第四章 电泳技术.

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1 第四章 电泳技术

2 第一节 概 述 电泳的定义 带电颗粒在电场的作用下，向着与其电性相反的电极方向移动，这种现象称之为电泳(electrophoresis，简称EP)。 电泳技术就是根据各种带电粒子在电场中迁移速度的不同而对物质进行分离的一类实验技术。

3 电泳技术的发展过程 1809年俄国物理学家Peнce发现电泳现象。他用光学方法观察到在电泳迁移过程中血清蛋白质界面的移动，首先证明了血清是由白蛋白、α1、α2、β和γ球蛋白组成的，为表彰他对电泳技术所做出的突出贡献，1948年他被授予诺贝尔奖。 1937年瑞典的Tiselius建立了分离蛋白质的界面电泳。

4 20世纪50年代，以支持介质为主的电泳模式不断涌现，如滤纸、醋酸纤维素薄膜、淀粉薄膜等。
60年代以后发展了以凝胶为主的支持物的电泳方法，如聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶电泳等。 1967年在凝胶电泳的基础上建立了SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳技术。 70年代以后根据不同需要推出了多种电泳模式，如圆盘电泳、垂直板电泳、双向电泳、脉冲电泳、等电聚焦电泳、印迹转移电泳等技术。

5 90年代又推出了分辨率极高的高效毛细管电泳。多年来科学家们对电泳结果的分析做了大量的工作，建立了各种实验方法，电泳后对分离物质可以用染色、扫描、紫外吸收、放射自显影、生物活性测定等方法进行分析，得到所需数据。

6 电泳技术的应用： 1、小分子物质的分离分析 2、蛋白质、核酸、酶，甚至病毒与细胞的研究。
(主要用于物质性质的研究、种类的鉴定、分离纯化、纯度的分析等。) 电泳技术已成为生物化学、分子生物学、医学、药学、农业、食品、卫生、环保等学科不可缺少的重要工具。

7 电泳的常用术语 (1)电泳迁移(electrophoretic migration)： 在电泳过程中，带电粒子在电场的作用下做定向移动，单位是cm。 (2)迁移时间(migration time)：用tm表示 在电泳过程中，带电粒子在电场的作用下做定向移动所用的时间，单位是min。 (3)电泳速度(electrophoretic velocity)：用Vep表示在单位时间内，带电粒子在电场的作用下做定向运动的距离，单位是cm /sec。

8 (4)电场强度(electric field strength)：用E表示
在给定的电泳支持物两端电极施加电压后所形成的电效应，单位是 V/cm。 E = V /Lt 式中V为电压，Lt为两端电极的距离。

9 (5)电渗流(electroosmotic flow)：用EOF表示
在电场中电泳溶液的正电荷与固体支持物表面上的负电荷之间相互作用，形成一个正离子层，导致流体朝负极方向移动，称为电渗流，这种现象也称之为电渗(electroosmosis)现象,如图。 A B

10 电渗流迁移速度(Vep)的表达式为： εξ 电渗流迁移速度Vep = —————  E 4πη 式中为电解常数，为支持物与表面平切面的Zeta电势，为缓冲液粘度，E为电场强度。 通常情况下，电渗流总是由正极向负极移动，只有在特殊情况下如分离碱性蛋白质的阴极电泳时溶液pH较低，固体支持物表面带正电荷，形成向正极移动的电渗流。电渗流的大小受到Zeta电势，偶电层厚度和缓冲液粘度等因素的影响，直观地看电渗流随着电解质浓度的增加而增加，随着pH值的增加而加大。

11 (6)相对迁移率(relative mobility)：用mR表示蛋白质样品的迁移距离与示踪染料的迁移距离之比即为相对迁移率，即
蛋白质的迁移距离(cm) mR = ————————————— 示踪染料的迁移距离(cm)

12 一、电泳的基本原理 各种物质由于所带净电荷的种类和数量不同，因而在电场中的迁移方向和速度不同。利用物质的这种性质可以对物质进行分离和鉴定。 生物大分子如蛋白质、核酸、多糖等常以颗粒分散在溶液中，它们的净电荷取决于溶液终的H+浓度。

13 带电的颗粒在电场中移动时，受到两种力的作用：
1、电场 (F1)，它能使带电粒子移动。 2、移动的粒子和溶液介质之间产生的摩擦力(F2)。 两种力的公式如下： Fl=q· E (1) 式中 q：粒子所带的净电荷；E：电场强度。 F2=f· V (2) 式中 f：摩擦系数；V：粒子的运动速度。

14 对于一个球形质点，根据Stokes定律 f =6πηγ 故在电场中运动的粒子，其所受到的电场力和摩擦力相平衡，即 q·E=6πηγ·V (3) V（F’）= q·E / 6πηγ (4) 从公式(4)可以看出，粒子在电场中运动的速度和它所带的净电荷及电场强度成正比，和溶液的粘度与粒子的大小成反比。 但在凝胶中，这种阻力并不完全符合Stocks定律。F’还取决于介质中的其它因素如凝胶厚度、颗粒大小和介质的内渗等。

15 当带电颗粒达到稳态运动时，F=F’，由上式推导出：
v Q ——— = ———— （5） E πr η 不同的带电颗粒在同一电场中运动速度不同，其泳动速度用迁移率（或称泳动度）m来表示，定义为在电位梯度E(V/cm)的影响下，颗粒在时间t(s)中迁移距离d(cm)，即在单位电场强度(1 V/cm)时的泳动速度。

16 即 (6) 式中 L：粒子的迁移距离；t：泳动时间；E：电场强度。 将(5)代入(6)，得到 Q m = ———— (7) 6πr 由上式可看出电泳迁移率与球形分子、介质粘度、颗粒所带电荷有关。在确定的条件下，某物质的迁移率为常数，是该物质的物化特性常数。从(6)式可以导出迁移率的单位是cm2·s-1·V-1。

17 二、影响颗粒电泳迁移率的因素 （一）缓冲液 1、缓冲液的 pH 缓冲液的pH决定被分离物质的解离和带电性质、状态，因而会影响迁移率和分离效果。 例如：若溶液pH＜pI，则蛋白质带正电荷，在电场中向负极移动。若溶液pHpH＞pI，则蛋白质带负电荷，向正极移动。溶液的pH离pI越远，质点所带净电荷越多，电泳迁移率越大。因此在电泳时，应根据样品性质，选择合适的pH值缓冲液。

18 缓冲液的离子强度一般以0.05～0.10mol/L浓度为宜。
2、缓冲液的离子强度 缓冲液的离子强度一般以0.05～0.10mol/L浓度为宜。 离子强度低，产热少，电泳快，区带明显扩散。 离子强度高，区带尖锐，泳动距离短，产热多。

19 缓冲液中的离子浓度增加会引起质点迁移率的降低。
其原因是带电质点吸引相反电荷的离子聚集其周围，形成一个与运动质点相反的离子电荷层，离子层不仅降低质点的带电量，同时增加质点前移的阻力，甚至使其不能泳动。 离子浓度过低，会降低缓冲液的总浓度及缓冲容量，不易维持溶液的pH值，影响质点的带电量，改变泳动速度。 离子的这种障碍效应与其浓度和价数相关。

