药物的致癌毒性作用 药理教研室 胡庆华.

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1 药物的致癌毒性作用 药理教研室 胡庆华

2 恶性肿瘤 严重威胁人类健康的常见病多发病 目前肿瘤发病率不断上升
全世界每年新发生肿瘤约900万人，死亡约700万人。我国每年新发生肿瘤约160万人，死亡约130万人。 发病年龄年轻化 在许多国家已成为仅次于心血管疾病的第二大死亡原因

3 第一节 化学致癌物的分类 有多种分类方法，例如： 根据致癌物的来源：内源性和外源性致癌物 人工合成或自然产生：人工合成致癌物和自然致癌物
第一节 化学致癌物的分类 有多种分类方法，例如： 根据致癌物的来源：内源性和外源性致癌物 人工合成或自然产生：人工合成致癌物和自然致癌物 致癌作用的靶器官：肝脏致癌物、肾脏致癌物等 能否引起人类肿瘤：人类致癌物和动物致癌物

4 人类致癌物 为了评价化学物质对人类的致癌性，世界卫生组织下属的国际癌症研究所( Intenational Agency for Research on Cancer，IARC ) 定期组织专家对已发表的致癌实验资料和人类流行病学研究结果进行综合分析，提出综合评价，将致癌因素分为四类。

5 肯定的人类致癌物（或混合物和接触环境，以下同）：
第一类 肯定的人类致癌物（或混合物和接触环境，以下同）： 有足够的流行病学证据支持接触此种化学物质与癌症发生有因果关系。

6 第二类，分为A、B两组 A组 对人很可能是致癌物： B组 对人可能是致癌物：
有一定的流行病学证据表明接触此种化学物质可以致癌，不管动物实验资料如何。 B组 对人可能是致癌物： 流行病学资料不够充分或者缺乏，但动物实验结果充分证明此种化学物质具有致癌性。

7 第三类 对人的致癌性尚不能确定的化学物： 对人类很可能不致癌的化学物 缺乏人类的资料，动物致癌性资料也有限。 第四类
对人及动物的致癌性证据不充分，或根本没有资料可以利用。

8 IARC 1997年确定的74种肯定的人类致癌物中，除11种为生物和物理因素外，其他63种为化学因素。

9 工业化学物质 （22种）： ① 有机物： 4-氨基联苯 苯 联苯胺 N，N-双 ( 2-氯乙基 )-2萘胺
双氯甲醚和氯甲甲醚 ( 工业品 ) 1，4-丁二醇二甲磺酸脂 ( 马利兰 ) 1，4-二甲磺酰丁烷

10 工业化学物质 （22种）： ① 有机物： 1-(2-氯乙基)-3-(4-甲环乙基)-1-亚硝基脲 环氧乙烷 芥子气( 硫芥) 乙-萘胺
氯乙烯 2，3，7，8-四氯二苯二恶英 Tamoxifen（它莫西芬、三苯氧胺）

11 工业化学物质（ 22种）： ②无机物 砷及其化合物 铍及其化合物 铬化合物 ( 六价) 镍化合物 镉及其化合物 石棉 含石棉状纤维的滑石粉
毛沸石

12 药物（15种）： 环孢霉素 环磷酰胺 甲氧补骨脂素加长波紫外辐射 噻替派 苏消胺
MOPP及其他包括烷化剂的联合化疗〔氮芥(M) 、长春新碱(O) 、甲基苄肼(P) 、强的松(P)〕 苯丙氨酸氮芥

