鲜乳中抗生素残留检验 GB/T4789.27-2008.

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1 鲜乳中抗生素残留检验 GB/T

2 本标准与 AOAC方法的主要区别 ——扩大适用范围为鲜乳中能抑制嗜热脂肪芽孢杆菌卡利德变种（Bacillus stearothermophilus var.calidolactis）的抗生素的检验，也可用于复原乳、消毒灭菌乳、乳粉中抗生素的检测； ——改变了试剂盒加营养片方法。直接将含有试验菌株芽孢的培养基制备在小试管内； ——将“[Note: Occasionally kits of a particular Lot No. may require a longer incubation time for color to fully develop. If ……Check color development at 10 min intervals and record optimum incubation time required for each Lot No.]”程序更改为“如果颜色没有变化，须再于水浴中培养30 min作最终观察”； ——删除青霉素酶确证程序。

3 与GB/T 4789.27－2003相比主要修改 ——标准名称变更为鲜乳中抗生素残留检验；
——将原标准的嗜热乳酸链球菌方法确定为第一法，并且对标准文本的文字及格式进行了修改； ——修改采用了美国分析化学家协会（AOAC）液体牛奶制品中的β－乳胺抗生素定性的颜色反应 试验（AOAC Official Method : Beta－Lactam Antibiotics in Fluid Milk Products－Qualitative Color Reaction Tests）作为第二法； ——增加了附录A培养基和试剂。

4 第一法 嗜热链球菌抑制法 检验程序 检样 9 mL 80 ℃±2 ℃，加热 5 min 冷却至 37 ℃以下
第一法 嗜热链球菌抑制法 80 ℃±2 ℃，加热 5 min 检验程序 冷却至 37 ℃以下 加菌液，36 ℃±1 ℃水浴 2 h 加 TTC 指示剂，3 6 ℃±1 ℃水浴 30 min 不显色 36 ℃±1 ℃水浴 30 min 微红色 不显色 红色 抗生素阴性 结果可疑，重 新检测 抗生素阳性 结果报告

5 操作步骤 原理：检样经过 80 ℃杀菌后，添加嗜热链球菌菌液。培养一段时间后，嗜热链球菌开始增殖。这时候加入代谢底物 TTC，若该样品中不含有抗生素或抗生素的浓度低于检测限，嗜热链球菌将继续增殖，还原 TTC 成为红色物质。相反，如果样品中含有高于检测限的抑菌剂，则嗜热链球菌受到抑制，因此指示剂 TTC 不还原，保持原色。

6 检验程序 活化菌种：取一接种环嗜热链球菌菌种，接种在 9 mL 灭菌脱脂乳中，36 ℃±1 ℃培养 12 h～15 h 后，置 2 ℃～5 ℃冰箱保存备用。每15 d 转种一次。 测试菌液：将经过活化的嗜热链球菌菌种接种灭菌脱脂乳，36 ℃±1 ℃培养 15 h±1 h，加入相 同体积的灭菌脱脂乳混匀稀释成为测试菌液。

7 培养操作：取检样 9 mL，置 18 mm×180 mm 试管内，每份检样另外做一份平行样。同时再作阴性和阳性对照各一份，阳性对照管用 9 mL 青霉素 G 参照溶液，阴性对照管用灭菌脱脂乳 9 mL。所有装有样品的试管置 80 ℃水浴加热 5 min，冷却至 37 ℃以下，加入测试菌液1 mL，轻轻旋转试管混匀。36 ℃±1 ℃水浴培养 2 h，加 4％TTC 水溶液 0.3 mL，在旋涡混匀器上混合 15 s 或振动试管保证液体与样品混匀。36 ℃±1 ℃水浴避光培养 30 min，观察颜色变化。如果颜色没有变化，于水浴中继续避光培养 30 min 作最终观察。观察时要迅速，避免光照过久出现干扰。 判断方法：在白色背景前观察，检样呈乳的原色时，指示乳中有抗生素存在，为阳性结果。检样呈红色为阴性结果。如最终观察现象仍为可疑，建议重新检测。