20 (二)电场 粒子在电场中的移动速度，与电势梯度（电场强度）成正比。
电场强度越高，电泳速度越快，但随着电压的增加，电流加大，产生热效应，易使蛋白质变性而改变性质影响电泳。

21 电场中因施加的端电压不同，分为常压和高压电泳。
常压电泳： 一般在500V以下，电势梯度约为10～20V/cm； 高压电泳： 一般在500V以上，电势梯度约为20～200V/cm。高压电泳会产生大量的热，所以高压电泳仪有配套的冷却装置和安全防护装置。

22 (三) 电渗 （electro-osmosis）
在电场作用下，液体对于固体支持物的相对移动称为电渗。 其产生的原因是固体支持物多孔，且带有可解离的化学基团，因此常吸附溶液中的正离子或负离子，使溶液相对带负电或正电。

23 固相 - + ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ 液相 电渗流 电渗示意图

24 支持介质种类很多，对电泳行为的影响各异。一般选用惰性材料，并不影响粒子在电场中的迁移率。但有的支持介质仍对样品有吸附和滞留作用，如纸电泳，这会造成分离物的拖尾现象，影响分辨率。电渗作用影响较大的有纸电泳，淀粉胶电泳，毛细管电泳等。

25 三、电泳的类型 （一）按是否用支持物分为：
1、用支持体的电泳技术： （1）纸上电泳 （2）醋酸纤维薄膜电泳 （3）薄层电泳 （4）非凝胶性支持体区带电泳 （如：淀粉，纤维素粉，玻璃粉，硅胶等） （5）凝胶支持体区带电泳 （聚丙烯酰胺凝胶 ，琼脂（糖）凝胶 ）

26 2、不用支持体的电泳技术： （1）Tiselius或微量电泳 （2）显微电泳 （3）等电点聚焦电泳技术 （4）等速电泳技术 （5）密度梯度电泳

27 （二）按电泳类型的性质分为：

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29 按分离原理分类 (1)区带电泳(zone electrophoresis，ZEP)： 是在半固相或胶状介质上加一个点或一薄层样品溶液，然后在介质上加电场，带电颗粒在支持介质上或支持介质内迁移，在电泳过程中，不同的离子成分在均一的缓冲液系统中分离成独立的区带，这是当前应用最广泛的电泳技术。

30 (2)移界电泳(moving boundary electrophoresis，MBEP)：
是把电场加在生物大分子溶液和缓冲溶液之间的界面上，带电颗粒的移动速度通过光学方法观察界面的移动来测定。

31 (3)稳态电泳(steady state electrophoresis)：
带电颗粒在电场作用下电迁移一定时间后达到一个稳定状态，此后，电泳条带的宽度不随时间的变化而变化，如等速电泳(isotachophoresis，ITP)、等电聚焦电泳(isoelectric focusing，IEF)。

32 a 区带电泳 b 移界电泳 c 等速电泳 d 等电聚焦
图3-2 各种电泳分离原理示意图 a 区带电泳 b 移界电泳 c 等速电泳 d 等电聚焦

33 四、电泳系统 电泳仪及附属设备 电泳仪作为实验室的常规小型仪器，种类很多。随着科学技术的不断发展，电泳仪器的分析对象也越来越专门化，分辨率越来越高，操作越来越简单，性能越来越稳定。凝胶电泳系统主要包括电泳仪、电泳槽及附属设备三大类。

34 1、电泳仪： 根据电泳仪的电压设计范围可将其分为三类： (1)常压电泳仪(600V)：用于净电荷和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳； (2)高压电泳仪(3000V)：用于载体两性电解质等电聚焦电泳和DNA测序； (3)超高压电泳仪( V)：用于毛细管电泳。

35 电泳仪

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37 2、电泳槽： 根据电泳种类不同，对电泳槽的设计也不一样。电泳槽主要有自由界面电泳槽、管状电泳槽、板式电泳槽。 (1)自由界面电泳槽 Tiselius设计的自由界面电泳槽是一个U形玻璃管，在U形管下部放待分离的蛋白溶液，管臂联接到电极上，在电场的作用下，缓冲系统中蛋白质界面的移动可用光学系统“纹影法(schlieren)”照相，得到电泳图谱。这种电泳槽目前已不使用。90年代初发展起来的高效毛细管电泳就是根据自由界面电泳槽的原理而设计的。

38 电极 U形管 Tiselius自由界面电泳装置示意图

39 (2)管状电泳槽 50年代末商品圆盘电泳槽问世。圆盘电泳槽有上下两个电泳槽和带有铂金电极的盖，上电泳槽具有若干个孔，可插电泳管。将丙烯酰胺凝胶贮液装在玻璃管内，凝胶在电泳管中聚合成柱状胶条，样品经电泳分离，蛋白区带染色后呈圆盘状，因而称圆盘电泳(disc electrophoresis)。

40 圆盘电泳槽

41 (3)板状电泳槽 板状电泳槽是目前使用最多的电泳槽，是将凝胶灌装在两块平行的玻璃板中间，因而称板状电泳(slab electrophoresis)。 板状电泳的最大优点是包括标准相对分子质量蛋白在内的多个样品可在同一块凝胶上在相同的条件下进行电泳，便于利用各种鉴定方法，直接比较各样品的区带，保证结果的准确可靠；还可进行双向电泳。另外，板胶电泳时产生的热量容易消散，凝胶电泳结果便于照相和制成干胶。板状电泳槽有垂直板电泳槽和水平板电泳槽。

42 垂板电泳槽

43 转移电泳槽

44 平板电泳槽

45 双向电泳槽

46 制备电泳槽

47 琼脂糖电泳槽

48 垂直板电泳槽

49 DNA序列分析电泳槽

50 DNA回收电泳槽

51 3、附属设备 随着电泳技术的发展，电泳技术的种类逐渐增加，凝胶电泳在制胶、电泳系统的冷却、凝胶染色及结果分析等方面手段日趋完善，科学家们研制出各种电泳附属设备，如梯度混合仪、外循环恒温系统、脱色仪、凝胶干燥系统、凝胶扫描仪、凝胶成像仪等。

52

53 紫外分析仪

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55 五、电泳的操作模式 目前最常用的电泳操作模式是区带电泳中的聚丙烯酰胺凝胶电泳和琼脂糖凝胶电泳，前者主要用于蛋白质的分离鉴定，后者主要于核酸的分析鉴定。电泳的操作模式有按操作方式和分离原理分类。

56 （一）按电泳方式分类 (1)端电极电泳：有垂直式和水平式两种方式，多用于蛋白质电泳。 (2)搭桥电泳：为水平式，水平板状电泳槽形式多样，凝胶和缓冲液通过间接接触的方式，如用滤纸桥搭接，用缓冲液制作的凝胶条或滤纸条搭接，后两者即半干技术，多用于免疫电泳、等电聚焦。 (3)潜水电泳： 为水平式，电泳时凝胶浸于缓冲液中，多用于核酸电泳。