13 药物（15种）： 苯丁酸氮芥 硝基咪唑硫嘌呤 己烯雌酚 雌激素替代疗法 非甾族雌激素 甾族雌激素 复方口服避孕药 顺序型口服避孕药

14 生物毒素（1种）： 黄曲霉毒素B1

15 混合物（12种）： 酒精饮料 含非那西汀的止痛合剂 槟榔与烟草一起咬嚼 煤焦油沥青 煤焦油 未处理和略加处理的矿物油

16 混合物（12种）： 腌鱼(中国式) 页岩油 煤烟灰 无烟的烟草制品 卷烟烟气 木尘

17 接触环境（13种）： 铝的生产 金胺制造 靴鞋制造和修理 煤的气化 焦炭生产 家具和箱橱制造 接触氡的地下赤铁矿开采

18 接触环境（13种）： 铁和钢的铸造 异丙醇制造 ( 强酸工艺 ) 品红制造 油漆工 ( 职业接触 ) 橡胶行业
含硫酸的强无机酸酸雾 ( 职业接触 )

19 第二节 化学致癌作用机理 一、化学致癌物与DNA形成加合物 许多致癌物是亲电子剂，能与细胞内DNA结合形成加合物，造成DNA不可逆的损伤。

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21 化学物可与DNA的碱基、戊糖或磷酸发生反应，形成稳定的等价加合物，也可迅速导致碱基脱氨或水合作用以及DNA断裂、碱基丢失、DNA双螺旋扭曲变形，引起移码突变、DNA链内交联等。

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23 二、化学致癌物的代谢活化 直接致癌物 间接致癌物
许多化学致癌物并不能直接与DNA共价结合，必须在体内代谢活化后才有能力与靶分子起作用。根据是否需代谢活化，可将致癌物分为： 直接致癌物 间接致癌物

24 直接致癌物 (direct carcinogen)
不需代谢活化即具有亲电子活性，能与DNA 共价结合形成加合物 ( adduct ) 而诱导细胞癌变。如烷化剂和金属致癌物等，大多数是合成的有机物。

25 间接致癌物 ( indirect carcinogen )
需在体内代谢活化后才具有致癌活性。活化前的间接致癌物称为前致癌物 ，经过代谢的活性产物称为终致癌物，在活化过程中的中间产物称为近似致癌物。 代谢酶 代谢酶 前致癌物 近致癌物 终致癌物

26 大多数化学致癌物是间接致癌物，例如： 多环芳烃类 芳香胺类 亚硝胺类 致癌性霉菌毒素

27 代谢活化分为两相： 第一相氧化作用，使致癌物活性增加，由细胞色素P450酶系、还原酶及单胺氧化酶等催化。 第二相结合反应，通常转变为弱或无致癌性的极性化合物。少数为活化过程，如N-羟基-2-乙酰氨基芴的结合反应。

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29 化学致癌物代谢的特点： 1. 代谢以氧化过程为主。 2. 代谢活化以肝脏为主（P450酶系肝脏最多）。
1. 代谢以氧化过程为主。 2. 代谢活化以肝脏为主（P450酶系肝脏最多）。 3. 代谢酶的活性存在种属、品系和个体差异，个体间可相差30-100倍。 4. 其他代谢途径：例如肾脏、膀胱等含有前列腺素H合成酶，可将2-萘胺激活；可将苯并(a)芘、黄曲霉素B1生成环氧化物。皮肤、肺等含有髓过氧化物酶，可将芳香胺活化。

30 三、致突变性与致癌性 致突变性与致癌性的关系: 一方面绝大多数化学致癌物有致突变性。 另一方面在致癌物诱发的肿瘤细胞中存在相关的基因突变。

31 Ames试验 测试175种已知致癌物，结果有157种致突变为阳性，相关率达89.7%。
测试125种非致癌物，有109种为致突变阴性，相关率达87.2%。 果蝇试验、染色体畸变分析等也有类似结果。

32 基因突变与肿瘤形成的关系： 在DNA复制、转录和翻译过程中，如果模板受到损害，蛋白质的氨基酸序列可能会发生改变，从而可能影响蛋白质的正常功能，最终使细胞生长分化失控而致癌。

33 在很多情况下，某个碱基的突变并不改变DNA密码，蛋白质的氨基酸序列并不改变，称无声突变 ( silent mutation )。
有些突变可改变氨基酸的序列，但不影响蛋白质的功能；或者可影响蛋白质的功能，但对细胞的生长和分化不起作用，此种突变并不致癌。 与细胞生长和分化有关的基因突变在致癌过程中起关键作用。

