫色变为蓝色，或是灰绿色。 初步在BCYE琼脂培养基上生长的菌落为刻花玻璃样，具有多型性.

3 军团菌

4 军团菌 军团菌电镜图片

5 军团菌科、属、种、血清型 军团菌科 (Legionellaceae ）
Legionella / Fluoribacter bozemanii / Tatlockia micdadei 军团菌属：16s rRNA分析表明，在蛋白细菌系γ亚群中，军团菌科只有一个军团菌亚群。与引起Q热病的coxiella burneti(贝氏克斯体）亲缘关系最近，二者具有同样的细胞内生活方式，可以利用共同的基因感染宿主细胞。 军团菌种：现已发现50个种（species），70多个血清型（serogroups)，至少有20个种可引起人感染。

6 军团菌种 发现时间 种名 Legionella pneumophila Legionella maceachernii
1979 Legionella maceachernii 1985 Legionella geestiana 1993 Legionella bozemanae 1980 Legionella parisiensis Legionella londiniensis Legionella dumoffii Legionella rubrilucens Legionella nautarum Legionella gormanii Legionella santicrucis Legionella quateirensis Legionella micdadei Legionella spiritensis Legionella worsleiensis Legionella pittsburghensis Legionella steigerwaltii Legionella lansingensis 1994 Legionella jordanis 1982 Legionella israelensis 1986 Legionella lytica 1996 Legionella longbeachae Legionella birminghamensis 1988 Legionella waltersii Legionella oakridgensis 1983 Legionella brunensis 1989 Legionella taurinensis 1999 Legionella wadsworthii Legionella cincinnatiensis Legionella beliardensis 2001 Legionella feeleii 1984 Legionella moravica Legionella drozanskii Legionella sainthelensi Legionella quinlivanii 1990 Legionella fallonii Legionella anisa Legionella tucsonensis Legionella gresilensis Legionella cherrii Legionella adelaidensis 1991 Legionella rowbothamii Legionella erythra Legionella fairfieldensis Legionella busanensis 2003 Legionella hackeliae Legionella gratiana Legionella drancourtii 2004 Legionella jamestowniensis Legionella shakespearei 1992

7 No. associated with disease
Species No. of serogroups No. associated with disease 1. L. pneumophila 15 2. L. bozemanii 2 3. L. dumoffii 1 4. L. micdadei 5. L. longbeachae 6. L. jordanis 7. L. wadsworthii 8. L. hackeliae 9. L. feeleii 10. L. maceachernii 11. L. birminghamensis 12. L. cincinnatiensis 13. L. gormanii 14. L. sainthelensi 15. L. tucsonensis 16. L. anisa 17. L. lansingensis 18. L. erythra 19. L. parisiensis 20. L. oakridgensis 20个种的军团菌可引起人疾病

8 军团菌操作生物安全性 应用的试剂须符合有毒物质操作要求和相关规定。 生物安全Ⅱ级实验室，最好在安全柜中操作。 操作人员培训。 菌种保存。

9 《可感染人类的高致病性病原微生物菌（毒）种或样本运输管理规定》
病原菌名称 危害程度分类 实验活动所需生物安全实验室级别 运输包装分类 学名 中文名 大量活菌操作 动物感染实验 样本 检测 非感染性材料实验 A/B UN 编号 Legionella pneumophila 嗜肺军团菌 第三类 BSL-2 ABSL-2 BSL-1 B UN 3373

10 样本的采集和运输 （一）标本的种类 （二）标本的运输和相关生物安全要求

11 标本的种类 环境水标本：空调冷却塔水、冷凝水,温泉水,淋浴水, 加湿器水； 病人组织标本:如痰,支气管灌洗液,胸水,血液等标本。
1983年新疆从一瘫患羔羊后肢中分离到军团菌。

12 标本的运输和相关生物安全要求 在周围环境温度下运送水样标本,不必冷冻,但要防止受热和阳光,标本要尽可能快或最好在两天内送到实验室,室温下(21+3℃)贮藏在实验室或其他地方。 对于临床标本，最好立即做预期实验，如不能马上进行，应放在-20℃冻存备用。

