自动生化分析仪 分析参数设置 张孝永.

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1 自动生化分析仪 分析参数设置 张孝永

2 您遇到过这样的医疗纠纷吗？ A医院的生化室使用全自动生化仪器，每天早上做两个水平的质控合格后才开始测试标本。某天，检测了一例病人标本ALT（丙氨酸氨基转移酶）结果为20U/L。生化室的检验人员没有仔细检查其它项目就匆匆发了报告。 此人是一个严重的肝炎患者，当他拿到一个正常的ALT结果的报告单，大为疑惑，于是第二天到另一家权威医院抽血化验，得到2500U/L的ALT报告，一场医疗纠纷产生了!结果……. 检测人员很不理解，两个水平的质控都在靶值上，说明试剂和仪器状态均正常，为什么病人结果却相差如此悬殊，而且仪器也没有报警。

3 ALT的反应原理： L-丙氨酸 + a-酮戊二酸 ALT 丙酮酸 + L-谷氨酸
NADH + 丙酮酸 + H LDH L-乳酸 + NAD+ ALT为降反应，其原理为通过监测NADH的消耗造成吸光度的降低速率，得到ALT的含量。当ALT含量很高时，酶反应速度加快，NADH在30秒之内就可能消耗完全，即底物耗尽

4 2 从ALT的反应曲线分析： 仪器检测的正是底物耗尽后吸光度变化的平台期，造成了病人结果只有20U/L的现象，导致医疗纠纷的产生，因此很有必要了解仪器和试验项目的参数设置的基本原理

5 试验代号（Test Code） 以数字表示 目的: 便于识别 为仪器通讯提供代码 注意事项：不能随意更改试验代号，原因：
（1）：保证数据在LIMS中传输的正确性 （2）：保证结果显示时的顺序 （3）：保证试剂信息读取正确

6 试验名称（Test Name）： 以英文缩写表示
根据国际标准和习惯： ALT（GPT）；GSP（FRA）；CK（CPK） 方法学不同时名称有区别： LDHIL/LDHL，反应原理不同，相应的参考范围不同，室间质评报告结果时相差很大 GLUC2/GLUC3：200/800Tests 不同厂家的试剂不同： 如在BECKMAN CX/LX/DX系列应用名随厂家不同而不同，CZALT/ZSALT等

7 方法学 （ Method ） 概述：方法学决定于其所采用的测定方法和校准模式，临床生化检验测定方法总的来说可分为两大类：终点法和动力学法，其中动力学法又可分为零级动力学法和一级动力学法

8 表示方法 常用选择项 表示方法：在不同仪器上分析方法有各种方式
表示方法 常用选择项 COBAS Asaay Rate A/2Pont rate/1 Ponit/2 Point end HITACHI Assay code Rate A/2Pont rate/1 Ponit/2 Point end OLYMPUS Method RATE/FIXED/END BECKMAN Reaction type RATE1/2/END1/2 ABBOTT Reaction defintion Rate /Flex Rate/End

9 温度（Tem） 三种温度可选: 30℃、37℃、25℃/固定37℃ 控制反应温度的方法：水浴/空气浴
温度选择意义：方法学不同，结果的溯源性不同，靶值不同

10 波长 （Wave Length ） 选择原则：正确选择有利于提高测定的灵敏度和减少测定误差 待测物质在该波长下的光吸收最大；
其吸收峰宜较宽而钝，而不是处于尖峰或陡肩，一般不选光谱中末端吸收峰，即该吸收峰处吸光度随波长变化较小； 常见干扰物在该波长下的光吸收最小 双波长测定 ：选择一个次波长，因单波长测定易受样本溶血、黄疸、脂浊等因素干扰 双波长测定的原则是根据干扰组分和待测物质吸收光谱的峰形特征，选择两个波长，使干扰组分在这两个波长处的吸光系数相等，而使待测物质在两波长处的吸光系数有显著差别