57 A B C 图4 水平板状电泳中凝胶与缓冲液的接触方式 A 滤纸桥 B 凝胶条 C 滤纸条

58 （二）按分离原理分类 1、净电荷聚丙烯酰胺凝胶电泳； 2、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳； 3、聚丙烯酰胺梯度凝胶电泳； 4、聚丙烯酰胺凝胶双向电泳； 5、聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦； 6、聚丙烯酰胺凝胶转移印迹电泳； 7、琼脂糖凝胶水平电泳； 8、琼脂糖凝胶脉冲电泳； 9、琼脂糖凝胶免疫电泳。

59 六、凝胶电泳的支持介质 （一）支持介质的性质 采用支持介质进行电泳的目的是防止在电泳过程中分子的对流和扩散，使被分离物质得到更有效的分离。支持介质应当具备以下特性： (1)物理化学性质稳定：在电泳过程中不受环境因素的影响，保持原有的状态和性能。 (2)化学惰性：在电泳过程中不与缓冲系统中的各种离子和待分离的生物大分子发生化学反应，不干扰生物大分子的电泳过程。 (3)分布均匀：内电渗小，结果重复性好

60 （二）支持介质的分类 电泳的固体支持介质可以分为两类: 1、薄膜类： 薄膜类包括纸类，醋酸纤维素薄膜，聚酰胺薄膜等. 这类支持介质化学惰性好，在电泳过程中产生的对流和扩散较小，分离的基本原理主要是基于生物大分子的电荷密度。

61 2、凝胶类：凝胶类包括淀粉凝胶，琼脂糖凝胶，聚丙烯酰胺凝胶等。
这类介质相对薄膜类又了进一步，它具有高粘度和高摩擦阻力，它在电泳过程中不仅能防止对流，减小扩散，还具有凝胶的多孔性，孔径与蛋白质分子大小大致相同，因而能产生分子筛效应(molecular sieving effect)，其分离作用既与电荷密度有关，又与分子大小有关，因而凝胶的分离原理是基于大分子的电荷密度和分子大小，对分离不同相对分子质量的生物大分子极为有利。所以，生物大分子如蛋白质和核酸电泳多采用凝胶类介质。淀粉凝胶由于质量难以控制，操作繁琐，分辨率低，实验室中已很少使用，现在用得最多的是聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶。

62 凝胶支持介质 （一）聚丙烯酰胺凝胶 1、聚丙烯酰胺凝胶的特性 聚丙烯酰胺凝胶(polyacrylamide gel)是由单体(monomer)丙烯酰胺(acrylamide，简称Acr)和交联剂(crosslinker)N,N’-甲叉双丙烯酰胺(N,N’-methylenebi sacrylamide，简称Bis)在催化剂和加速剂作用下聚合交联而成的三维网状结构的凝胶。用此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophorsis，简称PAGE)。聚丙烯酰胺凝胶用于电泳的支持介质，与其它凝胶相比，聚丙烯酰胺凝胶具有以下优点：

63 (1)孔径大小与生物大分子具有相似的数量级，具有良好的分子筛效应。根据待分离大分子的相对分子质量，通过改变凝胶浓度及交联剂度来调节凝胶的孔径，使大分子得到较好的分离。
(2)在一定浓度范围内，凝胶透明，有弹性，机械性能好 (3)凝胶是由—C—C—C—C—结合的酰胺类多聚物，侧链上具有不活泼的酰胺基，没有其它带电基团，所以凝胶性能稳定，电渗作用小，无吸附，化学惰性强。与生物大分子不发生化学反应，电泳过程中不受温度、pH的变化的影响。

64 (4)具有高分辨率和灵敏度，尤其是在不连续电泳系统中，集浓缩、分子筛和电荷效应为一体，样品不易扩散。并有多种染色方法提高电泳条带显色的灵敏度，分离蛋白质的灵敏度可达10-6g。
(5)单体纯度高，在相同的实验条件下，电泳结果具有很好的重复性。

65 (6)凝胶杂质少，在很多溶剂中不溶，可适用于少量样品的制备，不致污染样品。
以聚丙烯酰胺凝胶为支持物发展起来的电荷聚丙烯酰胺凝胶电泳、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、聚丙烯酰胺梯度凝胶电泳、等电聚焦及双向电泳等电泳技术，不仅能分离、小量制备生物大分子，而且可以用来研究生物大分子的性质如电荷、相对分子质量、等电点以及构象等。

66 (1)AP-TMTED催化体系：属于化学聚合作用，TMTED是一种脂肪族叔胺，分子式为
（二）聚丙烯酰胺凝胶的聚合方式 聚丙烯酰胺凝胶聚合机理是通过提供氧游离基(free radicals)的催化，使体系发生氧化还原作用(catalyst-redox systems)来完成的。催化体系主要有化学催化（AP—TEMED）和光化学催化（核黄素——TMTED）体系。 (1)AP-TMTED催化体系：属于化学聚合作用，TMTED是一种脂肪族叔胺，分子式为 H3C\ /CH3 N(CH2)2N H3C/ \CH3

67 它的碱基可催化溶液中的AP使其形成游离氧自由基，激活Acr单体形成单体长链，同时在交联剂Bis的作用下长链彼此交联聚合成凝胶，反应式如下：
·TEMED催化AP生成硫酸自由基： S2O82－ → 2SO4·¯ ·硫酸自由基的氧原子激活Acr单体并形成单体长链：

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69 Bis将单体长链间连成网状结构：

70 聚合反应受各种因素的影响，如系统中催化剂和加速剂的浓度、pH、温度、分子氧和杂质都会影响凝胶的聚合过程。
(2)核黄素-TEMED催化系统：属于光聚合作用，聚合原理是核黄素在光照条件下分解，被还原成无色核黄素，后者在有少量氧的条件下，被氧化形成自由基，从而引发聚合反应。

71 （三）凝胶总浓度及交联度与凝胶的性质： (1)   凝胶总浓度与凝胶特性： 凝胶溶液中单体和交联剂的总浓度和两者的比例是决定聚丙烯酰胺凝胶特性，包括其机械性能、弹性、透明度、粘着度及孔径大小的主要参数。1962年引入两个计算公式，即凝胶总浓度（T）是表示凝胶溶液中单体和交联剂的总百分含量 a+b T = ———×100% m 交联度（C）是表示凝胶溶液中交联剂占单体和交联剂总量的百分含量。

72 b C = ———×100% a+b 式中，a为丙烯酰胺单体的质量(g)，b为交联剂N,N’-甲叉双丙烯酰胺的质量(g)，m为溶液的终体积(ml)。 凝胶a、b的比例是很重要的，决定了凝胶的物理性状。 当a:b小于10时，凝胶脆且硬，不透明，呈乳白色； 当a:b大于100时，即使用5%的丙烯酰胺凝胶也呈糊状； 通常用a:b在30左右，并且丙烯酰胺浓度高于3%，凝胶富有弹性并且透明。

