Department of pathogenic Biology of Gannan Medical University

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1 Department of pathogenic Biology of Gannan Medical University
医学微生物学 Medical Microbiology 病原生物学教研室 Department of pathogenic Biology of Gannan Medical University

2 第八章 病原学诊断与防治 第一节 细菌学诊断 第二节 病毒学诊断 第三节 真菌学诊断 第四节 特异性预防与治疗(自学)

3 第一节 细菌学诊断 细菌学诊断内容包括: ◙ 查病原菌及其成分（抗原、产物、核酸） ——细菌学诊断
第一节 细菌学诊断 细菌学诊断内容包括: ◙ 查病原菌及其成分（抗原、产物、核酸） ——细菌学诊断 （bacteriological diagnosis） ◙ 查特异性抗体 ——血清学诊断 （serological diagnosis）

4 一、病原菌检测 ◙按疾病种类与病程采取不同标本 ◙无菌操作，防污染 ◙在发病早期与用药之前采取标本 ——对已使用抗菌药物的患者标
（一）标本采集与送检原则 ◙按疾病种类与病程采取不同标本 ◙无菌操作，防污染 ◙在发病早期与用药之前采取标本 ——对已使用抗菌药物的患者标 本，实验室要采取适当措施

5 ◙快速、冷藏送检 ——对少数菌要保温送检（如脑膜炎球 菌、淋球菌等） ◙有特殊要求的细菌（如某些严格厌氧菌等） 必须在特殊条件下送检和保存。

6 （二）检测方法 1、形态结构检查 2、分离培养鉴定 3、抗原检测 4、其他检测

7 1、形态结构检查 一般程序： 标本涂片 固定 染色 镜检 （观察镜下特征：菌体形态、排列、染色性 及特殊结构等） 初步鉴定
标本涂片 固定 染色 镜检 （观察镜下特征：菌体形态、排列、染色性 及特殊结构等） 初步鉴定 注：对形态、结构、排列方式和染色性无特征的细菌，直接涂片染色镜检无意义

8 主要技术 （1）显微镜放大技术 普通光学显微镜 以可见光为光源 分辨率：0.25μm 放大倍数：×1000

9 电镜标本制作复杂，且必须真空干燥状态下观察
B. 电子显微镜 以电子流代替光波， 电磁圈代替放大透镜 分辨率：1nm 放大倍数：×10万以上 电镜标本制作复杂，且必须真空干燥状态下观察 ——不能观察活的微生物

10 C. 其他显微镜: 适用不同观察目的 暗视野显微镜 相差显微镜 荧光显微镜 共聚焦显微镜

11 （2）染色技术 细菌易与带正电荷的碱性染料结合而着色 简单染色法：只用一种染料，过程简单， 可观察菌体形态、排列方式 复合染色法：用二种或二种以上染料多步骤染 色，能反映菌体内部染色特征

12 革兰染色法：革兰阳性菌（紫色）、 革兰阴性菌（红色） 抗酸染色法： 抗酸阳性菌（红色）、 抗酸阴性菌（蓝色） 特殊染色法： 细菌荚膜、芽孢、鞭毛、 细胞壁、核质等染色

13 革兰氏染色法（Gram Stain） 由丹麦医生Hans Christian Gram于1884年创立。 1、步骤： 革兰阳性菌 革兰阴性菌
(Gram positive bacteria) 革兰阴性菌 (Gram negative bacteria) 涂片 结晶紫 染色 碘液媒染 酒精脱色 复红复染

14 2、分离培养与鉴定 一般程序： 标本（或增菌后） 接种 染色镜检： 生化反应 ：如肠道杆菌的乳糖发酵试验
（isolation and identification） 一般程序： 培养特征： 生长条件 菌落特征 溶血环特征等 普通琼脂平板 血琼脂平板 选择培养基平板 标本（或增菌后） 接种 染色镜检： 根据形态特征初步鉴定 生化反应 ：如肠道杆菌的乳糖发酵试验

15 血清学鉴定：鉴定细菌的种、型 内、外毒素检测 动物试验：家兔、豚鼠等 毒力鉴定 纸片法：只可定性 试管法：可定量（测MBC、MIC） E-test： 可定量（只可测MIC） 药敏试验

16 3、抗原检测（detection of bacterial antigens）
用已知Ab检测待测Ag： 特点：特异性强、敏感性高，Ag的检出与病原菌的死活无关

17 4、其他检测： 代谢产物的检测： 如气相色谱法鉴定厌氧细菌 PCR检测核酸 基因芯片

18 二、血清学检测 用已知Ag测未知Ab 标本：血清和其他体液 诊断意义： 双份血清Ab效价4倍及4倍以上升高

19 常用方法：  凝集试验： Widal test——诊断伤寒、副伤寒 Well-Felix——诊断立克次体病 钩体的显微凝集试验
 中和试验： 抗“O”试验  ELISA