34 DNA修复失败 化学物 有 有无蛋白表达及功能改变 DNA 损伤 无 影响生长分化 不影响生长分化 不致癌 致癌 可遗传的改变，即突变
无明显 后果 无

35 对基因突变的检测可作为检测化学致癌物的一个指标。
但是，并非所有的致突变剂都是致癌物；有些致癌物可能通过非遗传机制致癌，因此用致突变试验预测致癌物有一定的局限性。

36 四、原癌基因、癌基因、抑癌基因 (一) 癌基因致癌概念的提出
许多基因都会受到化学物的致突变作用，但某些特异性基因的突变在细胞的恶变中起关键作用。

37 人们发现病毒致癌是由于携带有能致癌的遗传信息，即癌基因 ( oncogene ) 。病毒癌基因直接或经过逆转录后整合于宿主细胞的基因组，从而导致细胞的癌变。

38 在人类正常细胞中也存在着与病毒癌基因高度相似的DNA序列，称原癌基因 (proto-oncogene)。原癌基因的表达并不引起恶性变化，而是调控细胞的增殖、分化和信息的传递。原癌基因必须被激活转变为癌基因以后，才能导致细胞的恶性转化。

39 目前已鉴定出20多种病毒癌基因，每一种都能在人类细胞中找到相应的原癌基因。
目前发现的原癌基因已有50多种。

40 （二）原癌基因的激活方式 原癌基因 癌基因 点突变 染色体易位与基因重排 基因扩增 逆反病毒插入 原癌基因缺失

41 （三）癌基因的协同作用 一种原癌基因被激活并不足以导致细胞的恶变。
实验1 ：以重排的 myc 基因转染( transfection ) 大鼠胚胎成纤维细胞，可使细胞获得无限止传代的能力（正常传20代即死亡）。 无限止传代能力是肿瘤细胞特征之一。 但成纤维细胞并未获得恶性细胞的形态表型，并不能发展成为肿瘤。

42 实验2 ： 用活化的 ras 转染成纤维细胞，细胞的形态虽发生恶性转化，但不能无限止生长，也不能发展成为肿瘤。
实验3 ： 当同时转染重排的 myc 和活化的 ras ，细胞既发生形态转化，又有无限止生长能力，将此种细胞移植于动物体内以后可发展为肿瘤。

43 肿瘤细胞的形成最少需要无限止生长和形态转化两种原癌基因的协同作用。
例如癌细胞HL-60细胞系： 既有 扩增的myc基因 又有 活化的N-ras基因 例如Burkitt淋巴瘤的某些细胞系： 既有 重排的myc基因

44 （四）抑癌基因与原癌基因的协同作用 肿瘤的发生与发展与抑癌基因 ( tumor suppressor gene，肿瘤抑制基因) 也有关系。
抑癌基因抑制细胞增殖和促进细胞分化，具有拮抗癌基因的作用。抑癌基因缺失或突变将导致细胞生长不受控制，引起细胞的恶性转化。

45 例如p53基因：参与细胞周期的调控、DNA修复、细胞分化、细胞凋亡等功能。
DNA受损时，p53基因编码的蛋白质增多，阻断细胞周期的循环，细胞停留在G1期，使DNA在复制之前有充分的修复时间。 当DNA受损严重无法修复时，p53蛋白持续增多并诱导细胞凋亡，以免受损DNA传入子代细胞中。

46 人类绝大多数肿瘤都有p53基因的突变，在肺癌中的突变率高达80%。
p53基因突变后，DNA损伤时细胞周期不能暂停，受损DNA无充分修复时间；也不引起细胞凋亡，细胞继续复制，使突变细胞增多，癌变机率增加。 人类绝大多数肿瘤都有p53基因的突变，在肺癌中的突变率高达80%。

47 在肿瘤的形成和发展中，既有原癌基因的激活又有抑癌基因的灭活同时存在。
例如人类结肠癌细胞中存在4个以上基因突变： APC/MAC DCC 抑癌基因 P53 K-ras 原癌基因