11 COBAS常用波长：12个波段,从紫外线到红外线340~800nm
不同仪器波长的表示方式 主波长 次波长 COBAS Wave(Main/ Sub) HITACHI Wave(Main/ Sub) OLYMPUS Wavelength pri Wavelength sec BECKMAN Primary Wavelength Secondary Wavelength ABBOTT Wavelength Primary Wavelenght Secondary COBAS常用波长：12个波段,从紫外线到红外线340~800nm

12 反应方向(Reaction Direction )
在一定反应时间内，吸光度是增大还是下降

13 表示方法 可选择项 COBAS INC/DEC INC/DEC HITACHI INC/DEC INC/DEC
表示方法 可选择项 COBAS INC/DEC INC/DEC HITACHI INC/DEC INC/DEC OLYMPUS Reaction Slope /－ BECKMAN Reaction Direction Positive/Negative ABBOTT Reaction Mode Up/Down

14 样本量（Sample Volume ） Sample Volume （S.V）：可以选择的最大和最小样本量，以微升（ul）计
可以根据与试剂的比例增大或减少样本量

15 试剂量（Reagents Volume ） 最小反应体积 ：在仪器光度读数用于结果计算时，反应液液面高度不低于光度计光径最小体积 ，保证仪器的正确读数和计算，也是仪器测定精密度和经济性的指标之一 设定原则 在单试剂测定中：样本与试剂的总体积不得少于此参数 在双试剂测定中： R1与样本的反应读数不纳入结果计算：R1加液量可不考虑此参数，如连续监测法； R1与样本的反应读数纳入结果计算：应考虑它对结果的影响，用于两点终点法和带样本空白的速率法

16 最大反应体积：超过此体积，导致反应混合体系外溢，仪器测定系统被污染损坏
实际分配体积：大于设置体积，富余试剂的分配 目的：防止试剂被稀释；防止试剂间的交叉污染 实际分配体积大于设置的分配体积 R1：180（180+22），R3：60（60+12） 结果：R1剩余，R3不足

17 设定量（uL） 余 量（uL） 消费量（uL） 上海复星长征公司生产的ALT试剂规格 R1：4×50mL，R2：2×50mL R1：R2：S设定量为：200：100：15uL 理论测试数 按照R1计算= 4×50mL/200uL=1000Tests 按照R2计算= 2×50mL/100uL=1000Tests 实际测试数 按照R1计算= 4×50mL/（200+23）uL=896Tests 按照R2计算= 2×50mL/（100+16）uL=862Tests 结果：R1剩余，R3不足

18 样本与试剂的比例(SV：RV)即样本体积分数：定义：样本体积与反应液总体积的比值(SV／TV) 比例选择原则
待测物质含量高，生理波动范围小，样本用量小： ALB 1:200， GLU、TCH等，样本试剂多为1:1OO，测定血UA或HDL-C，常为1:50 待测物质含量低，生理波动范围大，样本用量大，应在1:10％以下，如酶ALT/AST活力为1:10 ，肌酐Jaffe氏法监测时间短、吸光度值较低，样本试剂比例多为1:10 注意事项：缩小试剂用量会降低线性范围，遇高浓度样本会因酶量不足而使结果变低

19 稀释液量(Dilution Volume)
添加稀释液(水)：去离子水或指定的液体(0.9%NaCl) 目的 一用于浓缩试剂的稀释：恢复原试剂浓度；避免试剂间的交叉污染 二在样本加量小的时候用来冲洗样本探针内侧，洗出粘附在采样针内壁上的微量血清，减少加样误差和避免交叉误差 注意：要把稀释水量纳入样本试剂比例和反应液总体积考虑

20 样本空白 (Sample Blank) 原因：溶血、脂血、黄疸等情况，会导致样本本身的吸光度对测试结果造成影响。所以对样本本身吸光度的测量，即样本空白，可以去除这方面的影响 测量方法：按照正常测试的试剂和样本量，把试剂换成蒸馏水或生理盐水来进行测量 终点法选YES 或NO 影响速度：样本加空白试剂，要占用一个比色杯，速度减慢

