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普通植物病理学 General Plant Pathology
教师： 黄 家 风 院系: 农学院植保系
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第七节 植物病毒的鉴定 Section 7 The identification of Plant virus
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植物病毒分类是将已知病毒按一定标准、相似程度或相关性的顺序排列，拼成一个分类系统。
植物病毒鉴定的主要目的是确定一种未知病毒在分类系统中的地位。 植物病毒个体微小，结构简单，对寄主的依赖性强，鉴定工作难度大，技术性强，对工作条件的要求高。
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鉴定方法过去大多采用病毒间的生物学特性的差异（如症状类型、传播方式、寄主范围等），现在增加了病毒核酸蛋白分子生物学、生物化学等方面的方法。
常用方法有生物学实验、血清学检测，电子显微镜观察和分子生物学鉴定。
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一、生物学实验 (Biological Assay)
目的： 是确定病毒的侵染性、传播性，证明病毒与病害的直接相关性，明确病毒所致病害的症状类型和寄主范围 内容： 植物病毒的分离纯化 鉴别寄主 寄主范围 传播方式
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（一）植物病毒的分离与纯化 田间自然病株往往并非只带一种病毒，如果不加以人工的分离纯化，或者被分离出的并非所查病害的致病病原，而是两种以上的病毒的混合物，那么所做的任何定性和定量的测定都是毫无意义的。 病毒的分离纯化最常用的是： 枯斑寄主 过滤寄主 专化性介体
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1．枯斑寄主 将田间采集的病叶人工接种在寄主植物上，确定其侵染后，利用它在某些植物上产生的枯斑，进行单斑分离，一般三次 ，可使病毒纯化。因为一个局部枯斑就是一个侵染点，因此一个枯斑中的病毒应该是比较统一的。
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2．过滤寄主 混合感染 分离出PVX PVX PVY 混合感染 分离出TMV TMV CMV
利用某一寄主对不同病毒的抗性差异将病毒分离开来，即某种寄主对一种病毒是免疫的，而对另一种病毒是感染的，或对一种病毒是感染的，而对其它几种病毒是免疫的。如： 混合感染 分离出PVX PVX PVY 接种蔓陀罗 混合感染 分离出TMV TMV CMV 接种心叶烟
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3．专化介体 利用介体种间对病毒亲和力和传毒特性的差异来分离病毒，如 TMV蚜虫不传，CMV蚜传； BBWV能蚜传，RTV能被线虫线。
二者可分开
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（二）鉴别寄主（identification host）
1、鉴别寄主定义： 用来鉴别病毒或其株系的具有特定症状反应的植物。 凡是病毒侵染后能产生快而稳定、并具有特征性症状的植物都可作为鉴别寄主。 产生红色边缘的局部枯斑 PVX 接种千日红 产生系统枯斑 PVM 接种 白花曼佗罗
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2、鉴别寄主谱：组合使用的几种或一套鉴别寄主，一般包括
系统侵染的寄主 局部侵染的寄主 不受侵染的寄主 virus 普通烟 心叶烟 黄瓜 白菜 芜菁花叶病毒（TuMV） 局部枯斑 系统枯斑 不感染 系统花叶 萝卜花叶病毒（RMV） 局部或系统枯斑 黄瓜花叶病毒（CMV） 不侵染或系统花叶 烟草花叶病毒（TMV）
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（三）寄主范围 每种病毒都有一定的寄主范围，并在这些寄主上产生一定的症状类型。
寄主范围测定有助于了解病毒繁殖、测定、保存时选用什么样的寄主，及病害防治。 用以测定植物病毒寄主范围的植物应为： 1）与原寄主亲缘相近的植物； 2）病田周围的作物和杂草； 3）传毒昆虫栖息繁殖的植物。
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病毒中的花叶型、环斑型常用，而黄化型很难。
（四）传染方式测定 1、机械传播（mechanicd incfection） 病毒中的花叶型、环斑型常用，而黄化型很难。 机械接种的方法有:摩擦接种法、快速擦伤接种法、喷枪接种法、组织接种法、注射接种法、浸根接种法。
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2、graft infection 只能证明这种病可以传染，至于病株中有几种病毒和病毒的性状，嫁接很难提供更多的情况；