20 第二节 病毒学诊断 电镜直接观察 光镜检查包含体 分离培养 病毒颗粒 病毒抗原 病毒核酸 病毒酶类：如逆转录酶 查病毒 病毒感染的 检测内容
第二节 病毒学诊断 电镜直接观察 光镜检查包含体 分离培养 病毒颗粒 病毒抗原 病毒核酸 病毒酶类：如逆转录酶 查病毒 病毒感染的 检测内容 查特异性Ab

21 一、标本采集与送检原则 ◙按疾病种类与病程采取不同标本 ◙无菌操作，标本用“双抗”或加两性霉素B 处理 ◙在发病早期与用药之前采取标本
◙ 低温保存，快速送检，病变组织用50％ 甘油保存 ◙血清学检测采双份血清

22 二、病毒的分离与鉴定 一般程序： 动物接种 鸡胚培养 细胞培养 指标阳性 指标阴性 病毒鉴定 标本 盲传2－3代 指标阴性 病毒阴性
无菌处理 标本 盲传2－3代 指标阴性 病毒阴性

23 （一）病毒分离培养方法 1、动物接种: 黑猩猩、猴、兔、鼠等 优点：结果易观察，可建立动物模型 缺点：有饲养条件要求，费用高、动物
体内常带有潜伏病毒

24 2、鸡胚培养: 优点：易管理, 不带微生物, 成本较低 缺点：操作程序复杂

25 3. 细胞培养 (1)原代和次代细胞培养 (原代细胞) (次代细胞培养) 剪碎 蛋白酶 培养基 组织 组织块 分散的单个细胞 单层细胞
剪碎 蛋白酶 培养基 组织 组织块 分散的单个细胞 单层细胞 (原代细胞) 传代培养 单层细胞 (次代细胞培养)

26 病毒的细胞培养

27 特点: A. 对多种病毒敏感 B. 生长能力有限, 获取成本高 C. 可携带潜伏病毒

28 (2)二倍体细胞培养 体外分裂50-100代仍保持二倍体染色体数目。 可用于病毒的分离和疫苗生产 特点: B.不带异种蛋白(人源性)
A. 对多种病毒敏感 B.不带异种蛋白(人源性) C. 不带病毒,无致瘤潜能 D. 可传代50代左右

29 (3) 传代细胞培养 特点: A.对多种病毒敏感性高 B. 繁殖能力高,传代时间长 C. 有致癌危险，不能用于疫苗生产

30 1.细胞病变效应( cytopathic effect, CPE)
(二) 病毒在细胞中增殖的指标 1.细胞病变效应( cytopathic effect, CPE) 病毒感染细胞 发生形态改变 Cytopathic effect of enterovirus 71 and HSV in cell culture: note the ballooning of cells. (Virology Laboratory, Yale-New Haven Hospital, Linda Stannard, University of Cape Town)

31 Cytopathic Effect （2）病毒感染细胞 与邻近细胞融合
Syncytium formation in cell culture caused by RSV (top), and measles virus (bottom).

32 Cytopathic Effect （3）形成包涵体（inclusion body）

33 2. 红细胞吸附（hemadsorption, HAd）
病毒包膜表面血凝素（HA）＋ RBC表面HA受体 Syncytial formation caused by mumps virus and haemadsorption of erythrocytes onto the surface of the cell sheet.

34 3. 干扰现象（interference） 4. 细胞代谢改变： 病毒增殖，细胞代谢变慢，pH变化减慢
风疹病毒＋人胚肾细胞 病毒增殖，CPE（－） 埃可病毒＋人胚肾细胞 病毒增殖，CPE（＋） CPE(-)——风疹病毒(+) 埃可病毒(-) CPE(+)——风疹病毒(-) 埃可病毒(+) 风疹病毒？ 埃可病毒 ＋人胚肾细胞 4. 细胞代谢改变： 病毒增殖，细胞代谢变慢，pH变化减慢

35 (三) 病毒定量测定 血凝试验： 病毒总量（活病毒+死病毒） 蚀斑测定（plaque） ： ID50或TCID50 感染性病毒量
(50%组织细胞感染量)： 感染性病毒量

36 第三节 真菌学诊断 (一) 标本的采集 浅部感染真菌：表层皮损组织（用70％酒精消毒） 深部感染真菌：体液、分泌物、排泄物等
第三节 真菌学诊断 (一) 标本的采集 浅部感染真菌：表层皮损组织（用70％酒精消毒） 深部感染真菌：体液、分泌物、排泄物等 (二)检查与鉴定 1、直接镜检： 查孢子、菌丝 表层角质标本：用10％KOH微加热后镜检 体液、分泌物、排泄物： 离心后染色镜检

37 2、分离培养： 标本处理 沙氏培养基 大培养 小培养 菌落特征观察 生化反应或 分子生物学技术 观察菌丝 孢子特征 鉴定

38 3.动物试验 4.皮肤超敏反应试验 （三）真菌学快速诊断 检测真菌Ag 、 Ab 检测真菌核酸 检测真菌毒素

39 第四节 特异性预防与治疗 一、人工主动免疫 用人工的方法将疫苗或类毒素等抗原性制剂 接种于人体，使机体获得特异性免疫力。用于预 防。
第四节 特异性预防与治疗 一、人工主动免疫 用人工的方法将疫苗或类毒素等抗原性制剂 接种于人体，使机体获得特异性免疫力。用于预 防。 主要生物制品: 亚单位疫苗 死疫苗 基因工程疫苗 活疫苗 重组载体疫苗 合成疫苗 DNA疫苗 类毒素 转基因植物疫苗

