利用细菌控制大豆 根病技术研究 段玉玺 沈阳农业大学植物线虫学研究室 2007年9月5日

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1 利用细菌控制大豆 根病技术研究 段玉玺 沈阳农业大学植物线虫学研究室 2007年9月5日
我是植物病理学专业的王媛媛，导师段玉玺教授，研究方向生物防治。我的博士论文题目是多功能生防根瘤菌工程菌株的构建,下面我将我的工作向专家做以汇报。 沈阳农业大学植物线虫学研究室 2007年9月5日

2 Soybean Cyst Nematode (SCN)
首先是前言。自1899年发现大豆胞囊线虫以来，该病害在世界各大豆产区传播和危害，一般使大豆减产10%～30%，严重地块可达70%～90%，甚至造成绝产，比任何一种单一病害所造成的危害都大。 大豆胞囊线虫 Soybean Cyst Nematode (SCN)

3 大豆胞囊线虫田间为害状 根部为害状 胞　　囊 根部为害状

4 大豆胞囊线虫二（A，B）、三（C，D）、四（E）龄幼虫
侵入侧根的二龄幼虫 侵入大豆根部中柱鞘内 的二龄幼虫 大豆胞囊线虫二（A，B）、三（C，D）、四（E）龄幼虫 大豆胞囊线虫成熟后突破根组织 大豆胞囊线虫 卵囊内的卵及二龄幼虫

5 大豆根腐病 （Soybean Root Rot）
与大豆胞囊线虫病同称为大豆根部首要病害的是大豆根腐病。大豆根腐病也是一种世界性病害。由于造成大豆根腐病的病原菌种类是以镰刀菌为主的多种病原菌，这种特点的存在使得这种病害的防治显得尤为困难。 大豆根腐病 （Soybean Root Rot）

6 大豆根病生防细菌的筛选 细菌悬液 细菌的109cfu/ml悬液 细菌发酵滤液 温室试验 根病生防细菌 不同靶标

7 对照（活J2） 处理（死亡J2）

8

9 菌株R0118（A.菌落形态; B.葡萄糖发酵; C.亚甲蓝染色; D.革兰氏染色; E.鞭毛染色; F.芽孢染色）

10 菌株R0140 （A.菌落形态; B.葡萄糖发酵; C.亚甲蓝染色; D.革兰氏染色; E.鞭毛染色; F.芽孢染色）

11 菌株R0173 （A.菌落形态; B.亚甲蓝染色; C.革兰氏染色; D.鞭毛染色; E.芽孢染色）

12 菌株R0223（A.菌落形态; B.葡萄糖发酵; C.亚甲蓝染色; D.革兰氏染色; E.鞭毛染色; F.芽孢染色）

13 菌株R0277 （A.菌落形态; B.亚甲蓝染色; C.革兰氏染色; D.鞭毛染色; E.芽孢染色）

14 菌株R0463 （A.菌落形态; B.葡萄糖发酵; C.亚甲蓝染色; D.革兰氏染色; E.鞭毛染色; F.芽孢染色）

15 菌株R0471 （A.菌落形态; B.亚甲蓝染色; C.革兰氏染色; D.鞭毛染色; E.芽孢染色）

16 菌株R0495 （A.菌落形态; B.葡萄糖发酵; C.亚甲蓝染色; D.革兰氏染色; E.鞭毛染色; F.芽孢染色）

17 菌株R0671（A.菌落形态; B.亚甲蓝染色; C.革兰氏染色; D.鞭毛染色; E.芽孢染色）

18 菌株R0675 （A.菌落形态; B.葡萄糖发酵; C.亚甲蓝染色; D.革兰氏染色; E.鞭毛染色; F.芽孢染色）

19 表2-４ 不同菌株发酵液对大豆胞囊线虫J2的影响
Table2-4 The effect of fermentation of different stains to J2 of SCN 处理菌株 Strains 死亡的线虫数（条） The dead number of J2 校正死亡率 Corrected mortality （%） I II III 平均 r030048 r030060 r030066 r030121 r030260 r030348 r030361 r030398 对照CK 无菌水CK 7 4 9 8 5 6 3 1 10 2 7.33Aa 5.00Bb 8.33Aa 6.67Ab 7.67Aa 3.00Bb 3.33Bb 1.33Bb 60.00% 25.04% 75.00% 50.00% 65.07% -0.05% －