无法反映病毒在自然界中的传染方式，但对果树和木本植物病毒的研究，嫁接还是很重要的实验方法。
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3、种子传染 seed infection 诊断方法：
1）播种试验，从病株上收集种子，播种在防虫温室内经消毒的土壤(干热120℃ 2honrs)中并以同样数目的健康种子作为对照，出苗后根据症状表现和专门检测来判断。 2）酶联免疫
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4、介体传染（vector infection）
土壤介体的试验 1）以病土种植诱发植物或指示植物，观察发病情况； 2）为了进一步确定病毒介体是线虫还是真菌： 将病土置室温晾干1—2周后或稍长时间，播种诱发植物或指示植物，丧失侵染性——线虫介体；保持侵染性——真菌介体
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介体昆虫的虫传试验（以蚜虫为例） （1）传毒蚜虫的获得与饲养 取单个孤雌胎生蚜或卵生雌蚜，放在对病毒免疫的植物上加以繁殖；笼罩隔离饲养。
（2）毒源植物： ①必须是人工严格分离的病株 ②应选症状明显，生长幼嫩的病株 ③存活时间长，对毒源专化性强，敏感性高，病毒易 于增殖的植物。
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（3）供试植物：必须保证是 ①无毒健康的植物， ②必须是易培育且敏感的植物，或选具有明显鉴别 特征的鉴别寄主。 ③供试植物一般为苗期：双子叶植物：第一片真叶 展开时，单子叶植物：2—3片或2叶1心期。
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①饥饿（非持久性病毒）：无毒蚜虫(培养皿):
（4）蚜虫接种试验程序 ①饥饿（非持久性病毒）：无毒蚜虫(培养皿): 1—18hrs, 一般0.5—2hrs为宜。 ②饲毒： 将无毒蚜虫用 毛笔转移至毒源植物，罩上防虫罩，进行饲毒， 饲毒时间10—60s（非持久性）有的可维持20hrs. ③接种（毒）杀死 饲过毒的蚜虫转移至健株，时间可维持24hrs,然后用杀虫剂杀死 ④观察，将蚜虫接过毒的植株置于防虫温室内，观察植物发病。
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二、血清学技术 Serological Technology
血清学技术是病毒诊断和鉴定的基础方法，其基本原理是抗体与抗原之间的专化性结合。
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（一）植物病毒的抗原性 1）抗原（antigen）：凡能刺激动物机体产生免疫反应的异体 物质。 2）可作抗原的抗原物质：
virus、bacterium、fungus、phytoplasm、RLO、生物细胞及其研磨物、自溶物等； 有些低分子量的物质，如核酸、多糖、脂类，当它们与protein结合形成高分子复合物时也可以获得抗原性。
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3）抗原结构： 植物病毒为核蛋白，其抗原的活性部位分布在外壳的蛋白亚基上，其外壳蛋白抗原具有专化性。其专化特性是由抗原决定簇（antigen determinant）决定的。 抗原决定簇：就是抗原分子表面（蛋白质表面）所具有的某些化学活性基因，它既是免疫细胞识别异物的标志，又是相应抗体进行专化性结合的部位。
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（二）抗体（antibody） 1)定义：具有抗原性的异体物质进入动物机体后，激发动物机体产生出免疫反应的物质，这种相应于抗原的专化性物质称作抗体。 抗体存在于血清或体液中，从含有抗体的血液中析出的血清称作抗血清（antiserum）。 抗体作为一种具有免疫特性的球蛋白，能与该抗原发生专化性免疫反应，这种球蛋白称为免疫球蛋白 (Immunoglobulin，Ig)
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抗体结构
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2）抗血清的制备。 纯化病毒注射小动物（兔子、小白鼠等），一定时间取血， 析出血清。 血清制备的关键是病毒的纯化，只有纯度高的病毒才能获得特异性强的抗血清。
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（三）血清学反应 1、定义 在活体外，于电解质溶液中，植物病毒专化性抗原与其相应的专化性抗体相结合产生可见的凝集或沉淀反应称为抗血清反应。
2、血清学反应方法 最常用的方法是： 琼脂双扩散 酶联免疫吸附试验（ELISA）
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3、胶双扩散试验（Immunodiffusion）
在一定浓度的琼脂凝胶中，抗体和抗原互相扩散，在适当的位置形成沉淀；沉淀线的形状说明抗原和抗体的相互关系。 ab a b 抗原决定簇相同 两种抗原相同 抗原决定簇部分相同 两种抗原不完全相同 有一定亲缘关系 抗原决定簇不同 两种抗原不相同 无亲缘关系
