本章内容概要： 第一节 概 述 第二节 血清氨基转移酶测定 第三节 血清碱性磷酸酶测定 第四节 血清γ-谷氨酰转肽酶测定.

Presentation on theme: "本章内容概要： 第一节 概 述 第二节 血清氨基转移酶测定 第三节 血清碱性磷酸酶测定 第四节 血清γ-谷氨酰转肽酶测定."— Presentation transcript:

1 本章内容概要： 第一节 概 述 第二节 血清氨基转移酶测定 第三节 血清碱性磷酸酶测定 第四节 血清γ-谷氨酰转肽酶测定

2 本章教学要求： 掌握 肝功能试验的意义及评价，赖氏法、速率法测定ALT，改良J-G法和胆红素氧化酶法测定胆红素的原理、注意事项及主要临床意义。 熟悉 金氏法、速率法测定ALP，GGT测定方法、酶比色法测定血清胆汁酸的原理、注意事项及主要临床意义。 了解 肝脏的结构特点及生物化学功能，某些肝病的生物化学。

3 2. 肝硬化的生物化学检查 （1）单胺氧化酶（monoamine oxidase, MAO）测定
（2）β-脯氨酸羟化酶（β-proline hydroxylase, β-PH）测定 （3）血清透明质酸（hyaluronic acid, HA）测定 （4）血清Ⅲ型前胶原肽（PⅢP）测定

4 第二节 血清氨基转移酶测定 一、氨基转移酶测定方法简介 酶： 方法:
第二节 血清氨基转移酶测定 一、氨基转移酶测定方法简介 酶： 丙氨酸氨基转移酶（alanine aminotransferase，ALT) 天冬氨酸氨基转移酶（aspartate aminotransferase，AST) 方法: 酶联-紫外连续监测法 二硝基苯肼比色法

5 （一）酶联-紫外连续监测法 原理： 计算： ALT和AST测定的参考方法
NADH在340nm处有特征吸收峰，连续监测NADH消耗引起的340nm吸光 度变化,根据340nm处吸光度下降速率（－△A/min）计算ALT活性 计算：

6 注意事项： 方法评价 参考范围： 1 .该ALT测定法中存在两个消耗NADH的副反应 2 .辅酶P-5′-P能使血清中的ALT显示最大活性
3 .试剂空白测定值的处理 4 .样本选择和处理 方法评价 1. 特异性高 2. 准确性高 3. 精密度高 参考范围： 5～40U/L或参考试剂盒提供的参考范围

7 （二）二硝基苯肼比色法 原理：

8 操作与计算 1. ALT校准曲线的绘制

9 2. 样本的测定 3 .计算 测定管吸光度减去对照管吸光度的差值为样本的吸光度，用该值在校准曲线上查得的卡门单位 4 .参考范围： 5～25卡门单位

10 注意事项： 1. 赖氏法单位定义： 卡门单位定义：血清1ml，反应液总体积3ml， 25℃，波长340nm，比色杯光径1.0cm，每分钟吸光度下降0.001A为一个单位（相当于每升反应体系中0.1608µmol NADH被氧化）。 2.底物α-酮戊二酸和2，4-二硝基苯肼浓度不足，以及产物丙 酮酸的抑制作用： 赖氏法的校准曲线不能延长到200卡门单位。当酶活性超过150卡门单位时，应用生理盐水作5～10倍稀释样本，测定结果乘以稀释倍数

11 3. 样本存放时间 在室温（25℃）可维持2d，在4℃冰箱可维持1周。在－25℃可维持1个月 4. 血清对照 试剂空白 自身血清的对照管 样本对照管 5. 丙酮酸钠的纯度对曲线的影响 6. 加入2，4-二硝基苯肼溶液后，应充分混匀，使反应完全。 加入氢氧化钠溶液的速度要一致，减少吸光度管间的差异。 7.称量必须准确

12 方法评价 重复性差 底物α-酮戊二酸用量不足 2，4-二硝基苯肼在碱性条件下也能显色 产物旁路效应 2. 准确性差 3. 试剂稳定性差
4. 操作简便

13 二、氨基转移酶测定的意义 肝细胞中含量最多，其次是肾脏和心脏，通常只有极少量释放入血液，所以血清中此酶的活力很低，当这些组织病变时，细胞坏死或通透性增加，细胞内酶大量释放入血，使血清中该酶活力显著增高 1. 血清ALT活性增高 肝胆疾病 骨骼肌疾病 一些药物和毒物可引起ALT活性升高 2．血清AST活性增高 心血管疾病 各种肝病均可引起血清AST的升高

14 第三节 血清碱性磷酸酶测定 一、测定方法简介 碱性磷酸酶: 底物: 一组非特异性的在碱性条件下水解磷酸酯的酶类 β-甘油磷酸钠 磷酸苯二钠
第三节 血清碱性磷酸酶测定 一、测定方法简介 碱性磷酸酶: 一组非特异性的在碱性条件下水解磷酸酯的酶类 底物: β-甘油磷酸钠 磷酸苯二钠 对硝基酚磷酸盐 酸酚酞 α-萘酚磷酸盐 4-甲基伞形花内酯酰磷酸盐

15 测定方法: （一）测定水解释放的无机磷 鲍氏（Bodansky）法 （二）测定底物水解后的羟基化合物
1. 羟基化合物需与显色剂作用后比色测定 金氏（King）法 2. 羟基化合物在碱性条件下直接显色测定 对硝基酚磷酸盐（p-nitrophenyl phosphate, 4-NPP）法