40 死疫苗与活疫苗的比较 区别点 死疫苗 活疫苗 制剂特点 死，强毒株 活, 无毒或弱毒株 接种剂量与特点 量较大，2~3次 量较小，1次
保存及有效期 易保存，约1年 不易保存，4℃ 数周 免疫效果 较低， 维持数月~2年 较高， 维持3~5年甚至 更长

41 二、人工被动免疫 用人工的方法注射含有特异性抗体的免疫血清
、纯化免疫球蛋白抗体或细胞因子等免疫制剂，使机体立即获得特异性免疫力。用于应急性预防和治疗。 主要生物制品： 抗毒素 细胞免疫制剂 抗菌血清 胎盘球蛋白 丙种球蛋白

42 人工主动免疫与人工被动免疫的比较 区别要点 人工主动免疫 人工被动免疫 免疫物质 抗原 抗体或细胞因子等 免疫出现时间 慢，2~4周
快，立即 免疫维持时间 长，数年~数月 短，2~3周 主要用途 预防 治疗或紧急预防

43 三、细菌感染的治疗 (一）抗菌药物的种类 生物来源分类：细菌、真菌、放线菌产 生的抗生素 按化学结构和性质分类 ①β-内酰胺类 ④四环类
①β-内酰胺类 ④四环类 ②大环内酯类 ⑤氯霉素 ③氨基糖苷类 ⑥喹诺酮类、磺胺类

44 （二）抗菌药物的主要作用机制 影响细胞壁合成: β-内酰胺类抗生素等。 影响细胞膜的功能：多黏菌素、两性霉素B等。 影响蛋白质的合成：
①作用于核糖体30S亚基 ②作用于核糖体50S亚基 影响核酸代谢

45 四、病毒感染的治疗 （一）抗病毒化学制剂 1.核苷类似物：
①无环鸟苷（阿昔洛伟）、丙氧鸟苷（庚昔洛伟）、喷昔洛伟：用于HSV感染引起的单纯疱疹、生殖器疱疹及带状疱疹。 ②阿糖腺苷：用于HSV、VZV、CMV、HBV感染及HSV引起的角膜炎。

46 ③病毒唑（3’-氮唑核苷）：用于流感病毒和呼吸道合胞病毒的治疗。
④碘苷（疱疹净）：用于疱疹病毒引起的角膜炎。 ⑤叠氮胸苷 (Azidodeoxythymidine, AZT)、拉米夫啶：为HIV逆转录酶抑制剂。

47 核苷类药物的作用机制： ①抑制病毒基因复制： a.模拟核苷成分掺入病毒基因组； b.竞争病毒复制酶。 ②抑制病毒基因转录。

48 2.非核苷类逆转录酶抑制剂：奈非雷平 3．蛋白酶抑制剂：沙奎那韦瓦、英地那韦 4．其他：金刚烷胺、乙基金刚烷胺。 抑制病毒的穿入与脱壳。

49 干扰素 干扰素诱生剂 中草药 IL-12、TNF等

50 siRNA（small interfering RNA）
(四)抗病毒基因治疗 反义寡核脱氧核酸（asODN） 反义寡核苷酸（asON） 核酶（ribozyme） siRNA（small interfering RNA）

51 机理： 1、与病毒关键基因结合，阻抑病毒DNA的复制 与RNA的转录； 2、与靶基因的mRNA互补结合，阻碍病毒mRNA
与核糖体结合 阻抑转译病毒蛋白

52 3、反义RNA与病毒的mRNA结合形成二聚体，
易被核酸酶水解而被降解 间接阻断病 毒蛋白质的合成 4、与mRNA对应的正义RNA和反义RNA组成的 双链RNA(dsRNA)导入细胞，可以使mRNA发 生特异性的降解，导致其相应的基因沉默。

53 主要问题: 合成反义RNA或DNA、核酶等所需成本费较高。 制剂不稳定，易被核酸酶降解。 如何使制剂能有效地到达靶细胞内的病毒基因。
迄今，被批准进入临床研究的只有针对抗巨细胞病毒的反义核酸，局部用于巨细胞病毒感染的脉络膜炎及视网膜炎。

54 咪康唑 五、真菌感染的治疗： 局部治疗: 咪康唑霜、克霉唑软膏等局部涂搽 全身用药治疗: 口服/静脉用抗真菌药，两性霉素B、制霉菌素、咪康唑、酮康唑、氟康唑和伊曲康唑等 伊曲康唑 但较难根治，易复发。 2％酮康唑

55 第四节 特异性预防与治疗 思考题： 一、特异性预防的制剂种类有哪些？ 二、抗病毒制剂的种类及其作用机制？