20 菌株发酵液对大豆胞囊线虫J2的毒性作用

21 对大豆胞囊线虫的作用 a ab b 10株已鉴定细菌的发酵滤液对大豆胞囊线虫J2的作用

22 2.6%-48.6% 2.6%-23.8% 44株细菌的发酵滤液对大豆胞囊线虫J2的作用

23 微生物工作者 植保工作者 传统研究 根瘤菌 创新研究 各种生防因子 生防活性 固氮结瘤能力 内生工程菌株 固氮 防病 提高防效
微生物工作者 植保工作者 根瘤菌 固氮结瘤能力 各种生防因子 方 手 法 段 创新研究 固氮 防病 提高防效 内生工程菌株 本研究选定了根瘤菌作为研究对象，因为根瘤菌在大豆根围、根内也就是病原物的生境中大量存在。对于根瘤菌，微生物工作者和植保工作者均进行过相应的研究，但是二者的着眼点不同：微生物工作者注重结瘤固氮、促进植物生长发育能力，而植保工作者则倾向于根瘤菌对植物病害的控制能力，但是在长期的研究中发现，根瘤菌所表现的生防活性相对比较微弱。我们在这个基础上提出了创新性的研究方向，就是将根瘤菌与各种高活性的生防因子通过一定方法手段整合为一体，构建成一株内生工程菌株，使之在固氮的同时能够高效控制病害的发生。这样就将病害的防治与大豆的栽培和营养有效结合，为大豆根病的防治提出新思路和新方法。本课题受到农业部和科技部成果转化基金资助.

24 1.筛选对大豆根腐病原真菌的有拮抗活性目的生防细菌
15株根瘤菌：L396 786株 79株 64株产芽孢细菌：64、Snb2、417、454、 476、611、620 从根瘤中共分离到786株细菌。通过对峙培养法检测到79株对根腐病菌有活性的菌株。有64株是产芽孢细菌，15株根瘤菌。

25 Snb2对4种大豆根腐病菌的拮抗作用 尖孢镰刀菌 茄腐镰刀菌 立枯丝核菌 腐霉菌 其中菌株Snb2在产芽孢细菌中对病菌的抑制较明显；

26 L396对大豆根腐病菌的拮抗作用 茄腐镰刀菌 腐霉菌 菌株L396在获得的根瘤菌中作用较突出，但仅表现为对茄腐镰刀菌和腐霉菌有轻微的拮抗作用

27 2.活性菌株菌悬液对二龄幼虫的致死率测定 Snb2 17.5 66.7 L396 7.3 21.6 菌株 48h校正 死亡率(%)
4.23 14.5 S274 8.3 38.7 Snb2 17.5 66.7 S233 12.6 46.4 L179 5.7 20.51 S165 9.78 39.65 L258 6.73 25. 8 S287 8.9 35.21 S345 15.2 50.00 S478 16.63 63.76 L417 5.6 23.46 S066 14.7 49.38 S121 11.75 44.77 L396 7.3 21.6 L040 3.84 12.58 S620 13.5 47.14 S454 39.6 L352 5.39 17.1 通过菌悬液处理大豆胞囊线虫的二龄幼虫，发现菌株Snb2、L396对线虫的致死作用在获得的细菌中作用效果比较明显，96小时对线虫校正死亡率分别达到66.7和21.6。根据对真菌和线虫的初筛作用，确定Snb2和L396为研究对象。

28 3.目的细菌菌株抑菌谱的测定 薯芋黑斑病菌 番茄灰霉病菌 黄瓜菌核病菌 黄瓜枯萎病菌 水稻纹枯病菌 水稻恶苗病菌 水稻赤霉病菌 葡萄白腐病菌
(注：上：对照；左：Snb2；右：L396；) 薯芋黑斑病菌 番茄灰霉病菌 黄瓜菌核病菌 黄瓜枯萎病菌 水稻纹枯病菌 水稻恶苗病菌 水稻赤霉病菌 葡萄白腐病菌 玉米大斑病菌 玉米小斑病菌 烟草赤星病菌 小麦根腐病菌 通过抑菌试验发现：筛选的两株目的菌株对供试的12种病原真菌均有不同程度的抑制作用。

29 4.目的生防细菌发酵液对大豆胞囊线虫J2的致死作用测定
处理菌株 12h校正死亡率(%) 24h校正死亡率(%) 48h校正死亡率(%) 72h校正死亡率(%) L396 17.39 21.74 30.43 39.13 Snb2 35.71 47.62 57.14 69.05 测定了菌株摇瓶发酵后对二龄幼虫的致死作用，随着处理时间的延长，对线虫的毒害作用越大，在72小时L396和Snb2对线虫的校正死亡率分别达到39.13和69.05。

