卫生毒理学设计性、综合性实验 外源化学物所致肝脏损伤及机制探讨 刘起展 南京医科大学公共卫生学院卫生毒理学系.

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1 卫生毒理学设计性、综合性实验 外源化学物所致肝脏损伤及机制探讨 刘起展 南京医科大学公共卫生学院卫生毒理学系

2 培养学生观察问题、分析问题、解决问题及整体科研思维和能力 熟悉毒理学整套动物实验过程，全面掌握毒理学基本理论、基本知识和基本操作
实验总目的 培养学生观察问题、分析问题、解决问题及整体科研思维和能力 熟悉毒理学整套动物实验过程，全面掌握毒理学基本理论、基本知识和基本操作

3 实验主要内容 本实验以四氯化碳所致肝脏急性损伤作用及其机制探讨为例，从如何建立动物急性染毒模型开始，通过检测机体有关肝脏损伤指标及脂质过氧化机制指标，比较、分析肝脏损伤指标与脂质过氧化指标之间的关系，从而探讨脂质过氧化是否为四氯化碳所致肝脏损伤机制之一

4 脂质过氧化在四氯化碳所致肝脏损伤机制中发挥重要作用
实验技术路线 检测肝脏损伤指标 如ALT和TG 脂质过氧化在四氯化碳所致肝脏损伤机制中发挥重要作用 ? 高、中和低浓度 小鼠四氯化碳 急性中毒模型 四氯化碳 处理一定时间 检测脂质过氧化指标 如LPO、GSH和SOD

5 主要的问题 如何建立四氯化碳急性染毒动物模型？ 四氯化碳是否引起肝脏损伤？其损伤是坏死还是脂肪变性？
脂质过氧化是否是四氯化碳所致肝脏损伤机制之一？ 如何撰写四氯化碳所致肝脏损伤及机制研究报告？ 5

6 综合实验内容和时间安排 七次实验，共20学时，其中
第一次小鼠四氯化碳急性中毒模型建立：确定四氯化碳高、中、低3个染毒剂量组，同时设计溶剂对照组和空白对照组，经灌胃或腹腔注射染毒1次，观察8小时，以建立四氯化碳急性动物染毒模型 第二次：血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）活性测定：检测、比较不同染毒剂量组及对照组之间反映肝坏死损伤的指标如血清ALT活性 6

7 第三次肝组织甘油三酯（TG）含量测定：检测、比较不同染毒剂量组及对照组之间反映肝脂肪变性损伤的指标如肝TG含量
第四次肝组织脂质过氧化物（LPO）含量测定：检测、比较不同染毒剂量组及对照组之间肝脏过氧化指标如LPO含量 第五次肝组织超氧化物歧化酶（SOD）活性测定 ：检测、比较不同染毒剂量组及对照组之间肝脏抗氧化酶SOD活性 7

8 第六次肝组织还原型谷胱甘肽（GSH）含量测定：检测、比较不同染毒剂量组及对照组之间肝脏抗氧化剂GSH含量
第七次总结综合实验：应用统计学方法正确分析所有实验结果按照一般论文格式和要求撰写研究报告 8

9 实验内容一 小鼠四氯化碳急性中毒模型建立 9

10 （一）实验目的 了解化学毒物的剂量选择原则 掌握急性动物染毒模型的基本操作技术

11 （二）实验原理 选择健康实验动物，根据体重按随机分组方法，将动物随机分成3～4个染毒剂量组和对照组，将受试物一次给予或连续给予一定时间后，了解动物所产生的急性或亚急性毒性反应及其严重程度，从而建立急性染毒动物实验模型 正常细胞在有丝分裂后期其染色体逐渐从赤道向两极移动并在末期成为两个子细胞的核心，若染色体受到断裂和损伤，则它们在有丝分裂后期不能正常向两极移动而滞留形成微核，从而在有丝分裂的间期看到微核。

12 （三）实验步骤（1） 急性染毒：求出四氯化碳急性经口LD50→灌胃分别给予0.0 mg/kg、100mg/kg（1/10LD50）、200mg/kg（1/5LD50）和500mg/kg（1/2LD50）三个染毒组和一个对照组，各组动物数10只，雌雄各半→染毒4小时后→颈动脉留血（尽可能采集血样）和取部分肝组织备用