73 (1)   凝胶总浓度及交联度对孔径的关系： 聚丙烯酰胺凝胶的有效孔径取决于凝胶的总浓度T和交联度C。 有效孔径随着T的增加而减小，电泳中带电颗粒移动时受到网孔的阻力大，反之带电颗粒受到的阻力小。 当凝胶总浓度小于2.5%时，可以筛分相对分子质量为106以上的大分子，但此时凝胶几乎是液体，通常要加0.5%的琼脂糖来增加凝胶的硬度而不影响凝胶的孔径大小； 当凝胶浓度大于30%时，则可以筛分相对分子质量小于2kD的多肽, 在凝胶总浓度一定时，交联剂含量不同影响凝胶的孔径，交联剂的含量与不同凝胶浓度平均孔径之间的关系见表3-1：

74 表3-1 Bis的含量与不同凝胶浓度平均孔径之间的关系
总凝胶浓度 (%) 平均孔径(Å) Bis占总凝胶的百分数 1 5 15 25 6.5 24 19 28 — 8.0 23 16 36 10.0 14 20 30 12.0 17 9 15.0 7

75 从表中可以看出，当Bis占总凝胶浓度5%时，凝胶的平均孔径在各凝胶浓度时均最小，高于或低于5%时孔径相应变大。
凝胶孔径大小也受凝胶总浓度的影响，一般凝胶总浓度越高，凝胶孔径越小。凝胶孔径大小有一定范围，每次制备凝胶时所得到的有效孔径不完全相同。

76 (2)凝胶总浓度与凝胶的分子筛效应： 凝胶的三维网状结构具有分子筛效应，在凝胶中生物大分子的分离取决于它的净电荷和分子大小。分子筛效应的大小取决于凝胶孔径大小与生物大分子大小相接近的程度。凝胶浓度不同，平均孔径也不同，不同大小和形状的大分子通过孔径时所受的阻滞力也不同，加上大分子的电荷效应，使各种大分子迁移率不同得以分离。

77 在实际工作中，常依据待分离蛋白质已知相对分子质量的大小来选择所合适的凝胶浓度，使蛋白质混合物得到最大限度的分离，表3-2列出了蛋白质相对分子质量与凝胶浓度的关系。大多数蛋白质在7.5%凝胶中能得到满意的结果，所以这个浓度的凝胶称为标准胶。当分析一个未知样品时，常用标准胶或梯度凝胶来测试，而后确定适宜的凝胶浓度。

78 表3-2 蛋白质相对分子质量与凝胶浓度的关系 蛋白质相对分子质量范围(kD) 适用的凝胶浓度（T%） ＜10 20—30 10—40
表3-2 蛋白质相对分子质量与凝胶浓度的关系 蛋白质相对分子质量范围(kD) 适用的凝胶浓度（T%） ＜10 20—30 10—40 15—20 40—100 10—15 100—500 5—10 ＞500 2—5

79 （二）琼脂糖凝胶 1、琼脂糖凝胶的特性 琼脂糖(agarose)是从琼脂中精制出来的胶状多糖(gel-forming polysaccharide)，琼脂又是从天然的红色的墨角藻(red-seaweed)中提取出来的。琼脂含有两种多糖，即琼脂糖和琼脂胶，从琼脂胶中脱去硫酸酯基和丙酮酸酯基就可获得琼脂糖。琼脂糖的分子结构大部分是由1,3连接的-D吡喃半乳糖和1,4连接的3,6脱水-D吡喃半乳糖交替而成。

80 (1) 琼脂糖凝胶属于大孔胶，可以分析107的大分子，但电泳分辨率低于聚丙烯酰胺凝胶电泳。这种大孔特性有利于免疫固定、免疫电泳和微量制备。琼脂糖形成凝胶后孔径的大小取决于琼脂糖百分浓度，如表3-3；
表3-3琼脂糖凝胶的浓度与孔径的关系 琼脂糖(%) 孔径(nm) 0.075 800 0.16 500 1.0 150 2.0 20

81 (2)具有稳定的物理化学性质，对样品吸附极小，电泳图谱清晰，分辨率高，重复性好；
(3)具有较高的机械强度，允许在1%或更低的浓度下使用，且在这种浓度下仍然有筛分和抗对流作用； (4)琼脂糖无毒，具有热可逆性，胶凝过程不需催化剂，制备简单、快速。低胶凝温度及低熔点的琼脂糖有利于样品回收，达到样品制备的目的； (5)琼脂糖凝胶电泳操作简单，电泳速度快，染色、脱色程序简单快速；

82 2、琼脂糖凝胶的主要性能指标： (1)电内渗(electroendosmosis，简称EEO)：是琼脂糖电泳中由多糖骨架上的带电基团引起，主要是硫酸酯和丙酮酸盐，这些阴离子基团被固定在介质中，相应的阳离子与其结合水一起向阴极移动（图3-6），电内渗对DNA的分离没有显著影响，但高电内渗时对大分子的迁移有一定阻碍作用，电泳耗时较长。

83 (1) 胶凝温度：将琼脂糖在溶液中加热至90℃溶解，然后将温度下降至某一温度时由液态转变为固态，此温度即为凝固点，称为胶凝温度。一般在35℃—43℃。
(3)熔化温度：将凝固的凝胶由固态转变为液态时的温度即熔化点，称为熔化温度。一般在75—90℃。用于制备目的时，采用低熔点琼脂糖，熔化温度需低于30℃，

84 (4)凝胶强度：定义为每平方厘米凝胶所能承受的重量(g /cm2)，凝胶强度与凝胶浓度成正比。凝胶强度越高，所能允许使用的凝胶浓度越小。在电泳中通常使用1%的琼脂糖凝胶。尿素和碘化钾等阻碍氢键形成的试剂也会降低凝胶强度，使凝胶变软易碎，给操作带来困难。 (5)脱水收缩作用：是指琼脂糖凝胶中挤压出液体的现象，使用时要用滤纸吸干凝胶表面的水。

85 3、琼脂糖凝胶电泳在核酸研究中的应用： 由于琼脂糖凝胶孔径相当大，对大多数蛋白质来说，其分子筛效应微不足道。以琼脂糖凝胶为支持介质的电泳已广泛应用于核酸研究中，为DNA分子及其片段的相对分子质量测定和DNA分子构象的分析提供了重要手段。琼脂糖对DNA的分离范围较广，用不同浓度的琼脂糖凝胶可以分离长度为200bp至50kb的DNA。从表3-4中可以看到凝胶的浓度越低，适用于分离越大的DNA。

86 表3-4 不同琼脂糖凝胶浓度与分离DNA大小范围的关系
琼脂糖凝胶浓度(%) 线性DNA分子的有效分离范围(kb) 0.3 5—60 0.6 1—20 0.7 0.8—10 0.9 0.5—7 1.2 0.4—6 1.5 0.2—4 2.0 0.1—3

87 3、新型凝胶介质 虽然聚丙烯酰胺和琼脂糖凝胶是目前最常用的两种支持介质，但是它们还存在一定的局限性，如聚丙烯酰胺凝胶聚焦的重复性较差，琼脂糖凝胶容易断裂等。近年来人们正在寻求新型的电泳材料。 第一类：N-取代聚丙烯酰胺材料：

88 具有较强的水解稳定性，在较广的pH范围内稳定，能在pH2—13环境中进行电泳，适合作为酸碱性pH范围等电聚焦的支持介质；
具有高度的亲水性和大孔性，适合大相对分子质量物质的分离；凝胶的机械强度高。

