蛋 白 质 的 生 物 合 成 Protein Biosynthesis

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1 蛋 白 质 的 生 物 合 成 Protein Biosynthesis
Protein biosynthesis: easy, you can do it! How is protein biosynthesized? Understand the process of protein synthesis, regulation and control protein biosynthesis with aim to interfere protein synthesis. Stop abnormal protein synthesis (tumor treatment). Stop protein synthesis in bacterial and virus. Biosynthesis of protein drugs. Not easy

2 蛋白质的非生物(人工)合成 人工合成多肽 (毫克级--公斤级, 140 aa, 纯度98％， RMB100/aa)
G13 blocking peptide inhibits human platelet aggregation and ATP release Synthesized peptide AYPGKF 100 microM stimulates human platelet aggregation and ATP release in the presence of aspirin

3 中心法则 Central Dogma general special 蛋白质生物合成: 是指mRNA分子上4种核苷酸的遗传信息，变成蛋白质多肽链的20种氨基酸排列顺序的过程，类似一种语言翻译成另一种语言时的情形，所以也称为翻译。

4 蛋白质生物合成中的三大发现 (1912 - 2009) Mahlon Hoagland (1921 - 2009)
发现转运RNA（tRNA） Paul Zamecnik ( ) Francis Crick ( ) 核糖体是蛋白质生物合成的场所 提出tRNA应接器假说

5 第一节 蛋白质合成体系 五、酶和辅助因子及无机离子、以ATP 、GTP供能 一、20种氨基酸 二、 mRNA和遗传密码 三、tRNA
四、核糖体 五、酶和辅助因子及无机离子、以ATP 、GTP供能 合成方向：N→C 端

6 蛋白质合成的三大物质基础

7 tRNA 功能:应接器 1.结合氨基酸:氨基酸(20种)各有其特异的tRNA携带，一种氨基酸有几种tRNA(据反密码子种类分，约40种)携带，结合需要ATP供能,氨基酸结合在tRNA 3’-CCA的位置 2.反密码子:每种tRNA的反密码子，决定了所带氨基酸能准确的在mRNA上对号入座

8 tRNA 二级结构 氨基酸臂 反密码子环

9 tRNA的构象 tRNA 氨基酸臂 clover leaf 二级结构 三级结构

10 tRNA 碱基修饰 除主要碱基外，核酸中也有一些含量很少的稀有碱基。稀有碱基的结构多种多样，多半是主要碱基的甲基衍生物。tRNA往往含有较多的稀有碱基，可高达到10％。 tRNA碱基的修饰是他们能够转运氨基酸的前题

11 校正tRNA (突变修复机制)-无义抑制 Though there is a nonsense mutation on mRNA, there is also a change on tRNA anticodon, therefore tRNA can still recognize the mutated mRNA and insert an amino acid and keep the peptide synthesis going. UUG: Leu UAC: Tyr AUG Tyr

12 校正tRNA－错义抑制 GGA: Gly AGA: Arg Wild type: GGA is recognized by Gly-tRNA
Missense mutation: AGA is recognized by Arg-tRNA GGA: Gly AGA: Arg Suppressor: AGA is recognized by mutated Gly-tRNA (anticodon of Gly-tRNA mutated)

13 mRNA及遗传密码 mRNA作为蛋白质生物合成的直接模板。 2. mRNA分子中核苷酸顺序与蛋白质分子中氨基酸排列顺序通过遗传密码相沟通。
3. 每三个核苷酸组成一个密码子，四种碱基可组成64种密码子，代表20种氨基酸，AUG既是起始密码，同时也是蛋氨酸密码子; UAA、UGA、UAG作为终止密码。很重要：加tag; truncating mutation (insert or mutate into a stop codon)