13 （三）实验步骤（2） 血清制备：将全部动物颈动脉取血处死，用5 mL 离心管尽可能留取血样（不抗凝），室温放置10 min，按6000 rpm离心5 min，轻轻吸取上层血清，备用 10%肝匀浆制备：解剖取出部分肝组织，用冷0.85% NaCl漂洗肝组织，滤纸吸干后，称取1.5 g肝组织，加入冰冷KCl-Tris-HCl缓冲液（pH7.4）15 mL，用组织匀浆器在冰水浴中匀浆，备用

14 （四）注意事项 不同受试物其染毒剂量不同，根据其LD50或其他因素综合考虑或通过预实验确定染毒剂量
四氯化碳具有挥发性，可由呼吸道吸收，对人体有一定毒性，操作时应注意 四氯化碳与溶剂橄榄油或植物油必须充分搅拌，需完全均匀溶解后方可染毒 尽可能多采集血样，并防止发生溶血现象，否则会影响血清酶活性测定结果

15 实验内容二 血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）活性测定 15

16 （一）实验目的 掌握比色法测定血清ALT酶活性方法 分析比较不同剂量四氯化碳急性染毒对血清ALT的影响及意义

17 （二）实验原理 ALT在适宜的温度与pH条件下催化丙氨酸与α-酮戊二酸生成谷氨酸与丙酮酸，反应至所规定时间后加2，4-二硝基苯肼-盐酸溶液终止反应，同时2，4-二硝基苯肼与丙酮酸中羰基反应，生成丙酮酸苯腙，苯腙在碱性条件下呈棕红色，根据颜色深浅比色定量，计算ALT活性 正常细胞在有丝分裂后期其染色体逐渐从赤道向两极移动并在末期成为两个子细胞的核心，若染色体受到断裂和损伤，则它们在有丝分裂后期不能正常向两极移动而滞留形成微核，从而在有丝分裂的间期看到微核。

18 （三）实验步骤（1） 1.标准曲线绘制：按下表操作 试剂 空白管 样品管 标准管 血清（ml） 0.1(双蒸水) 0.1（血清）
0.1（标准液） 基质液（ml） 0.5 混匀，置37℃水浴箱30分钟 2，4-二硝基苯肼（ml） 混匀，置37℃水浴箱20分钟 0.4 M氢氧化钠（ml） 5.0 混匀，室温放置10分钟后，于波长505nm，经空白管调零，测定样品管和标准管OD值

19 （三）实验步骤（2） 2.样品测定：按下表操作 试 剂 空白管 样品管 标准管 血清（ml） 0.1 0.1（标准液） ALT底物液（ml）
试 剂 空白管 样品管 标准管 血清（ml） 0.1 0.1（标准液） ALT底物液（ml） 0.5 混匀，置37℃水浴30 min 2，4-二硝基苯肼（ml） 混匀，置37℃水浴20 min 0.4 mol/L氢氧化钠（ml） 5.0 混匀，室温放置10 min后，于500 nm波长处，经空白管调零，测定样品管和标准管吸光度值

20 3.计算： ALT活性（U/ml血清）=（样品管OD值/标准管OD值）×57 U/0.1ml 4.意义： 化学性肝损伤，引起ALT明显增高。将不同剂量染毒组与对照组比较

21 （四）注意事项 测定结果超过150 U时，应将样本稀释后再测定，结果乘以稀释倍数
血清中的ALT在室温（25℃）可保存2 天，在冰箱（0～4℃）可保存1周，冰冻（-25℃）可保存1月

22 实验内容三 肝组织甘油三酯（TG）含量测定 22

23 （一）实验目的 掌握异丙醇-正庚烷抽提乙酰丙酮比色法测定肝组织TG含量方法 分析比较不同剂量四氯化碳急性染毒对肝脏TG含量的影响及意义

24 （二）实验原理 用异丙醇-正庚烷抽提肝组织TG，经氢氧化钾皂化后生成甘油，甘油被过碘酸钠氧化生成甲醛，甲醛与乙酰丙酮在氨离子存在条件下加热生成黄色的3，5-二乙酰-1，4二甲基吡啶（Hantgsch反应），显色程度与样本中甘油三酯含量成正比 正常细胞在有丝分裂后期其染色体逐渐从赤道向两极移动并在末期成为两个子细胞的核心，若染色体受到断裂和损伤，则它们在有丝分裂后期不能正常向两极移动而滞留形成微核，从而在有丝分裂的间期看到微核。