89 第二类：聚丙烯酰胺—琼脂糖混合物(Polyacrylamide-agarose mixture)、聚丙烯酰胺—琼脂糖的衍生物混合物(polyacrylamide-allylglycidyl mixture)，这类电泳支持介质具有以下优点： 具有聚丙烯酰胺分辨率高和琼脂糖大孔径的优点，机械强度高，又具有良好的弹性，适合分离特大分子(2500kD)，可用于病毒、SDS变性分子和高相对分子质量的脂蛋白

90 第三类：“电泳海绵”，是一些海绵状的支持介质材料，还处于试验阶段，但它与聚丙烯酰胺和琼脂糖相比具有很多优点：
机械强度大，结构稳定，可以是亲水的也可是疏水的； 可以直接测量孔径，孔径范围在nm—100μm；

91 七、蛋白质染料 用染料和生物大分子结合形成有色的复合物是电泳后检测最常用的方法。 选择高吸光系数的染料，与生物大分子紧密结合，形成有色不溶的复合物，而支持介质不吸附染料，便于背景的脱色，有利于蛋白质条带的辨别和定量扫描，从而检测出蛋白质的纯度、含量及生物活性。 可用于蛋白质电泳条带的染色方法很多，常用的主要有以下几种：

92 （一）氨基黑类染色： 蛋白质染色最早是用氨基黑类染料，是一类含有磺酸基的酸性染料，它通过磺酸基与蛋白质的碱性基团形成复合盐。常用的有： 氨基黑10B(amino black 10B) 萘黑12B 200(naphthalene black 12B 200) 萘酚篮黑6B(naphthol 6B) 水牛黑(buffalo black)等。

93 这类染料对不同的蛋白质着色不同，有蓝色、棕色、黑色，借此可以鉴别不同类型的蛋白质。
这类染料对不同的蛋白质结合量不同，染色不均一和高背景影响蛋白质的定量。染色灵敏度较低，现在这类染料已很少应用，被灵敏度较高的考马斯亮蓝所代替。

94 （二）考马斯亮蓝(coomassie brilliant blue，简称CBB)
在蛋白质染色中，目前考马斯亮蓝染色法最为常用，1965年考马斯亮蓝应用于聚丙烯酰胺凝胶染色，它步骤简便、灵敏度较高，可进行定量扫描。它可分为R和G型两类： R型为三苯基甲烷(triphenylmethane)，每个分子含有两个SO3H基团，本身偏酸性，磺酸基与蛋白质的碱性基团结合形成染料—蛋白质复合物。 G型为二甲花青亮蓝(xylene cyanine brilliant blue)，是一种甲基取代的三苯基甲烷。

95 考马斯亮蓝R-250是通过范德瓦尔键与蛋白质结合，尤其适用于SDS电泳微量蛋白质染色。它与不同蛋白质结合呈现出基本相同的颜色，并且在比较宽的范围内（15—20 g），扫描峰的面积与蛋白量呈线性关系。
考马斯亮蓝G-250染色灵敏度不如R-250，其优点是在三氯乙酸中以胶体形式存在，能选择性地和蛋白质形成复合物，染色迅速，着色深的蛋白质区带在数秒内即可显现出来，约45分钟后着色最深，本底低，重复性好，适用于定量分析。

96 （三） 荧光染料： 是一种在电泳前用荧光分子将蛋白质共价偶联标记，于电泳后通过扫描来测定荧光区带的方法，但由于荧光标记蛋白质的定量需要特殊的扫描装置，影响了此方法的广泛应用。研究工作中使用的荧光染料有以下几种：

97 (1)磺酰氯(2,5-二甲氨基萘磺酰，dansyl chloride，简称DNS-Cl)：
是最早应用的荧光染料，它在碱性条件下与氨基酸、肽、蛋白质末端氨基酸发生反应，使它们获得荧光性质，在280nm和320nm波长的紫外灯下可观察到电泳条带。

98 (2)荧光胺(fluorescamine，又称fluram)：
作用与丹磺酰氯相似。在碱性条件下与氨基酸、肽、蛋白质末端氨基酸发生反应，产生荧光。其优点是由于自身及分解产物均不显示荧光，标记的蛋白质是唯一的荧光物质，因此，凝胶没有荧光背景。

99 (3)2-甲氧基-2,4-二苯基-3-呋喃酮[2-methoxy-2,4-diphenyl-3(2H)-furanone，简称MDPF]：
其作用与丹磺酰氯和荧光胺相似，其优点是凝胶上MDPF标记蛋白质的荧光可保持数月。用MDPF标记时，荧光强度在蛋白质浓度1—500ng范围内呈线性关系，标记蛋白做SDS-PAGE分析时，其相对分子质量的对数(log10)与相对迁移率之间呈线性关系。

100 (4)1-苯胺基-8-萘磺酸(1-amino-naphthal-sulfonic acid，简称ANS)：
染料本身无色，但与蛋白质结合后，在紫外光下可显出黄绿色荧光。电泳后将凝胶置于此染料溶液中，1—3分钟后在长波紫外光下即可观察到荧光蛋白条带。

101 （四）硝酸银染色： 目前染色机理尚不清楚，可能是将结合在蛋白质上的银离子还原成金属银而显色，研究表明蛋白质上碱性和含硫氨基酸在银染中的重要性，染色灵敏度是考马斯亮蓝R-250的100倍左右，可以检测0.38ng /mm2的牛血清白蛋白。银染显色的方法大致可以分化学显色和光显色两类。

102 (1)化学显色法(chemical development)：
又分为双胺银染法(diamine silver stains)和非双胺银染法(non-diamine silver stains)。 双胺法：是用碱性的NH4OH形成银—双胺复合物，固定后的凝胶浸泡在此溶液中，通过酸化（通常用柠檬酸）显像，使用较广泛。 非双胺法：是将固定的凝胶置于酸性的硝酸银溶液中，银离子与蛋白质发生作用，在碱性条件下，用甲醛将银离子还原为金属银而显像，用酸性溶液（柠檬酸或醋酸）终止显色反应，用碳酸钠处理凝胶可进一步增强银染色的强度。非双胺法的灵敏度较双胺法高10倍。

103 (2)光显色(photo development)：
显色反应是固定后的凝胶在酸性环境中用光能将银离子还原成金属银而使蛋白条带显色，它的优点是操作程序简单，使用一种染色溶液即可达到显色目的。

104 （五）特殊蛋白质染色: (1)糖蛋白染色：糖蛋白可以通过对蛋白或碳水化合物的染色来检测。如与糖链的反应，用过碘酸-Schiff试剂(periodic-Schiff’s reagent)染色，简称PAS染色，显色结果在543nm处可观测到颜色。检测灵敏度，最高可以达到40 ng糖蛋白。

105 (2)脂蛋白染色： 脂蛋白可以用常规的染色方法，苏丹黑B(sudan black)是常用的染料，银染法仍然是最灵敏的方法。近年有报道一种双染色方法，先用一种发荧光的染料Filipin使脂蛋白染色，再用考马斯亮蓝使其它蛋白染色，这样就可以在一块凝胶上同时检测出脂蛋白和其它蛋白，灵敏度高，可检测低至20 ng低密度脂蛋白。