14 遗传密码的特点 (1)连续性和方向性(5’3’): 两个密码子之间无任何核苷酸加以隔开 (commaless)和重叠(nonoverlapping)，如插入/删除碱基，可发生移码突变或框移, “后果很严重”。 Excessive bleeding, after a minor accident, developed subretinal hemorrhage leading to the loss of an eye. Hollopeter et al, Nature 2001 Nurden et al, J Clin Invest 1995

15 遗传密码的特点 (2)简并性 (degeneracy): 除Met （methionine）、Trp (tryptophan)外，其余氨基酸均由2个以上密码子编码。其中UAA, UGA, UAG是终止密码子, AUG是起始密码子同时又编码蛋氨酸；但细菌例外，在细菌中GUG表示起始的甲酰蛋氨酸

16 How can we take advantage of degeneracy of genetic codon?
Insert a restriction enzyme site (site-directed mutagenesis) without changing amino acid sequence. Inactivate restriction enzyme site without changing amino acid sequence to facilitate enzyme digestion. Galpha13 SalI Val: GTC GTA GTG GTT GTCGAC V D pUC92

17 遗传密码的特点 The near-universality of genetic code means:
(3)通用性 (universality or generality):所有的生物使用同一套密码子，仅有少数例外，例如：线粒体起始密码子为AUG、AUU;终止密码为AGA，AGC；色氨酸为UGA等. The near-universality of genetic code means: 1. All surviving life on earth is descended from a common ancestor; 2. Eukaryotic proteins can be expressed in prokaryotic cells: To manufacture protein drugs; To characterize human protein structure and function.

18 遗传密码的特点 ACG 5′ 3′ 5′ 3′ UGU （4）摆动性(wobbling)：一种氨基酸可有多个密码子
反密码子与mRNA的第三个核苷酸配对时，不严格遵从碱基配对原则，可出现U-G, I-C, I-A,此种配对为不稳定配对，又称摇摆性。一般前两个碱基决定其专一性，第三位碱基可有变异. ACG 5′ 3′ mRNA 61 sense codons, 31 (40+-) tRNAs with different anticodons 2 out of 3 reading Wobble base paring contributes to degeneracy 5′ 3′ UGU Thr tRNA反密码环

19 遗传密码的摆动性 Wobble base paring contributes to degeneracy

20 原核细胞mRNA的结构特点 一条mRNA链编码几种功能相关的蛋白质 5 3 顺反子 顺反子 顺反子 SD区 插入顺序 插入顺序 末端顺序
AGGAGGU 插入顺序 插入顺序 末端顺序 先导区 一条mRNA链编码几种功能相关的蛋白质 位于mRNA编码区上游的一个短片段，由10个碱基（5’AAACAGGAGG3’）组成，称为SD (Shine-Dalgarno)顺序，与30S小亚基中的16S rRNA3’端的六碱基顺序（3’UCCUCC5’）顺序互补，这意味着核糖体能选择正确的AUG密码来起始蛋白质的合成。

21 S-D序列 位于mRNA编码区上游的一个短片段，由10个碱基（5’AAACAGGAGG3’）组成，称为SD顺序，与30S小亚基中的16S rRNA3’端的六碱基顺序（3’UCCUCC5’）顺序互补，这意味着核糖体能选择正确的AUG密码来起始蛋白质的合成。

22 真核细胞mRNA的结构特点 m7G-5ppp-N-3 p 一条mRNA链只能为一种蛋白质编码 5 “帽子” PolyA 3
顺反子 5 “帽子” PolyA 3 AAAAAAA-OH 一条mRNA链只能为一种蛋白质编码

23 原核生物的多顺反子 真核生物的单顺反子 蛋白质 蛋白质 非编码序列 核蛋白体结合位点 起始密码子 终止密码子 编码序列 3 5 PPP
mG - 5 3 蛋白质 AAA … 非编码序列 核蛋白体结合位点 起始密码子 终止密码子 编码序列

