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北京协和医学院八年制临床医学生药理学实验 药理学系 郭磊
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腺苷酸环化酶活性测定 相关背景 实验原理 实验步骤 问题讨论
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Background Review cAMP是多种激素、神经递质等作用于细胞时的第二信使物质。由腺苷酸环化酶AC催化ATP分解而成。
ATP cAMP ＋ ppi AC
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Background Review cAMP生成以后又在环磷酸腺苷酸二酯酶（PDE）的作用下分解失活。
这样AC和PDE共同维持体内的cAMP的动态平衡。 cAMP的浓度与细胞效应密切相关，因而调节AC以及PDE的活性即可以影响细胞的功能，其中AC活性的调节乃多种受体激活产生细胞效应的中心环节之一。
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Background Review 中枢神经系统中存在多个多巴胺效应系统，其中尾状核是多巴胺受体分布较为丰富的区域，其作用与调节锥体外系的功能有关。 多巴胺与细胞表面的受体结合，通过影响AC活性而发挥作用，很多抗精神病的药物是多巴胺受点的拮抗剂，这些药物不仅能抑制多巴胺与受体的结合，而且也抑制AC的活性。
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腺苷酸环化酶活性测定 相关背景 实验原理 实验步骤 问题讨论
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Principle 本实验采用非标记底物法测定AC活性。即用非标记的ATP作底物，其被AC催化所形成的cAMP可以不经过分离通过蛋白竞争结合法直接进行含量测定，方法简便灵敏度高。 非标记底物测定cAMP浓度，间接推测AC活性的大小，同时观察多巴胺和氟哌啶酶对AC活性的影响。
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《Goodman & Gilman's The pharmacological Basis of Therapeutics》1941
Alfred G. Gilman
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《Goodman & Gilman's The pharmacological Basis of Therapeutics》1941
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腺苷酸环化酶活性测定 相关背景 实验原理 实验步骤 问题讨论
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Procedure 配制标准cAMP浓度梯度： 32pmol/100ul 16pmol/100ul 8pmol/100ul
母液 母液 100ul 100ul T.E 100ul T.E 100ul 32pmol/100ul 100ul T.E 100ul T.E 16pmol/100ul 8pmol/100ul 4pmol/100ul
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Procedure 取小试管10支，依次编号，置试管架中。 按下表加入各种试剂 1 2 3 4 5 6 分组 编号 Tris苹果酸缓冲液
200μM多巴胺μl 250μM氟哌啶醇μl 10mM ATP μl A 1－2 350 —— 50 B 3－4 C 5－6 300 D 7－8 E 9－10 250
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Procedure 开动计时器，同时向第一管中加入大鼠尾状核匀浆液，100μl，摇匀。
每间隔10s，向下一管中加入大鼠尾状核匀浆液，100μl，摇匀。 1－2管：立即置沸水浴中，煮沸5min。取出，置冰浴中，10min。
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10000rpm离心5min，取上清200μl，测定放射性。
Procedure 4000rpm离心5min，各管取上清100μl按下表加样 分类 分组 编号 TEμl 标准品cAMPμl 待测样品μl 3H－cAMPμl 结合蛋白μl 摇匀，4摄氏度放置2小时 活性炭μl 10000rpm离心5min，取上清200μl，测定放射性。 比较管 CT 1－2 250 — 50 B 3－4 150 100 C0 5－6 标准管 S1 7－8 … S7 19－20 样品管 A 23－24 25－26 C 27－28 D 29－30 E 31－32
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Procedure 然后加活性炭混悬液，立即12000rpm离心5min。
小心吸取上清200μl，转入液闪瓶中，加5ml闪烁液，加3ml无水乙醇。（本实验中为已经配好的混合液，吸取两次，每次4ml即可）加盖摇匀，过夜。
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测闪烁计数 《Goodman & Gilman's The pharmacological Basis of Therapeutics》1941
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现在我们应用更先进的液体闪烁计数仪，由计算机控制，更灵敏、更准确。
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《Goodman & Gilman's The pharmacological Basis of Therapeutics》1941
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《Goodman & Gilman's The pharmacological Basis of Therapeutics》1941
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腺苷酸环化酶活性测定 相关背景 实验原理 实验步骤 问题讨论
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Discussion 本实验为微量实验，所以加样等操作精确度对结果影响很大 各管加样准确 各组时间平行
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Discussion 加入活性碳后应立即离心
因活性炭对游离3H-CAMP的吸附存在动态平衡，吸附时间过长可能造成反应产物的解离，影响试验结果。
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Discussion BSA的作用？ 加入ATP的作用？ 加入无水乙醇的作用？ 加入沸水浴的作用？ 倍比稀释的优点与缺点？
分析可能影响试验结果的因素，并讨论如何控制这些因素优化试验
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Discussion 根据药理学的理论知识预测试验的结果； 用合适的方法分析并解释你自己得到的数据和结论。
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就讲这么多 谢谢大家
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