21 酶促反应过程 随着加入血清或底物启动反应后，在出现明显的变化前这一时期称为延迟期，此期从几秒到几分钟，随后是底物和产物变化与时间成直线时期，形成产物的速率恒定，此时期的速率为“反应初速度”。此期底物也下降，但实际上反应速度与底物浓度无关，对底物浓度而言，这一时期的反应称为是零级反应，即产物增加的速度不变。在零级反应区内，时间和吸光度的变化成线性，表现在反应曲线上，在一定的时间内，吸光度的变化为一条直线。反应曲线的直线期时间长短相差很大。紧跟着是反应速率持续下降，进入速度依赖底物浓度的时期，这一时期称为一级反应期。在这一期中，底物浓度下降，逆反应增加。抑制性产物积蓄，当底物耗尽或达到平衡时，反应停止

22 反应时间(Reaction Time) 指仪器的一个分析周期中，试剂和样本混合最后一点测定读数时间
选择原则：保证测定项目在该时间内能完成监测，如ALB、TG、CK GLU时间不同 常见仪器可以选择的时间 COBAS P800 :1~10、15、22分钟 C501: 3~10分钟 HITACHI ：3、5、8、10、15、22分钟 OLYMPUS固定时间： 8.3分钟 ABBOTT固定时间：9.6 分钟 BECKMAN可达时间：975秒

23 延迟时间(Delay Time) 概念：指试剂与样本混合后到监测开始之间的时间 应用：连续监测法或两点速率法法用
原因：酶与底物混匀后需要一定的时间才被激活，直到线性期的零级反应后才能开始监测；有的项目需要用工具酶将内源性代谢产物耗尽后才能监测 方式： 以S“秒”或P（Point）测定点设置 项目和方法学不同时差别很大:CHE/CREA/ALT/ALP/CK/TBA

24 反应监测时间 (Reaction Monitor Time)
用途：该时间内的测定读数要用于结果计算 一般反应时间10分钟左右，6-30秒读数一次，有的仪器在整个反应周期全程读数，有的读取指定时间(点)吸光度 监测时间： 终点法：达到反应终点的时间 速率法：酶至少90～120Ｓ或不能少于4个读数点即3个吸光度的变化(3个△A)

25 试剂加入时间（Adding Time） 概念： COBAS和 HITACHI 第一试剂/第二试剂：试剂的成分的区别
R1/R2/R3/R4：试剂的加注时间，试剂一在样本加入后即刻加入，试剂二可以在R2（1.5分钟）或R3（5分钟）时加入

26 试剂加入方式及相应时间(分钟) HITACHI R1 R2(1.5) R3(5) R4(9)
P R1 R2(1.5) R3(5) R4(9) C R1 R2(1.5) R3(5) OLYMPUS R1 R2(3.3) ABBOTT R1 R2(5.1) BECKMAN R R2(Add time)单/双试剂模式

27 加入时间和读点数 HITACHI R1 R2(5) R3(16) R4(32) 34 P R1 R2(5) R3(16) R4(32) 34 C R1 R2(10) R3(34) OLYMPUS R1 R2(10) AU400/600/ ABBOTT R1 R2(17) BECKMAN CX/LX/DX系列

28 读点间隔时间及最大读点数 读点间隔(秒) 最大读点数 P C HITACHI /68 OLYMPUS /14 ABBOTT BECKMAN 非连续性 秒

29 试剂加入方式 第一试剂 第三（第二）试剂 COBAS R1 Volume R3(R2) Volume
第一试剂 第三（第二）试剂 COBAS R1 Volume R3(R2) Volume HITACHI R1 Volume R3(R2) Volume OLYMPUS Reagent 1.Vol Reagent 2.Vol BECKMAN(CX系列) Primary Inject Rgt A Secondary Inject Rgt B (LX系列) First inject Third inject Component A Component B Dispense Volume Dispense Volume ABBOTT Reagent Volume R Reagent Volume R2