24 Peptidyl transferase activity
核糖体 核糖体是由rRNA（ribosomal ribonucleic acid）和多种蛋白质结合而成的一种大的核糖核蛋白颗粒，蛋白质肽键的合成就是在这种核糖体上进行的. Peptidyl transferase activity 3’端保守序列和mRNA的SD序列结合 Ribosomes are large ribonucleoprotein particles that contain more RNA than protein and dissociate into large and small subunits

25 核糖体 分类：一类附着于粗面内质网参与分泌蛋白的合成；另一类游离于胞质，参与细胞固有蛋白质的合成.
 分类：一类附着于粗面内质网参与分泌蛋白的合成；另一类游离于胞质，参与细胞固有蛋白质的合成. 功能：核糖体相当于装配机，大亚基有转肽酶活性(23S RNA, catalyze peptide bond formation)，促进氨基酸合成多肽.

26 rRNA的结构 修饰碱基较少(1%):多为甲基化 不同来源的rRNA某些区域具有高度的同源性 含有大量的茎环结构：
16S rRNA的两个功能区：3‘ 端SD序列结合区；3‘ 端IF3结合区. 23S rRNA的功能区：peptidyl transferase activity区.

27 rRNA与蛋白质的结合 结合位点：抗核酸内切酶作用区（具有特殊的二级结构） 结合过程
直接结合: 在构象变化的基础之上结合,rRNA与protein分处于核糖体的两端.

28 多核蛋白体( 原核和真核生物) 一条mRNA上同时结合多个核蛋白体进行蛋白质多肽链合成

29 第二节 蛋白质的生物合成过程 ★氨基酸的活化与转运 ★多肽链合成的起始 ★肽链的延长 ★肽链合成终止（以原核为例）

30 氨基酸的活化与转运 氨基酰tRNA的生成--- 氨基酸的活化 Watson:
James Watson ( ) Entered Univ of Chicargo at age of 15. Got PhD from Indiana Univ at the age 22 Francis Crick ( ) 提出tRNA应接器假说 Nature 1953, 1 page, 1 figure Watson: Ideas are more important than facts. New ideas need new facts. Never be in a room where you are the brightest person. Choose a field ahead of time but expecting to get an answer in reasonable time

31 1.参与活化转运的酶     氨基酰-tRNA合成酶:特异性强,催化特定的氨基酸与特异的tRNA结合，每种氨基酸有特异的合成酶催化，此种特异性保证了遗传信息准确翻译(One synthetase for each amino acid, a single synthetase may recognize multiple tRNAs for the same amino acid) Structure of an aminoacyl-tRNA synthetase bound to a tRNA.

32 2.催化过程      氨基酸+ATP+tRNA→氨基酰-tRNA+AMP+ppi

33 氨基酰-tRNA合成酶 活化： 转移： 氨基酰－tRNA合成酶的3个结合位点 氨基酸和ATP形成氨基酰腺苷酸 氨基酰转移到tRNA上

34 氨基酰-tRNA合成酶－动力学校对 酶对正确的tRNA有高的亲和力 不正确tRNA发生氨基酰化作用很慢
 氨基酰-tRNA合成酶用校对（proofreading） 机制来控制识别正确的tRNA和氨基酸。

35 氨基酰-tRNA合成酶－化学校对 水解错误的氨基酰－tRNA 水解错误的氨基酰－腺苷酸，

36 氨基酰tRNA的表示方法 丙氨基酰tRNA：ala-tRNAala 精氨基酰tRNA：arg-tRNAarg
甲硫氨基酰tRNA： met-tRNAmet 起始密码子AUG编码的met(甲硫氨酸)由tRNAimet （真核），tRNAfmet （原核）转运 在肽链延长中methionine由tRNAemet转运

37 指mRNA、起始氨基酰－tRNA分别与核蛋白体结合而形成翻译起始复合物的过程。
肽链合成的起始 指mRNA、起始氨基酰－tRNA分别与核蛋白体结合而形成翻译起始复合物的过程。 1. 核蛋白体大小亚基分离； 2. mRNA在小亚基定位结合； 3. 起始氨基酰-tRNA的结合； 4. 核蛋白体大亚基结合。

