微生物在药学中的应用.

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1 微生物在药学中的应用

2 微生物与制药 抗生素 氨基酸 维生素—以辅酶或辅基形式参与生物体各种生化代谢反应，用于防治维生素缺乏引起的各种疾病。
1 食品—添加剂，调味剂L-天冬氨酰苯丙氨酸甲酸（甜味二肽）。 2 饲料—添加Lys、Met可提高饲料营养价值，鸡多产蛋，猪生长快。 维生素—以辅酶或辅基形式参与生物体各种生化代谢反应，用于防治维生素缺乏引起的各种疾病。 甾体化合物—抗炎，抗毒，抗过敏，抗休克等。治疗过敏性皮炎，类风湿关节炎，计划生育药物。 酶与酶抑制剂 α-淀粉酶 ，糖化酶，葡萄糖异构酶等； 青霉素酰化酶，门冬酰氨酶（治白血病）； 链激酶/尿激酶（去血栓）。 菌体制剂与活菌制剂 1 药用酵母—酵母（酿酒酵母） → 干燥 →  酵母粉 2 活菌制剂（合成vitamin，维持肠道内微生态平衡） （1）乳酸菌制剂（2）双歧杆菌

3 主要内容 第一节 抗生素的概念和分类 第二节 抗生素的分离和筛选 第三节 抗生素的制备(自学) 第四节 抗生素的生物合成机制(自学) 第五节 抗生素的作用机制 第六节 抗生素的抗药性 第七节 抗生素含量的测定 第十九章 药物抗菌实验 第二十章 药品的微生物学质量控制

4 第一节 抗生素的概念和分类 抗生素(Antibiotic)：是由某些生物合成或半合成的一类次
第一节 抗生素的概念和分类 抗生素(Antibiotic)：是由某些生物合成或半合成的一类次 级代谢产物或衍生物，它们在低浓度时选择性抑制或影响 它种生物的生命活动，如杀死微生物或抑制其生长。 1929年，Fleming首先从青霉菌中发现青霉素； 1940年，Florey和Chain采用溶媒萃取法获得青霉素。 1944年，Waksman在链霉菌中发现链霉素； 自本世纪40年代以来，已找到上万种新抗生素，合成了近10 万种半合成抗生素，但其中在临床上常用的仅100余种，连 同其衍生物约300余种。

5 Antibiotic action of soil microorganisms on a crowded plate
Antibiotic action of soil microorganisms on a crowded plate. The smaller colonies surrounded by inhibition zones are streptomycetes.

6 抗生素的分类 （1）按化学结构 ß-内酰胺类—青霉素、头孢菌素等。 四环类—四环素、土霉素、金霉素。
氨基糖苷类—链霉素、卡那霉素、庆大霉素。 大环内酯类—红霉素、螺旋霉素、麦迪霉素。 多肽类—多黏菌素、杆菌肽等。 多烯类—制霉菌素、两性霉素B、万古霉素 苯羟基胺类—氯霉素 蒽环类—柔红霉素、阿霉素 环桥类—利福霉素

7 （2）按作用对象 抗G+—Pen等 抗G-—链霉素等 广谱—四环素、红霉素、卡那霉素、头孢菌素等。
抗真菌—两性霉素B、制霉菌素、灰黄霉素等。 抗肿瘤—阿霉素、丝裂霉素、柔红霉素等。

8 由于不同微生物之间的细胞化学结构和代谢的差异，不同的
Go！ 由于不同微生物之间的细胞化学结构和代谢的差异，不同的 抗生素的抗菌谱各异。

9 第二节 抗生素的分离和筛选 以从土壤中分离放线菌为例 从土壤中分离放线菌（初筛） 采土：较干燥、偏碱性、有机质丰富的土壤
Go！ 第二节 抗生素的分离和筛选 以从土壤中分离放线菌为例 从土壤中分离放线菌（初筛） 采土：较干燥、偏碱性、有机质丰富的土壤 （取5-10厘米深处）。 分离放线菌：土壤样品用无菌水稀释，获得 菌悬液，梯度稀释，选取不同稀释度接种适 宜培养基，获得单菌落纯培养。 筛选：斜面 → 摇瓶 →琼脂扩散法、滤纸片抗菌试验（G-，G+）。

10 抗生素传统分离方法 涂布于平板培养基28 ℃培养1周 挑取单菌落 土壤标本 培养观察抑菌圈 纯化 精制 临床研究 无菌水稀释 扩培 滤纸片
法筛选 培养观察抑菌圈 纯化 精制 临床研究