13 2 、 《公共场所集中空调通风系统 卫生规范》中的集中空调通风系统冷却水、冷凝水中嗜肺军团菌的检验方法见附录A。
水样标本中军团菌的分离方法 检测依据: 、《ISO-11731水质军团菌检测》 2 、 《公共场所集中空调通风系统 卫生规范》中的集中空调通风系统冷却水、冷凝水中嗜肺军团菌的检验方法见附录A。 适用于各种环境标本军团菌检测 ，包括： 饮用水、工业用水、天然水以及一些如沉积物、沉淀物、软泥等物质。

14 军团菌水质检测概括 采样 浓缩 培养 分离 鉴定

15 军团菌检测所需准备基本试剂 培养基（GVPC，BCYE,BCYE-CYS) 试剂 (生化试剂、甲醛的盐溶液）
酸缓冲液（0.2mol/L KCL-HCL)，碱缓冲液（0.03mol/L KOH） 血清学试剂

16 标本浓缩所需准备仪器设备 离心力能够达到（6000±100）g,要有安全盖。 转速至少能够达到（200±5）r/min。 过滤 离心机
滤器及漏斗，过滤装置需能够承受高压。 正压膜蠕动过滤泵，能够控制流速。 尼龙或聚碳酸酯滤膜 硅胶管 离心机 离心力能够达到（6000±100）g,要有安全盖。 漩涡振荡器 转速至少能够达到（200±5）r/min。

17 培养检测所需准备材料 直径大约为90mm或100mm的无菌培养皿 培养箱，CO2能够恒温保持在（36±1）℃。
水浴箱，能够保持在（50±1）℃ 显微镜或荧光显微镜。

18 样品采样准备材料 玻璃、聚乙烯或类似的容器瓶：灭菌处理。水样一般采集为250-500ml，收集在容器瓶中。
如果所用的容器，如聚乙烯瓶，不能高压，可用流动的热水（不低于70℃）或蒸汽进行巴斯德氏消毒，时间不低于5分钟。 小的无菌容器瓶：可用来收集淤泥、沉淀物或沉积物。 广口的容器：用来收集淤泥等，要有螺丝盖。 灭菌棉拭子。 一般建议用塑料包装的容器

19 采样后样品处理 方法与步骤 样品处理 1. 沉淀或离心：如有杂质可静置沉淀或1000r/min离心1min去除。
2. 过滤：将经沉淀或离心的样品通过孔径0.22～0.45µm滤膜过滤，取下滤膜置于15ml灭菌水中，充分洗脱，备用。 3.热处理：取1ml洗脱样品置50℃水浴加热30min。 4.酸处理：取5ml洗脱样品，调pH至2.2，轻轻摇匀，放置5min。

20 《ISO-11731水质军团菌检测》浓缩标本酸处理
酸缓冲液：仔细地量取17.4ml浓盐酸加到1L蒸馏水中，配成0.2mol/L的盐酸缓冲液；称14.9gKCl加到1L蒸馏水中，配成0.2mol/L的KCl溶液。将3.9ml 0.2mol/L的盐酸溶液和25ml 0.2mol/L的KCl溶液混合，用1mol/L的KOH溶液调pH至2.2±0.2，装在一个带塞的玻璃瓶内，于室温暗处贮存，不要超过1个月。 将1～10ml样品（浓缩或未浓缩的）放入带有螺旋帽的容器中，再将其6000g离心10min或3000g离心30min。 用无菌吸管吸取上清，使体积变为原来的一半。用振荡器或用力混合，使沉淀重悬。 加入酸缓冲液使体积和原来相同,并轻晃摇匀静置5min。

21 样品浓缩 离心 过滤 接种 酸处理 热处理

22 水样的正压膜过滤法 安放滤膜； 过滤； 取膜； 洗膜。

23 水样的离心 将200ml左右样品倒入容积为300～500ml的无菌离心瓶中；
6000g离心10min，或者3000g离心30min，离心温度在15～25℃之间； 无菌操作去除上清； 用5～20ml溶液或无菌蒸馏水将沉淀重悬。

24 水样浓缩物的贮存 最好对样品立刻进行分析； 标本于（6±2）℃储藏最多不超过14天。
对于军团菌来说，如果储藏于0～6℃，这种损失是最明显的。而且，温度在20或20℃以上时，异养生物的生长速度就会变快。