8 报告 最终观察时，检样变为红色，报告为抗生素残留阴性。检样依然呈乳的原色，报告为抗生素残留阳性。
本方法检测几种常见抗生素的最低检出限为：青霉素0.004 IU，链霉素 0.5 IU，庆大霉素 0.4 IU，卡那霉素 5 IU。

9 第二法 嗜热脂肪芽孢杆菌抑制法 检验程序 菌种活化 制备芽孢悬液 芽孢悬液加入溴甲酚紫葡萄糖蛋白胨培养基 加入样品 100 μL
第二法 嗜热脂肪芽孢杆菌抑制法 制备芽孢悬液 芽孢悬液加入溴甲酚紫葡萄糖蛋白胨培养基 检验程序 加入样品 100 μL 65 ℃±2 ℃水浴 2.5 h 紫色 65 ℃±2 ℃水浴 30 min 其它颜色 紫色 黄色/黄绿色 抗生素阳性 抗生素阴性 结果可疑， 重新测试 结果报告

10 原理：培养基预先混合嗜热脂肪芽孢杆菌芽孢，并含有 pH 指示剂（溴甲酚紫）。加入样品并温浴后，若该样品中不含有抗生素或抗生素的浓度低于检测限，细菌芽孢将在培养基中生长并利用糖产酸，pH 指示剂的紫色变为黄色。相反，如果样品中含有高于检测限的抗生素，则细菌芽孢不会生长，pH 指示剂的颜色保持不变，仍为紫色。

11 检验程序 芽孢悬液：将嗜热脂肪芽孢杆菌菌种划线移种于营养琼脂平板表面，56 ℃培养 24 h 后挑取乳白色半透明圆形特征菌落，在营养琼脂平板上再次划线培养，56 ℃培养24 h 后转入 36 ℃培养 3 d～4 d，镜检芽孢产率达到 95%以上时进行芽孢悬液的制备。每 块平板用 1 mL～3 mL无菌磷酸盐缓冲液洗脱培养基表面的菌苔（如果使用克氏瓶，每瓶使用无菌磷酸盐缓冲液 10 mL～20 mL）。将洗脱液 r/min离心 15 min。取沉淀物加无菌0.03 mol/L 磷酸盐缓冲液（pH 7.2）制成 10 ９ cfu/mL 芽孢悬液，置 80 ℃恒温水浴中 10 min 后，密封防止水分蒸发，置冰箱保存备用。

12 测试培养基：在溴甲酚紫葡萄糖蛋白胨培养基中加入适量芽孢悬液，混合均匀，使最终的芽孢浓度为 8×10 ５ ～2×10 ６ cfu/mL。混合芽孢悬液的溴甲酚紫葡萄糖蛋白胨培养基分装小试管，每管 200 μL，密封防止水分蒸发。这样配制好的测试培养基可以在冰箱保存 6 个月。 培养操作：吸 取样品100 μL加入含有芽孢的测试培养基中，轻 轻旋转试管混匀。每 份检样作二份，另外再作阴性和阳性对照各一份，阳性对照管为 100 μL 青霉素 G 参照溶液，阴性对照管为 100 μL 无抗生素的脱脂乳。于 65℃水浴培养 2.5 h，观察培养基颜色的变化。如果颜色没有变化，须再于水浴中培养 30 min 作最终观察。

13 判断方法：在白色背景前从侧面和底部观察小试管内培养基颜色。保持培养基原有的紫色为阳性结果，培养基变成黄色或黄绿色为阴性结果，颜色处于二者之间，为可疑结果。对于可疑结果应继续培养30 min 再进行最终观察。如果培养基颜色仍然处于黄色－紫色之间，表示抗生素浓度接近方法的最低检出限，此时建议重新检测一次。

14 报告: 最终观察时，培养基依然保持原有的紫色，可以报告为抗生素残留阳性。 培养基变为呈黄色或黄绿色时，可以报告为抗生素残留阴性。 本方法检测几种常见抗生素的最低检出限为：青霉素3 μg/L，链霉素 50 μg/L，庆大霉素 30 μg/L，卡那霉素 50 μg/L。