第十单元 免疫缺陷性疾病的免疫学检测.

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1 第十单元 免疫缺陷性疾病的免疫学检测

2 实验一 HIV抗体初筛实验

3 获得性免疫缺陷综合征 是由人类免疫缺陷病毒（HIV）感染所引起的以CD4+ T细胞减少为主要特征，同时伴反复机会感染、恶性肿瘤及中枢神经系统退行性病变的一组综合征。

4 检测方法 HIV感染的免疫学检验方法主要针对病毒抗原和抗病毒抗体的检测以及免疫细胞数量和功能的分析。
HIV抗体初筛实验主要包括酶联免疫吸附试验（ELISA）、化学发光或免疫荧光试验、快速检测试验（明胶颗粒凝集试验、免疫渗滤试验和免疫层析试验）等。 ELISA是最常用的HIV抗体初筛实验方法。本实验采用双抗原夹心ELISA法检测人血清中HIV抗体。

5 实验条件 在符合Ⅱ级生物安全实验室（BSL-2）要求的艾滋病检测实验室中进行。

6 实验原理 将HIV抗原包被于固相载体，加入待检样品和酶标记的HIV抗原，形成抗原－抗体－酶标抗原复合物，洗涤，加底物显色。通过酶标仪检测吸光度A450nm 值，根据A450nm 值判断HIV抗体的存在与否。

7 试剂与器材 1.HIV抗原酶标板。 2.洗涤液 PBS-Tween20。 3.辣根过氧化物酶标记的HIV抗原。 4.辣根过氧化物酶底物溶液。
5.底物稀释液 PBS-1%BSA。 6.终止液 2mol/l H2SO4溶液。 7.对照血清 临床标本筛选获得的阳性血清和阴性血清。 8.酶标仪、洗板机。

8 操作步骤 编号：将样品对应微孔按序编号，每板设阴性对照2孔、 阳性对照3孔，空白对照2孔 加样：分别在相应孔加入待检标本、阴性、阳性对照
100μl，用封板膜封板后置37℃温育60min。 洗涤：用洗板机清洗，在干净滤纸上拍干。 加酶：每孔加酶结合物100μl（空白对照孔除外），充分 混匀，置37℃温育30min。 显色：每孔加入底物缓冲液50μl，TMB 50μl，振荡混 匀，37℃避光显色10min。 测定：每孔加终止液50μl，振荡混匀。在450nm波长 下，酶标仪测定各孔A450nm值。

9 结果判断 计算临界值：临界值=阳性对照值×10%。
正常情况下，阳性对照孔的A450nm值≥0.80，样品A450nm值≥临界值者为HIV抗体阳性。 正常情况下，阴性对照孔的A450nm值≤0.08，样品A450nm值＜临界值者为HIV抗体阴性。

10 注意事项 实验中设立阳性与阴性对照。 底物显色时间不宜过长。 注意生物安全。
对初筛呈阳性反应的样品，应进行复检试验。如复检均呈阴性，则报告HIV抗体阴性（-）；如均呈阳性反应，或一阴一阳，应送HIV确证实验室进行确证试验。

11 临床意义 作为HIV感染的筛查实验。HIV有两个血清型：HIV-1和HIV-2，后者少见。此试验阳性者应进一步作确证试验。 思考题 ELISA是检测HIV抗体的常用方法，但并不是唯一的方法。化学发光或免疫荧光试验、免疫胶体金以及免疫层析实验等均可用于HIV抗体的检测，试比较各种方法之间的优缺点。 第三军医大学 吴超

12 实验二 HIV确认实验

13 HIV抗体初筛试验阳性者，须作确证试验。确证实验必须在专门的艾滋病确证实验室中进行，并最终确定患者是否感染HIV。
确证试验方法包括免疫印迹试验、条带免疫试验、放射免疫沉淀试验、免疫荧光试验等。 免疫印迹实验(Western Blot，WB)是用以检测HIV抗体的首选确证试验方法，其检测结果常常被作为鉴别其他检验方法优劣的“金标准”。

14 实验原理 以硝酸纤维素膜为载体的抗原条，组合了HIV-1全病毒抗原和HIV-2 gp36重组蛋白抗原。当抗原条与被检血清及对照血清接触时，如血清标本有HIV-1/HIV-2特异性抗体，将会与抗原条上的HIV-1/HIV-2 gp36抗原结合。结合的抗体再与酶标二抗结合，加入底物显色，观察结果判断。