25 注意：加入抽提剂后，应充分摇匀，使蛋白不成块状
（三）实验步骤 按下表操作 试 剂 空白管 样品管 标准管 10％肝匀浆（ml） 0.2(匀浆缓冲液) 0.2 0.2（TG应用液） 抽提剂（ml） 2.5 注意：加入抽提剂后，应充分摇匀，使蛋白不成块状 0.08N硫酸（ml） 0.5 混合器上振摇15 s，静置分层后，准确吸取各管上层液0.3 mL于另一套试管中 异丙醇（ml） 1.0 皂化剂（ml） 0.3 混匀，置65℃水浴3 min（或56℃水浴5 min） 氧化剂（ml） 显色剂（ml） 充分混匀，置65℃水浴15 min（或56℃水浴25 min），取出冷却后于420 nm波长处，经空白管调零，测定样品管和标准管吸光度值

26 3.计算： 4.意义： 正常肝组织中含一定量TG，当肝组织发生脂肪变性时，肝TG含量明显增加。一般来说，肝TG含量越高，说明肝组织脂肪变性损伤程度越大

27 （四）注意事项 本法如用沸石合剂或氧化铝吸附样本中的磷脂及甘油，则去除样本中原有的磷脂和甘油效果更好，测定结果更准确
本法线性范围高达5.56 mmol/L，TG含量过高时，需将样本用匀浆缓冲液稀释后再测定

28 实验内容四 肝组织脂质过氧化物（LPO） 含量测定 28

29 （一）实验目的 掌握硫代巴比妥酸（TBA)比色法测定肝组织LPO含量方法 分析比较不同剂量四氯化碳急性染毒对肝脏LPO的影响及意义

30 （二）实验原理 LPO与组织蛋白经加热变性共沉淀后，在酸性环境下与硫代巴比妥酸（TBA）共热，由于2分子TBA与1分子的LPO缩合成1分子稳定的红色化合物，根据颜色深浅，于535 nm波长处比色定量 正常细胞在有丝分裂后期其染色体逐渐从赤道向两极移动并在末期成为两个子细胞的核心，若染色体受到断裂和损伤，则它们在有丝分裂后期不能正常向两极移动而滞留形成微核，从而在有丝分裂的间期看到微核。

31 用力振动充分混匀、塞盖、置95℃水浴60 min，水浴取出后，自来水流冷却
（三）实验步骤 取带塞比色试管，按下表加入各试剂 试 剂 空白管 样品管 标准管 10％肝匀浆（ml） 0.2(匀浆缓冲液) 0.2 0.2（TEP应用液） 8.1% SDS（ml） 醋酸盐缓冲液（ml） 1.5 0.8% TBA（ml） 蒸馏水（ml） 0.6 用力振动充分混匀、塞盖、置95℃水浴60 min，水浴取出后，自来水流冷却 正丁醇-吡啶（ml） 5.0 充分振荡1 min，转入另一离心管，以3000 rpm离心10 min，取上清液于532 nm波长处，经空白管调零，测定样品管和标准管吸光度值

32 3.计算：

33 4.意义： 多种外源化学物进入机体，可引起体内自由基增多或机体抗氧化功能降低，从而使机体产生脂质过氧化损伤，引起组织LPO含量升高 分析比较不同染毒剂量组与对照组组织LPO含量的变化，观察外源化学物对组织脂质过氧化损伤的影响

34 （四）注意事项 在LPO与TBA反应显色过程中，要求在沸水浴中加热，操作小心以避免沸水烫伤 为使反应完全，在加热过程中，不断振摇混匀

35 实验内容五 肝组织超氧化物歧化酶（SOD）活性测定 35

36 （一）实验目的 掌握核黄素光照比色法测定肝组织SOD酶活性方法 分析比较不同剂量四氯化碳急性染毒对肝脏SOD酶活性的影响及意义

37 （二）实验原理 核黄素光照产生的超氧阴离子自由基与羟胺反应生成亚硝酸根，在酸性条件下，亚硝酸与氨基苯磺酸和N-甲萘基二氨基乙烯反应生成红色化合物，而SOD可抑制此反应，根据抑制率高低，计算SOD活性。因CuZn-SOD在1～2 mmol/L NaCN存在下完全失活，而Mn-SOD活性不变，故在测定体系中，根据NaCN存在与否，可测出总SOD(T-SOD)和Mn-SOD活性，从而计算出CuZn-SOD活性 正常细胞在有丝分裂后期其染色体逐渐从赤道向两极移动并在末期成为两个子细胞的核心，若染色体受到断裂和损伤，则它们在有丝分裂后期不能正常向两极移动而滞留形成微核，从而在有丝分裂的间期看到微核。