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4、酶联免疫吸附试验 （Enzyme Linked Immunosorbent assay，ELISA）
① 固相吸附和免疫酶技术相结合 ② 是免疫反应和酶的高效催化反应有机的结合。 ELISA的特点： ① 抗原抗体免疫反应在固体表面进行； ② 用酶作标记物进行病毒测定。
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ELISA反应所用的固相为聚苯乙烯微皿板
抗体 ELISA反应所用的固相为聚苯乙烯微皿板 加酶（标记抗体） 酶标抗体 （保持免疫活性） 加入抗原 酶标免疫复合物 加入相应底物 酶降解底物产生颜色反应
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目前常用的ELISA方法是 （1）双抗体夹心法（Double antibody sandwich method） 酶标记的是病毒专化的特异性抗体 （2）间接法（indirect method） 酶标记的是抗抗体（二抗） 最常用二抗是取健康家兔血清的 IgG，以此作为抗原注射山羊，使山羊产生抗家兔 IgG 的抗体，即抗抗体，提取抗抗体 IgG并用酶标记，称酶标羊抗兔 IgG，能和任何种类兔抗血清 IgG 结合，检测出抗原的存在。
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Direct ELISA Indirect ELISA
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ELISA实验中需注意的事项： 1）每次加样后都要洗板 2）酶标记的是抗体的有效成分IgG
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ELISA结果分析
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三、分子生物学鉴定 Molecular Biological Identification
1、dsRNA检测技术 提取dsRNA 电泳
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（polymerase chain reaction, PCR）
2、聚合酶链式反应 （polymerase chain reaction, PCR） 基本原理 DNA分子于不同温度下双链和单链可以互相转变的性质,在dNTP存在下，DNA聚合酶使引物沿单链模板延伸,成为双链DNA。 高温变性、低温退火、适温延伸等3步反应循环进行，使目的DNA得以迅速扩增。
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5ˊ 3ˊ 高温变性 5 5ˊ 3ˊ 5ˊ 3ˊ 低温退火 A C T G 酶 5 5ˊ 3ˊ 3ˊ 5ˊ 适温延伸 5ˊ 3ˊ
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PCR扩增产物在琼脂糖凝胶进行电泳的结果
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PCR 是在短时间内大量扩增核酸的有效方法，用于扩增位于两段已知序列之间的DNA片段。
由于引物是专化的，因此该技术可用初核酸抽取液进行。
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3、核酸杂交技术 核酸杂交技术是检测病毒全基因组或部分基因组的技术。此项技术能检测pg水平的病毒，并可用于大量样品检测。
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在核酸杂交中，要用一种预先分离纯化的已知RNA或DNA片段去检测未知核酸，这种用作检测的已知核酸序列片段称为探针。
探针上的部分核苷酸分子被用放射性同位素或生物素等标记，可以在实验室内检测出来，用以证明杂交的存在。 植物病毒的核酸大多为单链RNA，其探针为与RNA互补的DNA(cDNA)。
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核酸杂交的基本步骤包括： 1）探针标记：随机引物标记或PCR标记 2）植物组织中提取核酸（总DNA或RNA） 3）电泳：将待检测核酸进行琼脂糖电泳 4）转膜：尼龙膜 5）杂交 6）放射自显影（同位素标记）或显色（生物素标记）
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核 酸 杂 交 植物病组织 提取植物总核酸 电 泳 变 性 转 膜 加入标记探针 自显影或显色
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四、电子显微镜技术 病毒的电镜观察最常用的技术是
负染技术：通过重金属盐在样品周围的堆积而加强样品外围的电子密度，使样品显示负的反差，衬托出样品的形态和大小。 免疫电镜技术