25 浓缩标本热处理 向无菌容器中放入（1±0.5）ml（浓缩或未浓缩）的标本。 在（50±1）℃水浴中放置（30±2）min。

26 军团菌培养基 Muller-Hinton琼脂 第一次分离出嗜肺军团菌使用的培养基
活性炭酵母抽提物琼脂，活性炭替代培了淀粉以去除培养基的毒性，并且氨基酸也逐渐被酵母抽提物替代 CYE琼脂 BCYE琼脂 CYE琼脂加入α-酮戊二酸 GVPC琼脂 BCYE琼脂中含有选择性抗生素

27 军团菌培养基

28 BCYE－α培养基 酵母浸出物（细菌级） 10.0g 琼脂 12.0g 活性炭 2.0g α-酮戊二酸 1.0g
ACES (2-乙酰基-2-氨基乙烷磺酸) g KOH（颗粒型） g L-半胱氨酸盐酸盐 g 焦磷酸铁 g 蒸馏水 补充至1000ml

29 L-半胱氨酸和焦磷酸铁溶液 称取0.6g L-半胱氨酸盐酸盐和0.4g焦磷酸铁分别溶解于10ml蒸馏水中，制备新鲜的L-半胱氨酸盐酸盐溶液和焦磷酸铁溶液。 分别通过0.22μm的滤膜过滤除菌。贮存于无菌容器中，-20℃左右储存不得超过三个月。

30 BCYE-α培养基配制 将颗粒状ACES放入500ml蒸馏水中溶解。量取480ml蒸馏水，加入全部2.8gKOH颗粒，轻摇至溶解。将以上两种溶液混合，制成ACES缓冲液,用0.1mol/L KOH和0.1mol/L HCl溶液调节PH至 ACES缓冲液中加入活性炭、酵母浸出物、α-酮戊二酸。摇匀。 加入琼脂，微波稍化后，121℃高压15min。 高压后，室温或水浴中冷却至50℃左右。 在无菌条件下加入L-半胱氨酸溶液和焦磷酸铁溶液。 按20ml量倒入直径为90～100mm的平板中，培养基的最终pH值大约为6.9左右。 待平板中的湿气干燥后，4℃左右储存于闭光的密闭容器中，最多可储存4周。

31 GVPC选择性培养基 BCYE-α琼脂培养基中添加下列抗生素 万古霉素 0.001g/L 多粘菌素B 80000iu/L

32 BCYE-Cys培养基 为不含L-半胱氨酸的酵母浸出物、炭粉培养基。按照配制BCYE－α培养基的方法配制，不加L-半胱氨酸。

33 标本 肺组织、支气管灌洗液、血液、痰、胸水、胸腔引流物 水源 血清 处理与制备 水样处理与制备 血清学检测方法： *间接荧光抗体染色法 *试管凝集试验 *微量凝集试验（参考） *DOT-ELISA法 *间接血凝试验（参考） *ELISA法 接种军团菌BCYE培养基 接种军团菌选择性GVPC培养基 37℃，5%CO2，培养3-14天 挑可疑菌落革兰氏染色涂片镜检 37℃,5%CO2,培养3-14天 革兰氏染色阴性杆菌 革兰氏染色阳性杆菌 纯培养 弃去 确认试验 血清玻片凝集试验 PCR检测 生化试验

34 选择培养基的接种 一个GVPC培养基平板上可以接种0.1～0.5ml(浓缩或未浓缩) 未经处理的样品。
用无菌的涂抹器将液体均匀的涂抹在培养基表面。 用同样的方法尽可能快地将经过热处理的0.1～0.5ml标本接种在另外一块GVPC培养基平板上。 再用同样的方法尽可能快地将经过酸处理的0.1～0.5ml标本接种到第三块GVPC培养基平板上。

35 500ml水样 过滤浓缩法 将500ml水样于0.22um滤膜过滤然后放于5ml无菌水中超声波振动3分钟=浓缩样本 或 高速离心浓缩法 将200ml水样置于离心机6000g离心10分钟，15-25℃ =浓缩样本 直接涂布法 于GVPC（2个平板）上分别涂布0.2ml原液用PBS缓冲液0.01mol/L（PH7.2）稀释1：10的样本 酸处理法 2ml浓缩液+2ml酸缓冲液（PH2.0）摇匀5±0.5分钟 热处理法 2ml浓缩液于50±1℃水浴30±1分钟 于GVPC平板上涂布0.1ml浓缩液，用PBS缓冲液稀释1：10的样本 涂布：0.2ml于GVPC平板 孵育、平板观察及确认