48 五、化学致癌的非遗传机制 大多数化学致癌物可与DNA共价结合，引起基因突变或染色体结构和数目的改变，最终导致癌变。由于其作用靶部位是机体的遗传物质，故称为遗传毒性致癌物 ( genotoxic carcinogen )。

49 部分致癌物用常规的致突变试验不能检出致突变性，但可影响生长调节基因的表达，促进细胞分裂增殖而诱发肿瘤。由于其不直接作用于遗传物质，称为非遗传毒性致癌物(nongenotoxic carcinogen), 如免疫抑制剂、石棉、激素和促癌剂等。

50 遗传毒性致癌物和非遗传毒性致癌物的区分不是绝对的，有些化学物达到一定剂量时，既具有遗传毒性(启动剂) ，同时也具有非遗传毒性 (促癌剂)。

51 非遗传毒性致癌物促进细胞分裂增殖而诱发肿瘤，例如许多激素是有丝分裂剂，它们与细胞内相应受体结合，通过第二信使，影响生长调节基因的表达，刺激细胞分裂增殖，如调节甲状腺、肾上腺、胰腺、乳腺、性腺等器官的各种激素。

52 卵巢切除术后或绝经后雌激素替代疗法或长期使用激素类避孕药会增加生癌的危险性。
体内某种激素水平异常升高，会使靶细胞转化成癌细胞的可能性增高。如： 卵巢切除术后或绝经后雌激素替代疗法或长期使用激素类避孕药会增加生癌的危险性。 碘缺乏者体内促甲状腺生成素水平持续升高，而易患甲状腺肿瘤。

53 细胞分裂增殖对肿瘤形成的影响： ① 细胞分裂时，S期细胞DNA解螺旋，富含电子的部位大量暴露，易受致癌物的攻击。 ② 细胞快速增殖，细胞周期缩短， DNA损伤修复时间减少，突变机会增加。 ③ 基因突变后细胞必须通过增殖才能表现出其突变或转化表型。 ④ 转化细胞通过增殖才能继续演变，发展成自主性增殖的肿瘤。

54 六、化学致癌的阶段理论 启动阶段 ( initiation )：有基因突变 促癌阶段 ( promotion )
化学致癌过程非常复杂，包括一系列生物学改变，是一个长期的、多因素、多基因参与的多阶段过程，至少有三个阶段： 启动阶段 ( initiation )：有基因突变 促癌阶段 ( promotion ) 进展阶段 (progression )：有基因突变

55 三阶段论的实验模型： （1）给动物启动剂二甲苯并蒽一次，可诱发少数良性皮肤肿瘤。
（2）随后接触促癌剂 TPA（12-邻十四烷酰大戟二萜醇-13乙酸酯），良性肿瘤数量增多。单独使用或在给予启动剂之前使用TPA ，都不能诱发肿瘤。 （3）促癌之后再次接触启动剂（进展剂）二甲苯并蒽，出现恶性肿瘤，且随着接触次数增加，恶性肿瘤数亦增多。

56 1. 启动阶段 此刻细胞并不表现出肿瘤细胞的生物学特性。
化学致癌物作用于DNA造成损伤， DNA损伤经细胞分裂增殖 (一到数次) 被固定下来，导致基因突变，使细胞发生了不可逆的遗传性改变。 此刻细胞并不表现出肿瘤细胞的生物学特性。

57 启动细胞并不都能存活下来。 启动细胞的其他转归： （1）被机体的免疫系统清除，如被吞噬细胞消灭。 （2）通过细胞凋亡而消失。 （3）在组织稳态因素控制下，保持休眠状态。