106 (3) 铁蛋白染色：血红蛋白、转铁蛋白和其它含铁蛋白能用多种方法检测，如普鲁士蓝(prussian blue)显色，它与蛋白质分子中的铁离子结合，方法十分简便。
(4) 铜蛋白染色：可用茜素蓝S(alizalin S)显色，它与蛋白质分子中的铜离子结合，蛋白条带为蓝色。

107 （六） 酶活性染色 蛋白质经过电荷聚丙烯酰胺凝胶电泳后可以保持生物活性，包括酶活性，这就给同工酶的检测创造了条件。

108 （七）免疫学染色 免疫学方法是一种简单而且专一性的检测方法。将辣根过氧化物酶或放射性同位素标记的抗体用于免疫检测，经过酶与底物的显色反应，使与抗体免疫结合的蛋白条带清晰地显现出来。现在最常用的方法是凝胶电泳后通过电泳印迹将蛋白转移到固定化膜上，然后利用相应的抗体进行免疫检测。

109 ※染色 核酸：. 多用EB（菲啶溴红2. 3—二氨基，5—乙基，6—苯基菲啶溴盐）:可在0
※染色 核酸： *多用EB（菲啶溴红2.3—二氨基，5—乙基，6—苯基菲啶溴盐）:可在0.5μg/ml浸胶30分钟或直接将EB加在胶中→紫外照射产生橙色荧光→照相

110 丫啶橙：能区别单双链DNA或RNA sS-DNA(RNA):红色荧光 dS-DNA:绿色荧光 *放射自显影：32P标记。 蛋白：氨基黑10B、考马斯亮蓝R-250、考马斯 亮蓝G-250、银染 固定→染色→洗脱→干胶。

111 ※凝胶上样品的回收： * 低熔点琼脂糖法（LMＰ）62-65℃熔解胶 DNA不变性 *玻璃纤维过滤法：加KI、NaClO4、柠檬 酸钠，在一定温度下将胶熔解→玻璃纤维 过滤→超离心将胶与DNA分开。

112 八、凝胶电泳的 应用 分离纯化样品 测定分子量 组建物理图谱 鉴定重组体 分子杂交 测序 PCR检测 分子标记检测

113 第二节 电泳分析常用方法 一、纸电泳和醋酸纤维素薄膜电泳 （一）纸电泳 支持物：滤纸
第二节 电泳分析常用方法 一、纸电泳和醋酸纤维素薄膜电泳 （一）纸电泳 支持物：滤纸 应用：主要用于分离氨基酸、小分子肽、核苷酸、糖等低分子量的化合物。 缺点：电渗作用较强，会影响亲水性样品的迁移率。

114 操作： 1、点样：样品一般点在纸的中间。 2、电泳： 条件： 1）缓冲体系：采用吡啶-醋酸-水(1：10：89)。 2）电压：根据分离物的性质和电泳装置情况，一般高于20V/cm，甚至高达 V/cm。 3、干燥：电泳结束后切断电源，滤纸在100℃干燥5分钟。 4、显色：样品若为氨基酸和小肽，可用0.2％茚三酮，正丁醇溶液均匀喷雾，置100℃ 5分钟，观察茚三酮的紫色斑，并用铅笔勾划出各斑点位置。滤纸放置后，茚三酮的斑痕会褪色。

115 2、醋酸纤维素膜电泳 纤维素的羟基乙酰化形成的纤维素醋酸酯制成的薄膜称为醋酸纤维素薄膜。 优点： 1）对蛋白质样品吸附性小，消除纸电泳中出现的“拖尾”现象。 2）膜的亲水性较小，所容纳的缓冲液少，电泳时电流的大部分由样品传导，所以分离速度快，电泳时间短。 3）样品用量少，5μg的蛋白质可得到满意的分离效果。 4）醋酸纤维素膜电泳克服了纸电泳的电渗问题，分辨率高于纸电泳。

116 应用： 醋酸纤维素膜电泳主要用于大分子物质的分析，具有操作快捷简便、染色和脱色较易、背景清晰、区带分明、样品需要量少、介质又可以透明后定量扫描等优点，故很适合临床大批量分析诊断。

117 操作要点：　　 ①膜的预处理：电泳前须将膜置于缓冲液中浸透后，取出膜并用滤纸吸去多余的缓冲液（不可吸得过干）。 ②加样：样品用量依样品浓度、本身性质、染色方法及检测方法等因素决定。对血清蛋白质的常规电泳分析，每cm加样线不超过1μl，相当于60-80μg的蛋白质。 ③电泳：电压为25V/cm，电流为 mA/cm宽。

118 ④染色：一般蛋白质染色常使用氨基黑10B或丽春红，糖蛋白用甲苯胺蓝或过碘酸-Schiff试剂，脂蛋白则用苏丹黑或品红亚硫酸染色。
⑤脱色与透明：对水溶性染料最普遍应用的脱色剂是5％醋酸水溶液。为了长期保存或进行光吸收扫描测定，可浸入冰醋酸：无水乙醇＝30:70（V/V）的透明液中。

119 二、聚丙烯酰胺凝胶电泳 （一）凝胶浓度的选择 催化剂 丙烯酰胺+甲叉双丙烯酰胺 单体 交联剂 促进剂 催化剂：过硫酸铵 聚丙烯酰胺凝胶
单体 交联剂 促进剂 催化剂：过硫酸铵 促进剂：TEMED。 聚丙烯酰胺凝胶

120 聚合时，由单体丙烯酰胺聚合成链状物，由交联剂甲叉双丙烯酰胺将链与链交联成网状，形成立体的不溶于水的凝胶。
网状的大小，决定于丙烯酰胺单体的浓度和甲叉双丙烯酰胺的浓度及两者的比例。

121 C、T数值可以表示凝胶的机械性能、弹性、透明度。
式中 a：丙烯酰胺的量；b：甲叉双丙烯酰胺的量；m：溶液总体积

122 C表示交联剂所占的百分比。 T值越大，孔径越小，机械性能越强。在T不变而甲叉双丙烯酰胺浓度为5％时，凝胶孔径最小。
C较大时，如C为20％，凝胶为乳白状。因此可根据不同需要，选用不同的胶浓度，用于不同的分离目的。

123 表4-1 凝胶浓度的选择 被分离物质 被分离物的分子量 选用凝胶的参考浓度(％) 蛋白质 < ~30 （1~4）× ~20 4 ×104~ ~15 105~5× ~10 >5× ~5 核酸 < ~20 104~ ~10 105~2× ~2.6

124 （二）缓冲体系的选择 缓冲液的pH应偏离分离蛋白的等电点，使其处于最大电荷状态，使样品中各种蛋白质分子表现出最大的迁移率差异。 根据被分离物的等电点不同，缓冲液的pH分为中性、酸性和碱性。最常用的蛋白质分离体系为pH8.9的碱性缓冲体系，因为大多数蛋白质的等电点略偏酸性或中性，在pH8.9的碱性缓冲体系中带负电荷，向正极移动。 缓冲液的组成一般选用不与分离物发生作用的试剂。缓冲液的离子强度不能太高，否则会产生大量的热并使电泳时间拉长。一般选用的离子强度在0.01～0.1μmol/L间。