15 试剂与器材 1.HIV1/2抗原硝酸纤维膜条 20条 2.印迹缓冲液（10×） 12ml 3.漂洗缓冲液（10×） 60ml
4.底物BCIP/NBT溶液                        50ml 5.结合物                                              70μl 6.HIV1/2阴性对照血清                       70μl 7.HIV1弱阳性对照血清                   70μl 8.HIV1强阳性对照血清                   70μl 9.反应槽、摇床、移液管、吸引器

16 操作步骤 取出反应槽，每一槽内加2ml漂洗缓冲液。 用镊子小心地夹住抗原条编号端放入漂洗缓冲液中，编号面朝上，每槽1条，让溶液完全覆盖。
将反应槽放置摇床，摇动5～10分钟后吸弃漂洗液。 每槽加入印迹缓冲液2ml，然后分别加入20μl待检血清或血浆，并用本试剂盒中的对照血清作平行对照。 在室温下将反应槽在摇床上摇动60分钟。旋摇完毕后，吸弃印迹缓冲液。

17 每槽加入2ml漂洗缓冲液，旋摇5分钟后，吸弃漂洗缓冲液，共漂洗3次，每次5分钟。
从槽中吸弃结合物稀释液，重复步骤6。 每槽中加入底物2ml，旋摇15分钟。 吸去底物液，每槽中加入2ml蒸馏水，旋摇5分钟 后，终止反应。将抗原条放于二张滤纸间吸干水分后观察结果。

18 结果判断 1. 对照血清检测结果判定要求 ① HIV-1强阳性对照血清：必需出现gp160/gp120和gp41、p24带型，以及p66、p55/p51、p34、p17带型判定为阳性，HIV-2 gp36应为阴性。 ② HIV-1弱阳性对照血清：在gp160、gp120和gp41、p24带型中至少出现二条，判定为阳性。其他位置其可能出现弱带，但对分析并非必需。HIV-2 gp36应为阴性。 ③ HIV-2阳性对照血清：必需出现gp36重组蛋白带型。 ④ 阴性对照血清：应无上述的特异性带型出现。

19 2. 被检血清/血浆的判定标准 有下列情况之一者判定为HIV-1抗体阳性。 ①至少一条env带和一条pol带；
②至少一条env带和一条gag带； ③至少一条env带、一条gag带和一条pol带； ④至少二条env带； 有HIV-2 gp36重组蛋白带型出现者判定为HIV-2抗体阳性，需用HIV－2确认试剂进一步检测。 无HIV抗体特异性带型出现者判定为HIV抗体阴性。 出现HIV特异性抗体带型，但带型不足以确认阳性者，判定为HIV抗体可疑。

20 注意事项 实验中必须同时设定HIV-1强阳性、HIV-1弱阳性和HIV-1+2阴性血清对照。
如果抗原条和血清样品作用时间过长，阴性样品也可能出现弱带。 凡溶血、脂血或混浊样品均为不宜检测标本。 试验中操作应注意生物安全。 底物显色时间，一般控制在30分钟内。时间太长，本底变深；如果强阳性血清色带增深时可提前终止反应；若弱阳性对照血清色带较浅，可以适当延长反应时间。

21 临床意义 用于在初筛试剂判断为HIV阳性(如ELISA法)基础上的血清或血浆样本，进行确证是否为HIV-1阳性及诊断是否感染了HIV-2。

22 思考题 第三军医大学 吴超 HIV血清抗体检测的初筛实验和确认实验在检测HIV感染的临床意义及实验原理上的差异？
免疫印记实验、条带免疫试验、放射免疫沉淀试验及免疫荧光试验（IFA）等均可用作HIV的确认实验，试分析免疫印记实验应用如此广泛的原因 ? 第三军医大学 吴超

23 实验三 T细胞亚群的流式细胞仪检测

24 背景知识 HIV感染可导致免疫系统中CD4+T细胞数量减少以及CD4+ T细胞/CD8+ T细胞比例失调，因此，CD4+T细胞计数可用于评价HIV感染者免疫状况，辅助临床进行疾病分期。 CD4+T淋巴细胞数量还可评估HIV感染者机会性感染的风险，辅助判断是否进行预防性治疗。