36 接种标本培养 接种过的培养基静置直至接种物被完全吸收，然后将平板倒置，在（36±1）℃培养7-10天。
为了保证培养箱内的空气的湿度，可以在培养箱内放置一个盛水的碟子。在每次观察培养物时，向碟子内注满新鲜的水（根据需要）。 在含 % CO2的环境下培养有利于军团菌的生长。

37 孵育 6个GVPC平板/每份样本 37℃，5%CO2，培养3-10天 菌落验证：从每一个平皿上挑取2个可疑菌落，接种血平板
及接种BCYE和L－半光氨酸缺失的BCYE琼脂平板，35~37℃培养 2天，凡在BCYE琼脂平板上生长,而在L－半光氨酸缺失的BCYE 琼脂平板及血平板不生长的则为军团菌菌落。

38 平板的检查 观察结果：在3-10天的培养期间内，每2～4天至少观察3次，因为军团菌生长缓慢，易被其它菌掩盖。

39 军团菌菌落特点（1） 军团军菌落通常呈灰白色，但也能呈蓝色、灰绿色、深褐色或深红色。 一般表面光滑湿润，边缘完整，并显示典型的毛玻璃样外观。
在紫外灯下，某些种的菌落（博杰曼军团菌、高曼军团菌、杜莫夫军团菌、安绥军团菌、奇锐军团菌、斯泰戈瓦尔特军团菌、格瑞梯纳军团菌、图森军团菌、巴黎军团菌）能自动发出白色的耀眼荧光；某些种的军团菌也能发出红光。

40 军团菌菌落特点（2） 嗜肺军团菌的菌落呈暗淡的绿色，并常伴有浅黄色。 为了避免军团菌被杀死，平板暴露于紫外灯下不能超过规定时间。
值得注意的是，新发现的某些种的军团菌所具有的特征可能会和上述特征有所区别。

41 军团菌菌落特点

42 可疑军团菌菌落的进一步鉴定 BCYE或其他培养基上传代培养 革兰染色镜检 生化鉴定 PCR检测军团菌特异性基因片段
免疫荧光的方法确定军团菌的种类

43 BCYE或其他培养基上传代培养（1） 至少从每块GVPC平板上挑选出两个典型的军团菌菌落，在BCYE和BCYE-Cys培养基上传代培养，传代培养要在两种培养基上同时进行。 在（36±1）℃至少培养两天。 凡是在BCYE培养基上生长而在BCYE-Cys培养基上不生长的菌落即可初步认定为军团菌。

44 BCYE或其他培养基上传代培养（2） 营养琼脂或血琼脂培养基可以代替BCYE-Cys培养基。如果在这三种培养基上都不生长，原来选择性培养基上的可疑军团菌菌落应该继续传代培养。 橡树岭军团菌和幽灵湖军团菌在初次分离培养时需要L-半胱氨酸和铁离子，但随后在L-半胱氨酸缺失时生长微弱。

45 BCYE培养基上传代培养

46 军团菌是革兰染色阴性，浅红色的短杆菌，直径0.3～0.5μm，长约1.2～5μm或更长，菌体一端有鞭毛，长时间培养后鞭毛可能变成长丝状。
革兰染色镜检 军团菌是革兰染色阴性，浅红色的短杆菌，直径0.3～0.5μm，长约1.2～5μm或更长，菌体一端有鞭毛，长时间培养后鞭毛可能变成长丝状。 短杆状 长丝状

47 军团菌生化鉴定 军团菌生化特性 生化试验 结果 触酶 －/弱+ 氧化酶 -/+ 硝酸盐还原 - 尿素酶 明胶液化 + 水解马尿酸 淀粉水解

48 阴性：培养基不变色 阳性：培养基由黄色变为红色
尿素酶试验 阴性：培养基不变色 阳性：培养基由黄色变为红色

49 硝酸盐还原试验 阴性：无红色出现 阳性：呈现红色 进行试验时必须有未接种的培养基管作为阴性对照。α-萘胺具有致 癌性、故使用时应加注意。

50 明胶液化试验 将待试菌培养物穿刺接种于明胶高层约2/3深度。于36±1 ℃ %CO2培养2-3天后将培养基置于4℃ 30分钟，取出观察。 阴性：凝固 阳性：不凝固