30 校准类型（Calibration Type）
概念：也称定标，是用以知浓度的标准品来标定样本的方法，在某些仪器上称为数据模式(math model)，即怎样把吸光度转换成浓度的方法 校准原因： 试剂厂家改变； 同一厂家试剂配方改变； 试剂批号改变； 瓶号改变； 质控失控； 大量结果普遍偏高或低 ； 标准曲线过效期； 维护保养或更换关键配件

31 校准类型 校准类型 适用范围 应用范围 标准品数量 K因数法 浓度和吸光度成比例 广 S1(0) ~S2 标准化法 线性法
校准类型 适用范围 应用范围 标准品数量 K因数法 浓度和吸光度成比例 广 S1(0) ~S2 标准化法 线性法 ②非线性法 浓度和吸光度不成比例 不常用 S1~S6 曲线拟和法

32 校准品校准:校准品应具有溯源性,不可用定值血清 实际K值校准:无标准品时使用
校准表示方法 表示方法 常用选择项 COBAS Calib Type Linear/RCM HITACHI Calib Type Linear/Logit-3P/4P OLYMPUS Cal Type MB/AB/4AB BECKMAN Math Model Linear/1 ABBOTT Calib Mode Factor/Linear/Spline 校准方法 校准品校准:校准品应具有溯源性,不可用定值血清 实际K值校准:无标准品时使用

33 COBAS部分校准参数 (1) 校准点数（Ponit） 量程点数(Span) Point Span 无校准品 有校准品 无校准品 有校准品
无校准品 有校准品 无校准品 有校准品 速率法 (2)权重(Weight)：统计学术语，备选项有0/1/2/3，选择0

34 （3）校准偏差界限（SD Limit） 概念：在非线性校准中，由拟和曲线求得的各浓度的吸光度与实际测得的吸光度之差称为校准偏差,即 A1-A2 目的：设定SD Limit控制拟和准确度 吸 拟和曲线 光 A1 度 实际曲线 A2 标准品浓度

35 (4)双份界限（Duplicate Limit）
也称离散性，是同一个标准液两次测定吸光度的差值，表示试剂和仪器的重复性,此值越小表示试剂和仪器的精密度越高 在校准时，如出现DUP报警，说明两次测定的标准液吸光度的差大于吸光度允许离散范围，此时校准不能通过

36 (5)敏感性界限(Sensitivity Limit)
可以检测的最低吸光度值，也就是检测最低浓度的可靠性 ：标准品-空白的Abs/标准品-空白的Con (6)第一标准吸光度界限(S1 Abs.limt) 通常指零浓度标准品的吸光度界限，在终点法和速率法中计算方式不同

37 校准报警（Calibration Alarm）
出现下列情况时，虽然进行了校准，但是校准结果不能更新，参数没有改变，需要解决相应的问题才能更新校准结果，使校准有效，更新反应曲线。 S1ABS? 第一标准吸光度异常, 可增大S1ABS的范围 DUP DUPLICATE有误，可增大Duplicate范围 SENS 敏感度有误，可降低敏感度，一般不进行此项检查 SD！ 偏差检查有误，增大SD范围 STD？ STD有误，标准品校准有误，包括DUP、 CELL、 S1ABS? 、SAMPLE、REAGENT等，逐一检查可能引起此报警的事项,对应处理 CALIB CALIB有误，本次校准K值和上次差别大于20%时，常因更换校准品和试剂有关，校准更新，不需处理。

38 校准品浓度(Concentration of Calibrator)
不同公司的标准液在定标时所用原始标准的来源不同（有些来自动物血清，有些来自水溶液标准），同一个标示值其真正浓度也可以有差异 方法学相同的试剂盒配方也有差别，所以用其他公司的标准液或用水溶液标准进行定标时，使用非指定试剂盒作质控，测得的数值与质控血清的预计值会有差别，这种情况不表示分析参数不合适

39 计算因子(Calculation Factor)和 小数点位数(Decimal Precision )
计算因子即常用的F值(K值,K因子) 连续监测法试剂无校准品时必须输入，见试剂说明书 在COBAS系列,小数点位数决定K值的扩大倍数 比如AST 零标准 K值 结果