58 2. 促癌阶段 促癌物作用于启动细胞上的特定受体而影响信息传递，可逆地增加或减弱基因表达，促进已突变的启动细胞迅速分裂增殖，形成良性肿瘤。

59 促癌物不引起DNA结构的改变，通过非遗传机制发生作用。
促癌物（promoter of carcinoma）本身不具有致癌性，单独作用不会诱发肿瘤，但当它与致癌物共同作用，或在致癌物作用之后，反复作用于细胞，可促进启动细胞分裂增殖而发展成为肿瘤。 促癌物不引起DNA结构的改变，通过非遗传机制发生作用。

60 常见的促癌物 （1）12-邻十四烷酰大戟二萜醇-13-乙酸酯 ( 12-O-tetradecanoyl-phorbol- 13-acetate，TPA )： 巴豆油中的脂环化合物，小鼠皮肤癌 （2）苯巴比妥： 肝脏肿瘤 （3）雄激素和雌激素(内源性促癌物)：靶器官、肝脏肿瘤 （4）胆酸：结肠的癌前病变和恶变 （5）无铅汽油：大鼠肾小管癌

61 其他促癌物 多肽激素 卤代烃类 煤焦油中的酚类 有机氯杀虫剂 多溴联苯

62 有些物质具有启动和促癌的双重作用，称为完全致癌物(completecarcinogen)。完全致癌物的单独作用即可诱发肿瘤。

63 3. 进展阶段 在促癌阶段中或之后，细胞在化学致癌物作用下出现复杂的基因改变(染色体的结构变异、大段丢失、易位或嵌入)，细胞形态和行为发生变化, 如生长加速、高度的侵犯性、转移能力、对激素的反应性改变以及生化、免疫性能改变等，从而获得了恶性肿瘤细胞的特性。

64 在进展阶段起作用的化学物质称为进展剂(progressor)，它们常常也是启动剂或完全致癌物。

65 综上所述，化学致癌过程是多阶段、多因素、多基因参与的长期累积过程。

66 第三节 药物致癌作用危险性评价 目前的策略： 致突变试验 初筛 短期致癌试验 必要时 长期致癌试验 最后 根据结果，推测对人类致癌的危险性。
第三节 药物致癌作用危险性评价 长期动物致癌试验是检测化学致癌物的经典的方法，但耗费人力、物力较大，时间较长。 目前的策略： 致突变试验 初筛 短期致癌试验 必要时 长期致癌试验 最后 根据结果，推测对人类致癌的危险性。

67 现有策略存在的问题： ① 致突变试验的敏感度 ( 真阳性) 和特异度 ( 真阴性) 都只有50％ ~ 60％左右。
② 长期动物喂饲试验费时费力，实验结果阳性率太高(多于50％)。可能与测试所用的高剂量、最大耐受剂量有关。 ③ 由于种属差异，且实验动物数与人群数目相比毕竟很少，要将动物实验结果推导到人群也是十分困难的。

68 我国《新药注册管理办法》对致癌试验的有关规定：
1、新药的结构或其代谢产物的结构与已知致癌物有关或相似。 2、在长期毒性试验中发现有细胞毒性作用或能使某些脏器、组织细胞异常显著活跃的新药。 3、致突变试验结果为阳性的新药。 以上情况只要符合一点，就必须报送致癌试验资料。

69 一、筛检致癌物的致突变试验 假阳性假阴性比率较高(50％~60％) (1) 细菌回复突变试验（如Ames试验）
(2) 哺乳动物细胞正向突变试验 (3) 果蝇伴性隐性致死试验 (4) 小鼠特异基因试验 (5) 染色体畸变试验 (6) 微核试验

70 一、筛检致癌物的致突变试验 (7) 姐妹染色单体互换 ( SCE ) 试验 (8) 显性致死试验 (9) 小鼠可遗传易位试验
(10) 细菌DNA修复试验 (11) 程序外DNA合成试验 (12) 精子畸形试验

71 二、短期致癌试验 (一) 哺乳动物培养细胞恶性转化试验 （二）动物短期致癌试验

72 (一) 哺乳动物培养细胞恶性转化试验 受试药物在加S9与不加S9的平行条件下，与哺乳动物培养细胞接触一段时间（如24时）。
哺乳动物培养细胞：如叙利亚地鼠胚胎细胞、人成纤维细胞、小鼠或大鼠支气管上皮细胞等