51 马尿酸水解试验 将待鉴定菌株，于0.4mL马尿酸钠溶液中，制成浓厚菌悬液，于36±1℃水浴培养2h后，沿管壁加入3.5％水合印三酮试剂，形成两层，如果产生蓝紫色至深紫色，为阳性反应。 阳性 阴性

52 氧化酶试验 阴性 阳性

53 取细菌至载玻片上涂抹，加1-2滴3%过氧化氢水溶液。 若会迅速冒出气泡，则表示此细菌含有触酶，属于阳性反应。
触酶试验 取细菌至载玻片上涂抹，加1-2滴3%过氧化氢水溶液。 若会迅速冒出气泡，则表示此细菌含有触酶，属于阳性反应。

54 阳性反应：（淀粉被分解）琼脂培养基呈深蓝色、菌落或培 养物周围出现无色透明环 阴性反应：菌落周围无透明环
淀粉酶水解试验 阳性反应：（淀粉被分解）琼脂培养基呈深蓝色、菌落或培 养物周围出现无色透明环 阴性反应：菌落周围无透明环

55 确定军团菌的种型 Oxoid 的乳胶试剂盒可以鉴定出： 嗜肺军团菌血清1型; 嗜肺军团菌血清2-14混合型；
L. longbeachae1和2型 ，L. bozemanii1和2型，L. dumoffii，L. gormanii，L. jordanis，L. micdadei， L. anisa混合型。

56 确定军团菌的种型-1 在进行鉴定试验前，要保证在BCYE培养基上生长的菌落是经过形态学检查的纯菌。 属的鉴定，16sRNA。

57 嗜肺军团菌的确定 应进行生化培养与血清学实验确定嗜肺军团菌。有条件的可做嗜肺军团菌特异的PCR检测。
生化培养：氧化酶（－/弱+），硝酸盐还原－，尿素酶－，明胶液化＋，水解马尿酸,淀粉酶水解弱+ 血清学实验：用嗜肺军团菌诊断血清进行分型。 PCR：mip,dnaJ

58 军团菌血清鉴定 日本生研所Lp1-6,Lb,Lg,Lm,Ll

59 结果表述 为了计算原始水样或沉积物中菌落形成数（CFU/ml），从三块GVPC平板培养基中挑选出已确定军团菌生长最多的平板。根据浓缩倍数推算出原始水样中的细菌数。 计算三个GVPC平板培养基上菌落生长的平均数是不适宜的，因为这是不能累加的。

60 检验报告 实验报告应包括以下信息 国际标准的参考
鉴定该标本的全部必需的细节，包括采样部位、采样时的操作、样品性质、水系统或植物的种类、采样点的类别。 被检测标本的体积和数量 采样日期 样品收集日期 实验室接收日期 实验室检测日期 分析过程中所观察到的任何情况都可能影响最后的结果。

61 菌株保存 （一）短期保存 将军团菌接种在BCYE斜面培养基上，可以在4℃ 保存数周。 （二）长期保存
如要长期保存军团菌，最好用冻干保存法或低温 冷冻保存法。而冻干保存法因为在4 ℃ 或 –20 ℃保 存时间更长，且运输过程中不受影响，因此是最好的 保存方法。

62 低温冷冻保存法 1、将军团菌接种在BCYE平板上， 36±1℃，2.5%-5% CO2培养箱或烛缸中培养，确定没有污染。
2、将已灭菌的含有ACES、L-半胱氨酸和15%-20%甘油的保存液分装至2ml的螺帽冻存管中，每管1ml。 3、用灭菌棉签从BCYE平板上刮取适量细菌。放入以上装有保存液的冻存管中。注意，使用的冻存管必须能耐受低温。 4、将冻存管放入-70 ℃冰箱保存。也可以放于-20℃冰箱，但是菌株存活率可能受影响。

63 谢 谢