16 金氏法测定血清碱性磷酸酶 原理: ALP在碱性条件催化磷酸苯二钠水解，释放出酚和磷酸，酚在碱性溶液中与4-氨基安替比林作用，经铁氰化钾氧化形成红色的醌类化合物，根据红色的深浅与校准酚比较，确定ALP的活性。

17 单位定义： 参考范围： 方法评价： 100ml血清在37℃与底物作用15min，产生1mg酚为1个金氏单位
成人 3～13金氏单位，儿童 5～28金氏单位 方法评价： 灵敏度较高，显色稳定，不需去蛋白，操作简单、快速准 确度和精密度都较低,受胆红素和溶血的干扰

18 速率法测定血清碱性磷酸酶 原理: 以对-硝基苯酚磷酸钠（4-NPP）为底物， AMP或二乙醇胺（DEA）为磷酸酰基的受体。在碱性条件下，ALP催化4-NPP水解释放出磷酸基团，生成游离对-硝基酚（p-nitrophenol, 4-NP），4-NP在碱性溶液中转变成醌式结构，呈现较深的黄色。根据405nm处吸光度增加的速率（△A/min）推算出清ALP活性单位。

19 计算： 参考范围： 40～160 U/L （37℃） 方法评价： 灵敏度高、线性范围宽（500U/L以上）和精密度高

20 二、碱性磷酸酶测定的意义 分布：广泛存在于各器官组织中，尤以肝脏、骨骼、小肠和肾脏含量较高，血清中ALP主要来自肝脏和骨骼 病理性增高：
肝胆疾病：阻塞性黄疸、急性或慢性黄疸型肝炎、肝癌 骨骼疾病：佝偻病、骨软化病、骨转移癌和骨折修复愈合期 生理性增高：妊娠期与儿童生长发育期

21 第四节 血清γ-谷氨酰转肽酶测定 一、测定方法简介 γ-谷氨酰基转移酶（γ-glutamyl transferase，GGT) 测定方法:
第四节 血清γ-谷氨酰转肽酶测定 一、测定方法简介 γ-谷氨酰基转移酶（γ-glutamyl transferase，GGT) 测定方法: （一）重氮比色法 （二）速率法

22 速率法测定血清γ-谷氨酰基转移酶 原理： GGT催化γ-谷氨酰基移换反应。以L-γ-谷氨酰-3-羧基-4-硝基苯胺为底物，双甘肽为谷氨酰基的受体，在GGT的催化下，谷氨酰基转移到双甘肽分子上，同时释放出黄色的2-硝基-5-氨基苯甲酸，根据405nm处吸光度增加的速率（△A/min）推算出GGT活性单位

23 参考范围：男性 11～50U/L （37℃），女性 7～32U/L（37℃） `
计算： 参考范围：男性 11～50U/L （37℃），女性 7～32U/L（37℃） ` 方法评价: 本法准确度好；精密度好线性范围宽（460U/L）；操作 简便；但对试剂纯度要求高

24 原理： 重氮比色法测定血清γ-谷氨酰基转移酶
以γ-谷氨酰α-萘胺作为γ-谷氨酰基的供体，双甘肽作为受体，在GGT作用下，产生α-萘胺，后者与重氮试剂反应，产生红色α-萘胺-对-偶氮苯磺酸，其色泽的深浅与GGT活力成正比。

25 参考范围： 方法评价： 成年男性 3～17U/L， 成年女性 2～13U/L 不需去除蛋白质，操作简便， 颜色稳定，线性关系
好，但底物水溶性较差

26 二、γ-谷氨酰转肽酶测定的意义 分布：肾最高，其次是前列腺、胰、肝等器官 可能有助于诊断肾疾病 尿中GGT活性： 血清GGT用于诊断肝胆疾病
1. 原发性或转移性肝癌 2. 阻塞性黄疸 3. 病毒性肝炎和肝硬化 4. 乙醇性肝炎

27 第五节 血清胆红素测定 一、测定方法简介 测定方法: 重氮法 改良J-G法 胆红素氧化酶（bilirubin oxidase，BOD）法
第五节 血清胆红素测定 一、测定方法简介 总胆红素 未结合胆红素 结合胆红素 δ胆红素 测定方法: 重氮法 改良J-G法 胆红素氧化酶（bilirubin oxidase，BOD）法

28 （一）重氮法 原理： + 结合胆红素 结合胆红素能与重氮试剂直接反应生成紫红色的偶氮化合物（λ=560nm）
未结合胆红素需加入甲醇、乙醇、苯甲酸钠、尿素等“加速剂”，破坏分子内氢键 ，才能与重氮试剂反应生成紫红色的偶氮化合物 + 结合胆红素

29 （二）改良J-G法(加速剂为苯甲酸钠-咖啡因)
原理： 血清与醋酸钠-咖啡因-苯甲酸钠试剂（咖啡因试剂）混合后，加入氯化重氮苯磺酸（重氮试剂），生成紫红色偶氮胆红素，最后加入强碱性酒石酸钠溶液，使颜色不稳定的紫红色偶氮胆红素在咖啡因存在下转化为稳定的蓝色偶氮胆红素。反应结束后，在600nm波长比色，从校准曲线查找总胆红素和结合胆红素含量 醋酸钠缓冲液保持偶氮反应的pH； 咖啡因试剂中苯甲酸钠-咖啡因促进未结合胆红素分子内的氢键破坏，加速与重氮试剂的偶联反应； 叠氮钠（或抗坏血酸）可终止结合胆红素的偶氮反应。