73 观察: 细胞的形态 生长能力 生化表型 移植于动物体内能形成肿瘤的能力 判断正常细胞是否发生了因核型改变所致的恶性转化。

74 恶性转化细胞的特征： （1）细胞形态的变化 恶性转化细胞偏大且大小不等。
核大而畸形，染色质深染而粗糙，核浆比例倒置，核膜粗厚、核仁增生而肥大。 核仁和胞浆均由于RNA增多而偏酸性，故呈嗜碱性染色而偏蓝。核分裂多见。

75 恶性转化细胞的特征： （2）细胞生长自控能力丧失
生长自控能力：表现为接触抑制 接触抑制：在液体培养基中的细胞贴壁后，正常克隆为单层细胞且细胞排列有序；而转化克隆为多层细胞且排列紊乱。

76 恶性转化细胞的特征： （3）生化表型的改变 对植物凝集素反应异常 糖酵解方式改变 形成新的特异抗原
（4）恶性转化后的细胞移植于动物体内有形成肿瘤的能力

77 （二）动物短期致癌试验 1. 小鼠肺肿瘤诱发试验 2. 大鼠肝脏转变灶诱发试验 3. 小鼠皮肤肿瘤诱发试验 4. 雌性大鼠乳腺癌诱发试验

78 小鼠肺肿瘤诱发试验 动物： 推荐使用A系小鼠 6~8周龄 体重15~20克 雌雄各半 每组至少50只

79 小鼠肺肿瘤诱发试验 剂量及分组： 给药途径： 一般采用腹腔注射或其它适宜的途径。 观察时间： 30~35周或更短些。
一般设高、中、低三个剂量组。 最高剂量：每周给药三次，连续 8周的最大耐受剂量。 另设阴性对照组。 给药途径： 一般采用腹腔注射或其它适宜的途径。 观察时间： 30~35周或更短些。

80 小鼠肺肿瘤诱发试验 大体解剖检查： 试验结束时，处死动物，取出肺脏，在解剖镜下观察肺表面。
肿瘤为灰白色半透明、边缘整齐的圆形突起，0.1~0.3mm大小，大多为肺腺瘤或乳头状腺瘤，一部分可能发展为癌。 必要时做病理组织学检查。

81 结果判断： 符合下列情况可判为阳性： （1）实验组肺肿瘤的均数比对照组显著增加 （2）有剂量效应关系
（3）阴性对照组肺肿瘤的平均数与文献报道的同龄未染毒小鼠肺肿瘤发生率大体相符

82 三、动物长期致癌试验 大多数已知的人类致癌物都能诱发动物肿瘤， 因此，通过动物长期致癌试验可以对化学物的致癌性作出充分估计。
短期筛检试验阳性的受试物，若有重要使用价值，应进行哺乳动物长期致癌试验。 大多数已知的人类致癌物都能诱发动物肿瘤， 因此，通过动物长期致癌试验可以对化学物的致癌性作出充分估计。

83 三、动物长期致癌试验 肿瘤的发病过程缓慢，距初次接触化学致癌物至最终形成恶性肿瘤，有5~30年的潜伏期。 用啮齿类动物进行1~2年的诱癌试验，相当于人类大半生时间，故又称哺乳动物终生致癌试验，是鉴定动物致癌物的经典方法，结果比较可靠。

84 三、动物长期致癌试验 1．试验动物的选择 （１）种属： 选用两种啮齿类动物，可选大鼠、小鼠、金黄地鼠等。 啮齿类动物的优点：
（１）种属： 选用两种啮齿类动物，可选大鼠、小鼠、金黄地鼠等。 啮齿类动物的优点： 对致癌物敏感性高，寿命相对较短、对其生理和病理特征了解较多，“自发肿瘤率”资料较全，饲养费用较低等。