25 CD4+和CD8+T淋巴细胞计数的方法分为两大类，一类是应用流式细胞仪测定法，另一类是非流式细胞仪测定法。其中，流式细胞仪检测是目前应用较为普遍的一种方法，包括多平台法和单平台法。

26 实验原理 流式细胞仪可检测单细胞或微粒的信号，将待测细胞或微粒进行荧光染色后制成悬液标本，在一定气体压力下将待测样品压入流动室，待测细胞在鞘液的包裹下单行排列，依次通过流式细胞仪的检测区域。单平台方法即应用三色、四色流式试剂配以内参绝对计数微球，加上流式细胞仪淋巴细胞亚群获取和分析软件，一步即可获得T细胞亚群的相对数（百分比）和绝对数。通过使用已知数量的参考微球为内参，可通过获取的目标细胞与参考微球的比例、参考微球数量和样品体积，得到每微升的淋巴细胞数量。

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28 试剂与器材 TruCOUNT绝对计数管。 TriTEST三色试剂CD4-FITC/CD8-PE/CD3-PerCP或MultiTEST四色试剂CD3-FITC/CD8-PE/CD45-PerCP/CD4-APC。 FACS Lysing Solution（10X） 蒸馏水（0.45μm过滤）配制成1X浓度的溶血素； PBS鞘液 μm过滤； BD CaliBRITE Beads及BD TruCOUNT controls。 流式细胞仪。

29 操作步骤 1.标本制备：采集外周静脉血2-3ml,EDTA-K3抗凝。标本 与试剂用前轻轻摇匀；
2.准确加入20μl荧光试剂和50μl全血，充分混匀； 3.充分混匀，室温（20～25℃）避光反应15min； 4.加入450μl FACS溶血液 (1X)，充分混匀； 5.充分混匀，室温（20～25 ℃ ）避光放置15min； 6.24h内流式检测。

30 结果判断 单平台一步法由计算机软件直接出结果并打印出报告单，报告单的内容包括如下： 项目 单位 参考正常值范围 CD3+/ CD45+ %
56%～85% CD3+绝对数 个/μl 1027～2086 CD3++ CD8+/ CD45+ 15%～34% CD3++ CD8+绝对数 323～836 CD3++ CD4+/ CD45+ 30%～54% CD3++ CD4+绝对数 706～1125 CD4+/ CD8+比值 1～2

31 注意事项 用于流式细胞仪免疫表型检测的抗凝剂 K2EDTA、K3EDTA、酸性枸橼酸葡萄糖溶液（ACD）或肝素抗凝
一般要求48h内染色，染色后6h内分析。如采血后24h内染色，则可在染色后24h内分析。 在室温（18～25℃）保存和运输样品，避免极端温度（结冰或大于37℃）。高温季节，需用隔热容器盛装样品，并将其置于有冰袋和吸热物质的容器中。 溶血、凝血或结冰的样品应视为不合格样品，超过检测允许时间的样品不可检测。 应报告所有相关数据的正常值范围，且每个实验室都应测定参考数值。

32 临床意义 ①用于HIV感染者的疾病分期： 凡CD4+T淋巴细胞＜200/μl或CD4+T淋巴细胞的百分比＜14%的HIV感染者可归入艾滋病。
②判断HIV感染的临床合并症：如CD4+T淋巴细胞＜200/μl时，易发生卡氏肺囊虫肺炎；而巨细胞病毒感染和鸟分支杆菌感染常发生于CD4+T淋巴细胞＜50/μl的病人，极少见于CD4+T淋巴细胞＞100/μl的病人。

33 思考题 T淋巴细胞的流式细胞检测技术包括多平台法和单平台法，试述两种方法的差异？ 第三军医大学 吴 超

34 临床见习： HIV抗体初筛试验

35 见习要点 了解HIV抗体初筛试验的实验室要求和检测流程与质量控制，熟悉用于HIV抗体初筛试验的样品种类与采集要求，掌握HIV抗体初筛试验中ELISA检测方法原理与结果分析。