125 （四）聚丙烯酰胺凝胶电泳的应用 连续电泳体系： 指在整个电泳体系中的缓冲液， pH值和凝胶孔径大小相同，主要用于核酸分析。 不连续电泳体系： 电泳槽中的缓冲体系和pH值与凝胶中不同外，凝胶本身也由缓冲体系、pH值和凝胶孔径不同的两种凝胶堆积而组成。主要用于蛋白质样品的分离。

126 1、蛋白质分子的分离鉴定 （1）原理： 1964年Davis等首先使用不连续电泳体系分离血清蛋白质。体系： 分离胶：T为7％。C为2.5％，在pH8.9的0.125mol/L Tris-HCl缓冲液中聚合。 浓缩胶：T为3％， C为20％，在pH6.9的0.02mol/L的Tris-HCI缓冲液中聚合。 电泳槽缓冲液：为Tris-甘氨酸 pH8.3体系。

127 此体系： 三个不连续： 凝胶孔径、缓冲液pH值和缓冲液组成不连续。 三个效应： 电荷效应、分子筛效应和浓缩效应。

128 2、蛋白质分子量的测定 采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法。 原理： SDS (十二烷基硫酸钠) 是一种阴离子去污剂，在溶液中能与蛋白质分子的疏水部分定量结合，把大多数蛋白质拆成亚单位，并带上大量阴离子。这些阴离子掩盖了蛋白质分子本身所带的电荷差异，所以SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳消除了电荷效应，只有分子筛效应，故蛋白质电泳迁移率完全取决于分子量，迁移率与分子量的对数呈线性关系。

129 3、核酸的分析(非解离体系) 用于核酸分离的电泳方法有： 琼脂糖电泳：用于分离较大的核酸分子(200bp以上)，采用水平式，操作简单，分离范围广； 聚丙烯酰胺凝胶电泳：用于分离较小的核酸片段(5～500bp)。采用垂直式，程序稍繁，分辨率极高，可区分相差1bp的DNA片段，装载容量大，分离片段的纯度好。

130 4、核酸的序列测定 (解离体系) 采用解离体系的聚丙烯酰胺凝胶电泳，以尿素为解离剂。测序胶比较长而薄，一般为长30～50cm，厚0.2～0.4mm。

131 三、琼脂糖凝胶电泳 （一）在免疫分析中的应用 免疫电泳将免疫反应和电泳技术相结合，从而增加了分离和鉴定效果。免疫电泳有以下几种主要形式。

132 1、免疫电泳 是把电泳分离和免疫双扩散结合起来的一项技术。
首先将抗原物质在电场中进行分离，电泳结束后，沿电泳方向在距行进方向同等的距离 (0.5～1cm)处挖一长槽，放人适当稀释度的抗体。这样，电泳分离的抗原物质和长槽中的抗体可以在琼脂糖凝胶中进行扩散，并在抗原一抗体反应合适的地方产生沉淀弧。沉淀弧的位置和多少，取决于抗原的组成和量，也取决于抗体的特异性和效价。

133 2、交叉免疫电泳 这是一种双向电泳。 抗原物质经琼脂糖凝胶电泳分离，把第一相分离的含全部抗原的凝胶条转接到均匀混有一定浓度抗体铺板的琼脂糖凝胶上，在与第一相呈垂直的方向进行第二相电泳，已分离的抗原物质在含有抗血清的琼脂糖凝胶中泳动，遇到相应的抗体即边泳动边反应，直到抗原抗体量的比例达到最合适为止，生成抗原抗体结合沉淀线。这种沉淀线为一对称的峰型，峰的高度和面积与抗原的量成正比，故可据此对抗原进行定量分析。峰的数量，决定于抗原的组成和抗体的特异性。

134 3、免疫火箭电泳 免疫火箭电泳指抗原在含有一定浓度抗体的琼脂糖凝胶中电泳，随着抗原物质的迁移，与特异抗体发生反应，产生沉淀峰 (也称火箭)。随着电泳的进行，沉淀峰的端点伸展下去，趋于尖锐，走到一定距离后，峰不再伸展。抗原量与火箭峰的高度成正比，此法可用于定量分析，也可同时分析多个样品。

135 4、直线状免疫电泳 此法以产生线性沉淀线的形式比较、鉴定与标准抗体 (或抗原)相匹配的抗体 (或抗原)的性质、纯度和含量。 本法灵敏度高、操作容易、设备简单易行，故已成为免疫学研究的重要工具。

136 （二）在核酸分析中的应用 1．恒定电场强度下的琼脂糖凝胶电泳： (1) DNA的琼脂糖凝胶电泳： 琼脂糖凝胶可以制成不同大小的孔隙度，具有分子筛的效应，所以恒定场的琼脂糖电泳适于分离200bp～50kb的DNA片段，DNA片段的迁移率和分子大小及高级结构密切关系。 如质粒的电泳谱常可以看到几条带，这是因为质粒具有几种不同存在形式，若质粒经内切酶处理，则只有线性形式，其电泳迁移率仅和片段大小有关，迁移率与其片段大小的对数值存在线性关系。

137 1） 不同浓度琼脂糖凝胶的分离范围 琼脂糖浓度（%） 分离范围（kb）   ～60 ～20 ～10 ～7 ～6 ～3 ～2

138 2）琼脂糖凝胶电泳缓冲体系：有3种 TAE、TBE、TPE，其中最常用的是TAE，其次是TBE，双链线性DNA片段在TAE中比在TBE和TPE中迁移速度快，但TAE的缓冲容量小，不适于长时间电泳。 3）电泳条件： DNA样品从负极向正极移动。 电压一般控制在5V/cm的稳定电场中。

139 4）电泳结果观察： 电泳后凝胶用溴化乙锭溶液 (EB) 染色，在紫外灯下观察电泳行为。 溴化乙锭加入的办法有以下几种： ①放人样品缓冲液中，与样品共电泳； ②制备凝胶时，待溶化的琼脂糖溶液稍晾后，加入EB，使其浓度为0.5/μg/m1，混匀，迅速铺板； ③电泳后，凝胶浸在0.5μg/m1的EB溶液中染色。

140 (2)RNA的琼脂糖凝胶电泳 (变性胶) ： 用1×TBE配制适当浓度的琼脂糖溶液，待冷至60℃，加入36％的甲醛使其终浓度为17.85％，混匀后铺板。

141 2．脉冲场琼脂糖凝胶电泳： 原理：大分子DNA在电场作用下挤过孔径小于分子大小的凝胶时，将会改变无规卷曲的构象，沿电场方向伸直，与电场平行从而才能通过凝胶。此时大分子通过凝胶的方式均相同，迁移率无差别，不能分离。当电场方向改变时，电场内的DNA分子必须改变其构象，重新定向，沿新的泳动方向伸直，这样DNA分子在两个不同方向的均一或不均一电场中，不断随电场方向改变分子本身的构象，挤过凝胶。