85 1．试验动物的选择 （２）品系：　 同一种属不同品系的动物对化学致癌物的反应也相当不同。 要选择敏感、自发肿瘤率低，生活力强的品系。

86 （２）品系： 纯系动物的优点：自然寿命和自发肿瘤率较恒定，免疫性状相同，试验容易重复，便于结果比较。
杂交系动物的优点： 抗感染力较强，遗传特性比纯系动物复杂而更具有代表性。 杂交一代动物，可兼具二者的优点。

87 ２、动物年龄 选用刚断奶的幼年动物，不迟于出生后7~9周。 幼年动物肝药酶和免疫系统的发育还不完善，对受试物较敏感。
使致癌性较弱，潜伏期较长的致癌物有充分发挥作用的时间。

88 ３、动物数量 每组至少雌雄各50只动物。 动物数量应足够体现阳性反应，以免样本太小而不能全面反映总体情况。
每组动物数在试验结束时，应能满足统计分析的需要。

89 ４、动物性别 同等数量的雌、雄两性动物，以接近人类实际情况。

90 ５、给药途径 原则上与临床拟用途径相同。 口服给药：喂饲法或灌胃。 喂饲法：将药物混合在饲料或饮水中。挥发性或化学性质不稳定的药物不宜采用。
灌胃：准确控制剂量。

91 ６、剂量选择和分组 高剂量大，可以缩短出现肿瘤的潜伏期，消除动物易感性的个体差异。
　　 为了观察剂量—反应关系，至少设高、中、低3个剂量组。 高剂量大，可以缩短出现肿瘤的潜伏期，消除动物易感性的个体差异。 剂量亦不能过大，以免出现慢性毒性，使动物寿命缩短，以致大部分动物在肿瘤潜伏期之前死亡。

92 ６、剂量选择和分组 设立高剂量的原则： 最大耐受量(与对照组相比，动物体重增长抑制不超过10％，无中毒死亡动物，一般状况变化不大。)
设立高剂量的原则： 最大耐受量(与对照组相比，动物体重增长抑制不超过10％，无中毒死亡动物，一般状况变化不大。) 一般先进行短期预试验，同时参考长期毒性试验结果确定高剂量。

93 ６、剂量选择和分组 低剂量：临床拟用剂量的１~３倍。 中间剂量：与高低剂量成等比级数关系。 另设空白对照组和溶媒或赋形剂对照组。

94 ６、剂量选择和分组 阳性对照组： 必要时可设。选用与受试物结构相近的已知致癌物作阳性对照物。
阳性对照组： 必要时可设。选用与受试物结构相近的已知致癌物作阳性对照物。 意义： 检测动物的敏感性，以及试验设计、设备和操作过程的合理性，以便评价试验结果的可靠性和比较受试物致癌性的相对强度。

95 ７、试验期限 动物正常寿命的大部分时间或终生 大鼠：两年以上（平均寿命2~2.5年） 小鼠：一年半以上（平均寿命1.5~2年）。
当给药组与阴性对照组之间肿瘤发生率已有明显差别时，可提早结束试验。

96 有观点认为：为减少中途非肿瘤死亡，应在9-12月后停止给药
支持：使得动物由中毒或亚中毒状态恢复，存活时间较长和存活动物较多； 反对：虽对完全致癌物无较大影响，对于促癌剂可能出现可逆反应，抑制肿瘤发生率下降

97 8、动物饲养 恒温、恒湿 大、小鼠：23.3±1.1℃、40±5% 饲料中不能含有亚硝胺、黄曲霉素和杀虫剂等可能的致癌物质
自然存在于动物饲料中的各种酶的诱导剂和抑制剂可能影响动物肿瘤的发生或其他一些参数的变化

98 9、观察与检查 （1）一般观察： 每天观察动物1~2次，外表、活动、摄食状况等。定期称量体重。
全身浅表部位有无肿块，以及肿块出现的时间、部位、大小、数目、质地、发展速度及动物死亡时间等。