36 基本原理 采用双抗原夹心ELISA法检测血清中HIV（1+2）抗体。HIV抗原包被于固相载体，加入待检样品和酶标记的HIV抗原，形成抗原－抗体－酶标抗原复合物，洗涤，加底物显色。通过酶标仪检测吸光度（OD值），根据OD值判断HIV抗体的存在与否。

37 样品的采集与要求 1．采样前准备 HIV抗体初筛试验可采用血清、血浆样品。
根据检测项目的具体要求，确定采集样品的种类、处理、保存及运输的时限和方法，按照临床采血技术规范的要求操作，遵守生物安全要求。 检查所需物品是否已备齐，是否在有效期内，有无破损，是否足量，特别应检查受检者信息与样品容器表面的标记是否一致，并注明样品采集时间。选择合适的室内（外）采血空间，受检者坐（卧）于合适的位置，准备采血用具、皮肤消毒用品、采血管及试管架、硬质废弃物容器等。

38 2．采集和处理样品 ①血浆：将采集的抗凝全血1500～3000r/min离心15min，上层即为血浆，吸出置于合适的容器中，备用。
②血清：根据需要，用一次性注射器（或真空采血管）抽取5～10ml静脉血，室温下自然放置1～2h，待血液凝固、血块收缩后再用1500～3000r/min离心15min，吸出血清，置于合适的容器中，备用。

39 3．样品的保存 用于HIV抗体检测的血清或血浆样品，短期（1周）内进行检测的可存放于2～8℃， 一周以上应存放于-20℃以下。艾滋病检测筛查实验室检测的筛查阳性样品应及时送确证实验室，而筛查阴性样品，可根据具体需要决定保存时间，建议至少保存1～2个月。特殊用途或专项项目的样品根据具体要求确定保存时间。

40 4．样品的运送 根据符合生物安全要求；要获得相应部门批准并由具有资质的人员专程护送。应采用三层容器对样品进行包装，随样品应附有与样品唯一性编码相对应的送检单。送检单应标明受检者姓名、样品种类等信息，并应放置在第二层和第三层容器之间。

41 筛查程序 1．初筛试验 根据检测目的选用符合要求的筛查试剂对样品进行初筛检测，对呈阴性反应的样品，可出具HIV抗体阴性（-）报告；对呈阳性反应的样品，需要进一步做复检试验和确证试验。

42 2．复检试验 对初筛呈阳性反应的样品，应使用原有试剂和另外一种不同原理（或厂家）的试剂，或另外两种不同原理或不同厂家的试剂进行复检试验。如果初筛检测使用抗原抗体联合试剂，则复检必须包括一种抗原抗体联合试剂。如两种试剂复检均呈阴性反应，则报告HIV抗体阴性（-）；如均呈阳性反应，或一阴一阳，需送艾滋病确证实验室进行确证试验（图图 HIV抗体筛查检测流程）。如果抗原抗体联合试剂检测呈阳性反应，而抗体试剂检测为阴性反应，则应考虑进行HIV-1 p24抗原或核酸检测，必要时进行随访。 艾滋病检测筛查实验室复检判定为阳性反应的样品，确证实验室可以直接进行确证试验。

43 3. 初筛和复检流程 样品 初筛试验 筛查试剂 阳性反应 阴性反应 复检试验 均阳性反应 一阴一阳 均阴性反应 确证试验 报告阴性 +
原有试剂或同一试剂商不同原理试剂 均阳性反应 一阴一阳 均阴性反应 确证试验 报告阴性 另一不同原理试剂或另外两种不同试剂商试剂 + 图 HIV抗体筛查检测流程

44 4．筛查试验结果的报告 HIV抗体筛查试验用附表1 （见实验指导教材）进行报告，阴性反应报告为“HIV抗体阴性（-）”；阳性反应报告为“HIV抗体待复检”。

45 5．筛查试验呈阳性反应样品的转送 如需送上级实验室进行复检，需要核对身份，补充个人信息（如姓名和身份证号码），必要时采集第二份血样，持HIV抗体筛查报告，送当地艾滋病筛查中心实验室，或直接送确证实验室复检。HIV抗体复检试验用附表2（见实验指导教材） 进行报告，两次检测均阳性或一阴一阳报告为 “HIV抗体待确证”；两次检测均阴性报告为“HIV抗体阴性（-）”。HIV抗体复检报告需由1名检验人员和1名审核人员签字。