40 计量单位 (Unit) 应选择通用单位或国际单位 COBAS:
加载应用参数后可进行单位转换。若第二次更改单位，则检测应用参数被删除，应重新进行加载参数 改变检测单位并不影响改变前的定标和质控检测。改变检测单位后，需重新定标和运行质控，以确保报告结果正确无误

41 反应过程吸光度界限(Absorbance Limit)
概念：在动力学反应中,由于高浓度（活性）样本使底物耗尽，使反应不再为0 级(零级动力学法)或1 级(固定时间法)反应，底物耗尽后所测吸光度已不可靠,使高浓度的样本测定值低很多,甚至为负值。为能正确反映测定结果，需设置底物耗尽限(某一特定吸光度)，该吸光度限应正好是反应曲线中线性区与非线性区(零级动力学法)或1 级反应区与多级反应区(固定时间法)的临界点，是在反应时间内反应没有发生底物耗尽时所能达到的最小(反应曲线向下)或最大(反应曲线向上)的吸光度值 ，该吸光度即为吸光度界限 作用：保证高浓度（活性）样本结果的准确性

42 解决方法 A设定数据报警： Samp.C >Test:Technical limit >Abs:>3.0 >React:Reaction limit over(substrate depletion) B弹性速率法的设置 在亚培和东芝系列仪器上，设计有FLEX RATE 分析方法，可以设置吸光度界限、线性度（反应度）、弹性读数时间。在酶活性测定中，当其浓度太高，在连续检测期内已经不成线性时，仪器自动打开弹性速率功能，自动选择反应曲线上连续检测期中仍呈线性的吸光度数据计算结果，使得酶活性的线性范围得以扩大，从而减少稀释及重测定次数，降低成本

43 弹性速率法(Flex Rate )

44 试剂吸光度界限(OD Limt) 表示方法：常用规定波长及光径下的吸光度值表示。终点法常在0点读数，连续监测法常以反应监测起始点来判读
作用：判断试剂质量。检测试剂空白时，若超过此参数的限值，则提示试剂失效 判断方法：反应吸光度向上的试验取上限值 ；反应吸光度向下的试验取下限值

45 示例 升反应：Trinder反应以酚和4-氨基安替比林作用, 生成红色色素,试剂有一定的自发氧化,其试剂一般要求试剂吸光度上限≤0.1~0. 4。以结合型硝基苯衍生物作为底物的ALP和GGT常要求≤0.6~0.8 降反应：以NADH或NADPH为辅酶的ALT/Urea(紫外法)试验,一般要求试剂吸光度下限≥1.0

46 线性限 (Linearity) 每种仪器说明书定义不同,取决于读点数和计算方式: (最初5/7点速率的变化—最初5/7点速率的变化)/平均速率变化×100 连续监测法用:线性度不能超过设定界限,超限时说明吸光度的变化量之间已经不成线性或说明底物不足，检测结果会变低，打印报警信号，应稀释后重测 一般进口试剂设为15％,国产试剂设为30％

47 前区检查限(Prozone Check Limt)
免疫比浊用 选YES或NO，比较终点法后两个读数点的差别，如果后一点比前一点的吸光度低，表示已经有抗原过剩，样本应稀释后重测

48 线性范围(Line Limit) Dynamic Range 对线性反应适合 技术界限（Technical Limit）更合理

49 试剂空白速率 （Reagent Blank Rate）
试剂在监测过程中底物自动降解得到的结果 底物为还原型辅酶者，本身不稳定而分解，多呈下降趋势； 以硝基苯酚或苯胺的衍生物作底物，在碱性环境中自发水解成被测物质，多呈上升趋势。其数值在样本测定结果中自动扣除 连续监测法用 主要用于监测试剂质量及仪器稳定性 COBAS的Crea BECKMAN上加R2前的检测吸光度变化就是试剂空白速率

50 方程式（Fomular） 机器常数（Instrument Factor） Y=aX+b
a为截距，b为斜率。用于校正检测结果，一般a为1.000，b为0.000，必要时根据试剂说明书设定 Cobas： GHb Crea

51 谢谢!