99 （1）一般观察： 疑为白血病时，作血液检查。
试验中途死亡或濒死的动物，应及时解剖检查，防止组织自溶。对全身各组织器官逐一取样，特别是有肿块或有病变的部位，留待病理组织学检查。

100 试验结束时，处死动物。大体解剖，肉眼观察各组织器官，逐一取样留作标本，特别是已出现肿块或怀疑有病变的部位。
（2）解剖和病理组织学检察 试验结束时，处死动物。大体解剖，肉眼观察各组织器官，逐一取样留作标本，特别是已出现肿块或怀疑有病变的部位。 病理组织学检查（光镜及电镜）。

101 尸检中需要检查和固定的器官和组织 肾上腺 大脑 盲肠 结肠 软骨结节 十二指肠 食管 眼睛 胆囊 心脏 空肠 肾脏 喉咙 肝脏 支气管 乳腺
下颌淋巴结 肠系膜 鼻腔 卵巢 胰腺 甲状旁腺 垂体 前列腺 直肠 唾液腺 坐骨神经 精囊 皮肤 脊髓 脾脏 胸椎脊椎骨髓 股骨 睾丸 大腿肌肉 组织团块可疑肿瘤 甲状腺 胸腺 膀胱 子宫

102 11、统计分析 统计各种肿瘤的数量（包括良性和恶性肿瘤）及任何少见的肿瘤、患肿瘤的动物数、每只动物的肿瘤数及肿瘤潜伏期
① 肿瘤发生率：一组动物中发生肿瘤的动物数与该组有效动物数（最早出现肿瘤时该组存活动物数）之比。 内脏肿瘤不易早期发现，通常将肿瘤引起该动物死亡的时间，定为发生时间。 ② 潜伏期： 从动物接触药物开始，到出现第一个肿瘤的天数。 ③肿瘤多发性：一个动物出现多个肿瘤或一个器官出现多个肿瘤。

103 12、结果判断： （1）给药组肿瘤发生率显著高于对照组自发肿瘤率。 （2）给药组肿瘤发生的潜伏期显著短于对照组。
（3）给药组肿瘤发生的部位多于对照组。

104 12、结果判断： 符合上述情况之一，并有统计学意义时可判为阳性，如有明显的剂量反应关系，结果更为可靠。
（4）给药组肿瘤的类型与对照组不同（对照组应有历史对照资料）。 符合上述情况之一，并有统计学意义时可判为阳性，如有明显的剂量反应关系，结果更为可靠。

105 13、试验结果的意义 一种动物试验结果为阳性时，预示该受试药对人可能有致癌潜力。
两种动物试验结果皆为阴性时，可初步认为该受试药对动物和人都没有致癌性。

106 *彗星试验 单细胞凝胶电泳（single cell microgel electrophoresis, SCGE），以DNA损伤与修复为检测终点。 对多环芳烃、芳香胺、金属致癌化合物、氧化剂等常见致癌物类型阳性检测率很高。 优点：检测谱宽、检测终点明确、观察结果直观、方法简便、适合体内和体外实验，也是接触已知致癌物的生物与人群的检测和分子流行病学调查的重要工具。

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108 *转基因动物模型 （1）转癌基因小鼠模型 与转录启动子连接的癌基因转入后可直接在某些特定的组织中高效表达，使得组织细胞处于启动状态，这类转基因动物是研究化学物致癌作用的敏感体系。 试验周期短，仅3个月左右。 可用于研究外源化合物与肿瘤相关基因的作用及外源化合物在致癌不同阶段中的作用机制。

109 （2）P53小鼠模型 异质结合体P53+/-小鼠仅具有单个功能复制P53基因，在所有人类癌症中多于50%通过突变或缺失而丢失。由于只有一个单个功能等位基因， P53小鼠正常发展，但对肿瘤诱发敏感性增加，这种情况类似于遗传性肿瘤抑制基因缺陷的个体。 当给予突变致癌剂时， P53+/-小鼠与正常小鼠相比通常在6个月内迅速发生肿瘤，而未处理的P53+/-小鼠在试验期间内通常不发生肿瘤。