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2）病毒制品观察 1）病组织观察
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免疫电子显微镜技术 免疫电镜是把血清学反应的特异性和电镜下形态观察结合的一种技术，可以区别出形态相似的不同病毒；
具有灵敏度高、抗原和血清用量少，反应时间短等优点，是病毒鉴定的重要方法。
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五、物理化学特性 1．植物病毒的体外性状 1）稀释限点（DEP）: 2）钝化温度（TIP）： 3）体外存活期（LIV）:
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2．病毒粒体的沉降特性 沉降系数S：是指一种物质在20℃水中在1 达因（1/981g）的引力场中沉降的速度，单位是cm/s（S20， w）
其测定用超速分析离心机，根据该病毒在一定离心力下沉降的速度来计算。 Bromovirus S20, w =86 Cucumovirus S20, w =99
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3.光谱吸收特性： 由于蛋白质和核酸都能吸收紫外线，蛋白质的吸收高峰在280nm左右，核酸在260nm左右，因此260/280的比值可以表示病毒核酸含量的多少，用于区分不同的病毒。 260/280比值小，多是线条病毒。 260/280比值高，可能是球状病毒。 对于纯化的病毒，其260/280比值偏离标准值的情况，说明病毒的纯度。 E0.1%260nm值：表示该病毒在0.1%浓度，光径为1cm比色杯中在260nm处的吸收值。
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第八节 类病毒（Viroid） 一、定义 是一类无蛋白包被的、低分子量的、具有很高碱基配对的单链环状植物致病RNA。能在寄主体内自主复制，并引起特殊的症状。
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Viroids Unique to plants 1967 Dr. Ted Diener discovered viroids
Potato spindle-tuber virus (PSTV) Unique to plants Free or naked nucleic acid (RNA) No capsid
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Viroid Structure
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Viroids
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二、类病毒不同于病毒的主要特性 1、耐热性：致死温度高于100℃；
2、高度侵染活性：50-100个分子即可成功侵染，而病毒需要100万个病毒颗粒; 3、局限的存在部位：仅发现于细胞核 4、不显性感染：PSTVd的90%以上的寄主都是不显症感染，潜育期很长，几个月至几年 5、传播方式简单：农机具传播（主要）；种子传播；节肢动物传播（极少数） 6、不能从病组织中检测出类似病毒的粒体，（在电镜下检不出任何病毒粒体）
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Viroid-caused Diseases
三、类病毒引起的主要病害 Viroid-caused Diseases Potato spindle tuber (PSTVd)- 1922 Avocado Sunblotch (ASBVd)- 1928 Tomato apical stunt (TASVd)- 1931 Coconut cadang-cadang (CCCVd)- 1937 Chrysanthemum stunt (CSVd)- 1947 Citrus exocortis (CEVd)- 1948 Chrysanthemum chlorotic mottle (CChMVd)- 1969 Hop stunt (HSVd)- 1970 马铃薯纺锤块茎病 鳄梨日斑病 番茄顶缩病 椰子死亡病 菊矮化病 柑橘裂皮病 菊矮化 啤酒花矮化
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马铃薯纺锤块茎病
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apple scar skin viroid Photographs courtesy of E.V. Podleckis
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菊花矮化类病毒病.
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Chrysanthemum stunt viroid
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