142 其转向时间与其粘弹性弛豫时间有关，并显著地依赖于分子大小，DNA分子越大，这种构象改变需要的时间越长。DNA分子构象变换时间小于脉冲电场周期，DNA分子便可按其分子大小，得到较好的分离效果；反之，DNA分子变换时间大于脉冲电场周期，则凝胶中DNA分子松弛变形与电场更替时间不相符，故达不到分离目的。因此，分离大分子DNA的脉冲电场凝胶电泳的脉冲时间、电场梯度和变化的电场角度是很重要的，其中尤以电场角度为甚。

143 四、 等电聚焦 原理： 两性电解质的载体，在电场中可以形成一个连续的pH梯度。蛋白质具有多解离基团，在不同pH下处于不同的荷电状态。当周围环境的pH值低于蛋白质的等电点(pI)时，蛋白质呈正电性，在电场中向负极移动，在移动过程中，正电性逐渐减弱，直至零，此时蛋白质移到了pH等于pI的区域，不再移动。

144 反之，溶液pH高于蛋白质的等电点时，蛋白质呈负电性，在电场中向正极移动，最终也将停在pH等于pI处。只有当溶液的pH等于蛋白质的等电点，为电中性，蛋白质在电场中才不移动。利用蛋白质的这个性质，将其放在由两性电解质形成的pH梯度中，可以依不同蛋白质的等电点不同，达到分离的目的 应用：主要用于蛋白质的分离纯化、分析鉴定及性质研究。

145 五、细胞电泳 （一）细胞电泳法 细胞电泳法用显微镜直接观察在自由界面电泳中大小为1～50μm的细胞粒子的电泳速度，并计算细胞表面所带电荷的密度，以此研究细胞结构与功能的关系。

146 六、毛细管电泳 毛细管电泳，除具有一般的电泳迁移外，还受到毛细管电泳时电渗的影响。
毛细管电泳的电渗是指在高电压下，由偶电层中的水合阳离子引起的流体向负极方向的移动。所以毛细管内的粒子运动，受到两方面的作用：①电场的作用；②电渗流的作用。正离子迁移方向与电渗方向一致，所以正离子在毛细管内的迁移速度加快。

147 负离子迁移方向与电渗方向相反，离子的迁移速度，决定于泳动速度和电渗作用的大小。由于电渗流速一般远大于泳动流速，因此在毛细管电泳中，负离子也总是向负极移动。中性粒子的泳动速度为零，所以中性粒子随电渗而行。中性物质的速度可以用于测定电渗作用。

148 基本装置 电泳仪由下列几个基本部分组成： ①高压电源； ②两个电极槽； ⑧石英毛细管，分别浸在两个电极槽中，并充满和电极槽相同的液体； ④有紫外、荧光、喇曼光谱、电位、安培、质谱检测器或电导等监测系统。 常采用一些直接的柱头进样，如电迁移进样和流体动力学进样，这些方法简单易行。

149 （三）类型 毛细管自由溶液区带电泳(CZE) 毛细管凝胶电泳(CGE) 毛细管等电聚焦电泳(CIEF) 胶束毛细管电动力学色谱(MECC) 目前以CZE和MECC技术应用最广泛。。

150 实验三 DNA的琼脂糖电泳 一、原理 质粒DNA及微量DNA片段的浓度可与已知浓度的DNA同时进行电泳，根据结合的溴化乙锭荧光强度，估计其含量。

151 二、 仪器 紫外透射反射分析仪 电泳槽 电泳仪

152 三、试剂 6×上样缓冲液：0.25％溴酚蓝；40％(W／V)蔗糖。 10×TBE电泳缓冲液：0.89mol/LTris-硼酸； 0.02mol／L EDTANa2, pH8.3。 10×TAE 电泳缓冲液 ：取Tris24.2g，冰醋酸5.7ml，0.25mol/L EDTA (pH8.0)20ml，加蒸馏水至500ml。1×TAE为配制琼脂糖凝胶及其电泳的应用缓冲液。 0.8％琼脂糖：0.8％琼脂糖；100ml 1×TBE 5mg／mlEB：0.5gEB；100ml三蒸水

153 四、操作 1、灌胶 (1)用1×TBE电泳缓冲液配制0.8％琼脂糖凝胶。 (2)加热使琼脂糖熔化均匀，取出室温冷却至50-60℃。
(3)取一块电泳内槽，置水平台上，放一微型点样梳，点样梳底部离平板的距离为 mm。 (4)将凝胶小心倒入电泳内槽，待冷却后取出点样梳，保持点样孔的完好。（注意：不要形成气泡） （5）将带凝胶的内槽放入电泳槽中，凝胶点样端靠近负极。

154 打开电源开关，电压不超过5V／cm，一般40V，30-40分钟。当溴酚蓝染料移动至凝胶前沿约1cm处，切断电源，停止电泳。 4、检测
2、点样： (1)取DNA样品及DNA标准浓度各2ul加入6×上样缓冲液2ul，混匀（可在薄膜上）。 (2)在点样孔小心点样，记录样品点样次数与点样量。 3、电泳 打开电源开关，电压不超过5V／cm，一般40V，30-40分钟。当溴酚蓝染料移动至凝胶前沿约1cm处，切断电源，停止电泳。 4、检测 取出泳动后的凝胶板，EB 染色后，在紫外分析仪观察DNA区带。

155 注意： EB是DNA的诱变剂具极强的致癌性，配制和使用过程中要特别小心，操作时要戴手套，有EB的废液和器皿要分别处理好。

156 1.DNA相对分子量标准物（marker);
2.pUC19 质粒 DNA 经EcoRⅠ 完全酶切； 3.pUC19 质粒 DNA 经EcoRⅠ 部分酶切； 4.自提pUC19 质粒 DNA （此效果提得较好，为1带，以超螺旋质粒DNA为主。有时是3条带，分别为超螺旋质粒，线状质粒和开环质粒。还有时结果为2条带）

157 琼脂糖凝胶电泳步骤： 1.缓冲液的制备： 常用TAE或TBE，PH值在6—9之间。 无论哪种都含EDTA，可去除二价金属离子。

158 2.琼脂糖胶板的制备 1）取一定量的琼脂糖放入三角瓶中，加入电泳缓冲液配制成一定浓度的琼脂糖溶液（如基因组DNA：0.8%；PCR产物1.2%）。 2）选择凝胶盘放入制胶架中，选好梳子插在制胶架上。 3）加热煮沸使溶液澄清，冷却至60℃加入10mg/mlEB，摇匀后到入制胶架中。 4）室温放置30—40分钟待凝胶聚合后，轻轻拔掉梳子（注意：先拔一侧，否则垂直拔除产生真空导致部分凝胶带出）。

159 3.在两边槽中加入电泳缓冲液，使凝胶全部被浸没，液面应高出胶面1mm。
4.在梳井内加样，注意避免引入气泡。 5.盖好上盖，接通电泳仪。 6.根据实际情况选择适宜的电压即可电泳。长胶需较高电压，但是采用高电压所需电泳时间较短，发热高，分辨率低，适合筛选阳品或检查样品纯度。反之，低电压，发热少，分辨率高，但费时。 7 .电泳实验结束后，先关闭电泳仪；随之拔除电源线，然后打开电泳槽上盖，取出凝胶托盘。