46 质量控制 1．试剂盒内部对照 试剂盒内部对照质控品即为试剂盒内提供的阳性和阴性对照血清。试剂盒内部对照用于判断每次实验的有效性，但不能作为室内质控品使用。每一次检测临床样品时，必须有试剂盒内部对照，而且只能在同批号的试剂盒中使用。内部对照结果无效，必须重新试验。

47 2．室内质控品 为非试剂盒组份的外部质控品，是为了监控检测的重复性而设置的，包括强阳性、弱阳性和阴性质控血清。也可以只设置一个弱阳性质控，以该试剂盒临界值（Cut-off）的2～3倍为宜。外部质控品的作用是，判断该批临床样品检测的有效性，因此，每次实验必须包含室内质控品，其结果无效，必须重新试验。室内质控品可以是商品或实验室自行制备。

48 3．建立质控图 最常用的质控图是Levey-Jennings质控图，该图使用累计和技术或趋势分析技术的图形提供系统偏移和漂移的状况。

49 （1）建立质控图参数：外部质控品的均值和标准差应建立
在实验室常规使用方法对外部质控品重复测定的基础 上。一般采用在不同批次检测取得至少20个数据；如 果仅做少量批次的检测，也至少做5个批次的检测，每 个批次中不少于4个质控血清测定结果，以建立一个临 时性的均值和标准差，当达到20批次数据后，替代临 时性的均值和标准差。 （2）绘制质控图：质控图是把检测数据与已确定的（计算 出的）“控制限”进行比较的图，包含一条中心横线和 其上、下两条平行的控制线，并按时间顺序点入本实 验室每批次试验质控血清的测定值。

50 （3）质控规则及其使用:实验室在报告实验结果之前必须评 价质控数据，可通过图形记录的检查或由计算机审核
结果来决定。目前有许多质控规则，常用的是12S和 13S规则。 ①告警（12S）：当外部质控品的S/CO值超出 +2s范围时，系统处于告警状态，应予注意，是否可以继续检测需要进一步观察。若将12S做失控标准，有较高的假失控概率，所以一般不采用。 ②失控（13S）：当外部质控品的S/CO值超出 +3s范围时，系统处于失控状态，本次实验结果不能被接受，可能是系统误差、随机误差或外部质控品 稳定性下降所致。 ③ 漂移：连续几次（3～5次）外部质控品的S/CO值都落在均值的一侧则称为漂移，提示实验条件发生了较大的变化。 ④趋势：连续几次（5～7次）外部质控品的S/CO值几乎按一个方向分布时称为趋势，通常由参数的缓慢改变引起。

51 （4）质控图的分析及失控处理：实验室应建立质控图分析及失控情况处理程序。当质控已有计划并恰当地执行时，要求可靠的均值和标准差用于计算质控限，将假失控概率降到最低。当出现失控时，对原有外部质控品重复测定或更换新的外部质控品进行测定不是最有效的方法，必须找出问题发生的原因，找出解除问题的方法，并消除原因，防止将来出现同样的问题。

52 4．室内质控其他方式— “即刻法”质控 “即刻法”质控方法是在对同一批外部质控血清连续测定3次后，即可对第3次检验结果进行质控。具体计算方法如下： （1）将质控血清的测定值从小到大排列：x1、x2、x3……xn（x1为最小值，xn为最大值）。 （2）计算 和s。 （3）计算SI上限值 和SI下限值。

53 （4）将SI上限、SI下限与SI值表中的数字比较。

54 ① 当SI上限和SI下限<n2s时表示处于控制范围内，可以继续测
定。继续重复以上各项计算。 ② 当SI上限和SI下限有一值处于n2s～n3s值之间时说明该值在 2s～3s范围，处于“告警”状态。 ③当SI上限和SI下限有一值> n3s值时说明该值已在3s范围之 外，属“失控”。 “即刻法”只能在前20次内使用，超出即可采用L-J质控图方法。

55 见习报告 第三军医大学 吴 超 1.结合见习实验室的HIV抗体初筛试验，叙述HIV抗体初筛 试验的样品种类与采集、保存与运送要求。
流程。 3.实验室质量控制在HIV抗体初筛试验中重要性。 第三军医大学 吴 超