38 （三）实验步骤（1） 按下表操作 试 剂 Mn-SOD T-SOD 对照管 测定管 样品（ml） A(蒸馏水) A 试剂A（ml） 1.0
试 剂 Mn-SOD T-SOD 对照管 测定管 样品（ml） A(蒸馏水) A 试剂A（ml） 1.0 试剂B（ml） 30℃，距离6 cm，光照5 min 试剂C（ml） 2.0 30℃水浴20 min，于550 nm波长处，以蒸馏水调零，测定对照管与测定管吸光度值

39 3.计算： 定义：每mg组织蛋白在1 ml反应液中SOD抑制率达50%时所对应的SOD量为一个亚硝酸盐单位 组织匀浆中SOD活性（U/mg蛋白）为 组织匀浆蛋白含量按Lowry方法测定

40 4.意义： SOD是细胞内重要抗氧化酶，在清除自由基、拮抗外源化学物对机体损伤及维持自身内环境稳定上均具有重要作用。不同组织样本SOD活性不同，当外源化学物进入机体引起组织中SOD活性降低，使机体不能及时有效清除体内过多活性氧（ROS）自由基，从而引起机体产生过氧化性损伤

41 （四）注意事项 NaCN是剧毒物质，操作时要小心，并妥善保管好
因SOD活性是通过抑制超氧阴离子自由基产生而计算的，所以在操作过程中要严格按程序操作，控制操作时间，否则影响实验准确性

42 实验内容六 肝组织还原型谷胱甘肽（GSH）含量测定 42

43 （一）实验目的 掌握DNTB法测定肝组织GSH含量方法 分析比较不同剂量四氯化碳急性染毒对肝脏GSH的影响及意义

44 （二）实验原理 GSH和5，5’-二硫代二硝基苯甲酸（DNTB）作用生成5’-硫代二硝基苯甲酸阴离子，呈现较稳定的黄色，在410 nm波长处测定其吸光度值，并与相应处理的GSH标准比较，即可求得样本中GSH含量 正常细胞在有丝分裂后期其染色体逐渐从赤道向两极移动并在末期成为两个子细胞的核心，若染色体受到断裂和损伤，则它们在有丝分裂后期不能正常向两极移动而滞留形成微核，从而在有丝分裂的间期看到微核。

45 充分混匀，使蛋白变性，3000 rpm离心10 min，取上清液于另一套试管
（三）实验步骤（1） 按下表操作 试 剂 空白管 样品管 标准管 10％肝匀浆（ml） 0.3(匀浆缓冲液) 0.3 0.3（GSH标准液） 偏磷酸溶液（ml） 4.7 充分混匀，使蛋白变性，3000 rpm离心10 min，取上清液于另一套试管 上清液（ml） 2.0 Na2HPO4溶液（ml） DNTB溶液（ml） 1.0 充分混匀，迅速于412 nm波长处，经空白管调零，测定样品管和标准管吸光度值

46 3.计算：

47 4.意义： GSH是细胞内重要抗氧化剂，在清除自由基、拮抗外源化学物对机体损伤及维持自身内环境稳定上均具有重要作用。当外源化学物进入机体，产生过多自由基时，GSH在消除自由基过程中，自身被氧化成氧化型谷胱甘肽（GSSG），所以组织细胞内GSH水平可反映体内抗氧化水平

48 （四）注意事项 加入偏磷酸溶液使蛋白变性完全，在吸取上清液时，操作轻，勿吸到底部沉淀
加入DNTB溶液显色后，应在15 min内比色完成，否则，由于裉色而影响测定结果

49 实验内容七 总结综合实验 49

50 探讨四氯化碳所致肝脏损伤与脂质过氧化之间的关系
应用统计学方法正确分析所有实验结果 探讨四氯化碳所致肝脏损伤与脂质过氧化之间的关系 揭示四氯化碳引起肝脏损伤的机制 按照一般论文格式和要求撰写研究报告 50

51 实验结果与分析 不同剂量四氯化碳所致小鼠肝损伤及脂质过氧化 四氯化碳（mg/kg) 指标 100 200 500 血清ATL 肝TG
100 200 500 血清ATL 肝TG 肝LPO 肝SOD 肝GSH 51