38 核蛋白体大小亚基分离 16S rRNA的 3‘端IF3结合区. IF-3 IF-1

39 核蛋白体大小亚基分离

40 mRNA在小亚基定位结合 S-D

41 起始氨基酰tRNA结合到小亚基 S-D

42 核蛋白体大亚基结合形成起始复合物 PPi IF-2 GDP IF-1 IF-3

43 肽链合成的延长是指根据mRNA密码序列的指导依次添加氨基酸从N向C端延伸肽链，直到合成的终止。分三步： 进位 成肽 转位
肽链合成延长 肽链合成的延长是指根据mRNA密码序列的指导依次添加氨基酸从N向C端延伸肽链，直到合成的终止。分三步： 进位 成肽 转位

44 是指根据mRNA下一组遗传密码指导，使氨基酰－tRNA进入核蛋白体A位
进位 Tu Ts GTP 是指根据mRNA下一组遗传密码指导，使氨基酰－tRNA进入核蛋白体A位

45 Ts fMet fMet GTP Tu GDP GTP

46 成肽 fMet E位 是转肽酶(peptidyl transerase, 23S RNA in the large ribosome subunit)催化的肽键形成的过程

47 转位 fMet E位 在转位酶的作用下，促进核糖体向mRNA的3‘测移动，使新形成的肽酰tRNA和mRNA相对位移,由A位进入核蛋白体P位，而卸载的tRNA进入E位

48 转位 AA3 Tu fMet GTP E位

49 进位 成肽 转位

50 当核蛋白体A位出现终止密码后，多肽链合成停止，肽链从肽酰－tRNA中释出，mRNA、核蛋白体大小亚基等分离
肽链合成的终止 当核蛋白体A位出现终止密码后，多肽链合成停止，肽链从肽酰－tRNA中释出，mRNA、核蛋白体大小亚基等分离

51 RF

52 真核生物的肽链合成过程 （一）起始: 起始复合物的形成 1. 核蛋白体大小亚基分离； 2. 起始氨基酰-tRNA的结合；
3. mRNA在小亚基定位结合； 4. 核蛋白体大亚基结合。

53 Met-tRNAiMet－eIF-2－GTP
真核生物翻译起始复合物形成 eIF-3 40S 40S mRNA Met ② ATP eIF4E, eIF4G, eIF4B, eIF4A,PAB ③ Met Met-tRNAiMet－eIF-2－GTP ADP+Pi 40S 60S Met eIF-5 eIF-2B eIF-3 eIF-6 eIF released ④ ① ADP+Pi 40S 40S 60S Met

54 真核生物翻译起始复合物形成 真核细胞mRNA5‘端可能有多个AUG密码子，但起始密码子位于Kozak共有序列（Kozak consensus sequence: ACCAUGG）,该序列突变可降低核糖体的翻译活性。 -Ding et al, Blood 2003 Ding et al, Am J Physiol 2005

55 （二）延长 真核生物肽链合成的延长过程与原核生物基本相似，但有不同的反应体系和延长因子。
另外，真核细胞核蛋白体没有E位，转位时卸载的tRNA直接从P位脱落。

56 （三）终止 真核生物翻译终止过程与原核生物相似，但只有1个释放因子eRF，可识别所有终止密码子，完成原核生物各类RF的功能。

57 真核与原核蛋白质合成的异同   真核                原核 核蛋白体           80S                 70S 含蛋白数量      多于80              少于60 小亚基结构 无嘧啶区与mRNN SD序列互补 含嘧啶区与SD序列互补 tRNA               tRNAimet            tRNAfmet 启动       小亚基先与Met-tRNAiMet结合， 小亚基先与mRNA结合,再与 再与mRNA结合 与fMet-tRNAfMet结合 延长              EF1,EF2             EFTu EFTs 终止              RF       RF1，RF2，RF3