11 抗生素生产的工艺过程 菌种 孢子制备 种子制备 发酵 发酵液预处理 提取及精制 成品检验 成品包装

12 1、 菌种－ 保藏的品种经复壮后备用 2 、孢子制备－ 固体培养基培养孢子 3 、种子制备－获得菌丝供发酵之用。 4 、发酵

13 （1）接种量10% 左右，周期4-5天； （2）培养基—糖类，淀粉，花生饼粉，黄豆饼粉，玉米浆，蛋白胨； （3）补料工艺—延长抗生素分泌期，增加产量； （4）前体—如Pen发酵的前体为苯乙酸或苯乙胺等； （5）pH（6）温度：夹套或蛇管冷却水散热（渗漏时易导致染菌，喷淋冷却也一样） （7）通气搅 拌机械搅拌 ；挡板防涡流 （8）消泡沫 玉米油、豆油、泡敌—聚氧乙烯氧丙烯甘油 % （9）消毒灭菌，防止杂菌污染 菌种、空气、培养基、管道设备、防噬菌体。 （10）放罐时间 菌丝浓度、形态、残糖、氨基氮、pO2 、pH、效价。

14 5 、发酵液的预处理 4 、发酵 （1）发酵液中含Ca 2+ 、 Mg 2+ 、 Fe 3+ 、Protein等杂质；
（5）ZnSO4与黄血盐形成复盐吸附蛋白质 （6）过滤

15 5 、发酵液的预处理 6 、抗生素提取和精制 7 、成品检定和包装 （3）吸附法（活性炭、大孔吸附脂）—头孢菌素 （1）溶媒萃取法—Pen
（2）离子交换法—氨基糖苷类抗生素 （3）吸附法（活性炭、大孔吸附脂）—头孢菌素 （4）沉淀法——四环素 7 、成品检定和包装

16 第五节 抗生素的作用机制 抑制细菌细胞壁合成、 破坏细胞质膜、 作用于呼吸链以干扰氧化磷酸化、 抑制蛋白质和核酸合成等
第五节 抗生素的作用机制 抑制细菌细胞壁合成、 破坏细胞质膜、 作用于呼吸链以干扰氧化磷酸化、 抑制蛋白质和核酸合成等 抑制微生物的生长或杀死它们

17 主要抗生素的作用模型

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19 Go！ 青霉素β-内酰胺环结构与D-丙氨酸末端结构相似，从而能占据D-丙氨酸的位置与转肽酶结合，并将酶灭活，肽链之间无法彼此连接，抑制了细胞壁的合成。

20 第六节抗药性 （drug resistance）p316

21 抗药性—在微生物或肿瘤细胞多次与药物接触发生敏感性降低的现象，是微生物对药物所具有的相对抗性。
获得抗药性:对原来敏感的抗生素通过遗传性的改变而获得了抗药性 多重抗药性：同时对两种以上作用机制不同的药物产生的抗药性 交叉抗药性：对结构类似或作用机制类似的抗生素均有抗药性 赖药性：不仅对该药物具有抗性，而且需要该药物作为特殊的营养因素 耐受性：该菌在最低抑菌浓度时仍受到抑制，但最低杀菌浓度提高

22 抗菌药物的发展史也就是细菌对其耐药性的发展史
（1）抗菌药物只要使用了足够时间，就会出现细菌耐药性，如使用青霉素25年后出现耐青霉素肺炎球菌、氟喹诺酮使用10年后出现了肠杆菌耐药； （2）耐药性是不断进化的，随着抗菌药物的应用，耐药也从低度耐药向中度、高度耐药转化； （3）对一种抗菌药物耐药的微生物可能对其他抗菌药物也耐药； （4）细菌耐药性的消亡很慢； （5）使用抗菌药物治疗后，患者容易携带耐药菌。

23 （2）药物选择的结果是杀死敏感菌，耐药菌富集。 2 、 细胞间抗药性的基因转移
一、抗药性产生的遗传机制 1 、自发突变与药物选择 （1）由敏感菌的遗传物质自发突变产生。 （2）药物选择的结果是杀死敏感菌，耐药菌富集。 2 、 细胞间抗药性的基因转移 染色体上的耐药基因—通过接合、转化、转导和转座子而转移。 质粒上的耐药基因—自行复制，代代相传，并在不同种属间转移（性菌毛的接合作用）

24 二、抗药性产生的生化机制 1、 细胞质膜透性改变 2、 药物作用靶标改变 3、 合成了修饰抗生素的酶

25 耐药性的控制 避免耐药菌传播（医院） 合理用药 （1）抗生素可不用尽量不用，使用时应足量。 （2）合理联合用药
抗耐药菌新抗的寻找，如酶抑制剂抗生素等。 耐药机制的研究—耐药规律寻找，有助于合理用药。

26 第七节 抗生素的含量测定 一、抗生素的效价单位 效价（potency）——在同一条件下比较抗生素检品和标准品的抗菌活性，从而得出检品的效价。 单位（unit,u）是衡量抗生素有效成分的具体尺度。

27 抗生素效价 检品的抗菌活性 效价 = 100% 标准品的抗菌活性 检品的实际单位数 100% = 检品的标示量

28 重量单位   以抗生素活性部分的重量为单位，1mg=1000 U 类似重量单位 以抗生素盐类纯品重量，1mg=1000 U，包括非活性部分的重量 重量折算单位 （原始活性单位相当的纯品重量为1U ）   青霉G钠盐：1mg=1667u（以50ml肉汤中抑制金葡菌生长的最小青霉素量为1 U，相当于青霉G钠盐0.5899g） 特定单位 Ex: 一批特定杆菌肽1mg ≌ 55U 标准品—与商品同质的、纯度较高的抗生素，每毫克含有一定量的单位，中国药品生物制品检定所分发 标准量—抗生素制剂标签上的标量（单位或重量）　

29 抗生素的效价测定 我国2010版药典规定：抗生素效价的测定采用微生物学的 方法。最常用的是琼脂扩散法中的管碟法。 （一）管碟法的设计原理 抗生素在一定的浓度范围内，其浓度的对数和抑菌圈的直 径成正比。Y=a+bX Y：抑菌圈直径，X：抗生素浓度的对数 在含有高度敏感性实验菌的琼脂平板上放置小钢管（牛津 杯），管内放入标准品和检品的溶液，经过培养，当抗生素 扩散至有效范围内就产生透明的无菌生长范围，常呈圆形， 为抑菌圈。不同浓度的抗生素其抑菌圈的直径大小不同，比 较标准品与检品的抑菌圈的大小就可计算出抗生素的效价。

30 二剂量法 实验菌 培养基（双层平板） 抗生素浓度范围（2：1或4：1） 培养条件（温度，时间） 举例 药物—硫酸奈替米星，572 U /mg
高剂量：低剂量 = 2：1（20 U /ml-10 U /ml） 实验菌—短小芽孢杆菌CMCC（B）63202

31 W=(SH+UH)-(SL+UL) V=(UH+UL)-(SH+SL) 供试品与标准品效价比θ=D*antilg(IV/W)
D一般为1，I一般为lg2

32 第十九章—药物的抗菌实验 （抗生素的药效学）
1、抗生素的体外抗菌实验 MIC——最低抑菌浓度 MBC——最低杀菌浓度 KCS——杀菌曲线　

33 常用的方法 1 连续稀释法（serial dilution test） 液体稀释法（试管法） 琼脂平板倍比稀释法
2 琼脂扩散法（agar difussion test） （1）实验药物 （2）阳性对照药物 （3）阴性对照 滤纸片法 打洞法（挖孔法） 管碟法 挖沟法

34 1 1 液体稀释法图解

35 第七节 药物制剂的微生物检查 一、微生物与药物变质 空气 含细菌、霉菌、酵母等。 除菌—过滤、化学消毒、UV照射。
水—大肠杆菌通常作为水是否被粪便污染的检验指标 人体 皮肤 与外界相通的腔道 正常菌群/条件致病菌（E.coli，绿脓，沙雷氏菌） 原材料 动物脏器 中药材—晾晒、烘烤 包装物 制药设备、厂房建筑、死角管道 人流、物流　

36 二、无菌制剂的无菌检查 无菌检查的基本原则 三种培养基（需氧培养基、厌氧培养基和真菌 培养基），按药典的规定程序进行。
1、一般药品的无菌检查—直接接种法 需氧菌、厌氧菌、霉菌的检查 需氧菌：30-35℃，7天 厌氧菌：30-35 ℃ ，7天 霉 菌：20-25℃，7天 观察培养液是否混浊或涂片染色镜检 阳性对照—（24 h有菌生长） 金葡CMCC（B）26003 生孢梭菌CMCC（B）64941 白色念珠菌CMCC（F）98001

37 2、口服药及外用药的无菌检查法 一、细菌总数的测定 二、霉菌和酵母菌总数的测定 三、控制菌的检查 口服药—不能检出大肠杆菌
脏器来源口服制剂—不能检出沙门氏菌、大肠杆菌。 外用药、眼科制剂—不能检出金葡菌、绿脓杆菌。 控制菌指的是大肠埃希氏菌、铜绿假单胞菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌及破伤风梭菌。 四、活螨的检查

38 Plate Count in theory, each isolated cell forms a single colony
colony counts are taken on plates with 30 to 300 colonies

39 Another Viable Count Method - Membrane filtration

40 Colonies on Membrane Filters

41 * 举 例－大肠杆菌的检查 E.coli增菌液—胆盐乳糖培养基 分解乳糖，紫黑色金属光泽菌落 形态结构—G- ，短杆菌 菌落特征
* 举 例－大肠杆菌的检查 E.coli增菌液—胆盐乳糖培养基 分解乳糖，紫黑色金属光泽菌落 形态结构—G- ，短杆菌 菌落特征 IMVIC：

42 Go！ 药品的微生物限度标准