30 5.温室盆栽防效 对照根部平均胞囊量为36个,最多达57个； Snb2处理的大豆根部平均胞囊量为13.5个，防治效果达到62. 5%；
菌株L396处理的大豆根部平均胞囊量为26.5个； 温室盆栽试验结果也比较明显，Snb2处理的大豆根部平均胞囊量为13.5个，防治效果达到62.5%；

31 生防细菌 L396 和 Snb2的形态观察 ＋ 抗酸染色 － 荚膜 微纤毛 周生多鞭毛 鞭毛 革兰氏染色 无芽孢
有芽孢，椭圆形，间生，偶有端生，胞囊不膨大 芽孢染色 3.46±1.24(1.75~5.35)×1.56±0.38(1.1~1.95) 1.32±0.68(1.25~2.5)×0.65±0.25(0.5~0.9) 菌体大小（μm） 杆状，较粗，内有聚-β-羟基丁酸盐颗粒 短杆状 菌体形态 菌落较小，呈圆形，边缘光滑，乳白色，凸起，有光泽，有粘液，直径2-4mm，不产色素 菌落大，圆形至不规则形，边缘褶皱，表面干燥，中间凹陷，灰白色，不产色素 菌落形态 L396 Snb2 鉴定项目 这张表格反应了生防细菌 L396 和 Snb2的形态观察结果 注：“－”代表阴性；“＋”代表阳性；

32 目的菌生理生化性状鉴定 － 丙酸盐利用 ＋ 柠檬酸盐利用 厌氧性测定 氧化酶 接触酶 葡萄糖氧化发酵 脲 酶 硝酸盐还原 淀粉水解 还原
产酸 牛奶胨化 甲基红 明胶水解 运动性 3-酮基乳糖测定 V-P测定 苯丙氨酸解氨酶 L396 Snb2 特 征 注：“－”代表阴性；“＋”代表阳性； 生理生化性状鉴定如此表。

33 L396的鉴定 A B C F E D G H I K J A．亚甲蓝染色 B．革兰氏染色 C．鞭毛染色 D．芽孢染色 E．淀粉水解
K．V-P测定 L. 荚膜染色 这是形态学和生理生化性状鉴定的图片。 L

34 Snb2的鉴定 A B C F E D G H I L K J A．亚甲蓝染色 B．革兰氏染色 C．鞭毛染色 D．芽孢染色 E．淀粉水解
K．V-P测定 L. 荚膜染色

35 Snb2: 芽孢杆菌属（Bacillus sp. ）； L396: 中华根瘤菌属（Sinorhizobium sp.）.
初步鉴定结果： Snb2: 芽孢杆菌属（Bacillus sp. ）； L396: 中华根瘤菌属（Sinorhizobium sp.）. 参考鉴定手册，可初步鉴定Snb2为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）； L396为中华根瘤菌属（Sinorhizobium sp.）。

36 16SrDNA的PCR扩增产物 Snb2 16S rDNA全序列共有1488bp ；L396 16S rDNA全序列共有1438bp；
2000 2500 M Snb2 L396 1500 500 300 1000 Snb2 16S rDNA全序列共有1488bp ；L396 16S rDNA全序列共有1438bp； 递交生物公司测序结果为：Snb2 16S rDNA全序列共有1488bp ； L396 16S rDNA全序列共有1438bp。

37 菌株Snb2 16S rDNA序列比对的部分结果 菌株strains 序列登录号 同源性(%) 菌株所属
Bacillus subtilis strain B432 DQ 1449/1451 (99.86%) 枯草芽孢杆菌 Bacillus subtilis Strain B-FS01 DQ Bacillus subtilis Strain MO4 AY 1449/1451 (99.86%) Bacillus subtilis Strain CICC10048 AY 1452/1455 (99.79%) Bacillus subtilis Strain YJ001 DQ 1448/1451 (99.79%) Bacillus subtilis Strain BFAS AY Bacillus subtilis Strain AU53 EF 1447/1451 (99.72%) Bacillus subtilis Strain Tg AB Bacillus subtilis Strain B-1 AB 1448/1451 (99.72%) Bacillus sp Strain SS9 AB 芽孢杆菌 Bacillus subtilis Strain BOH2 AY Bacillus subtilis Strain CICC10025 AY 1450/1455 (99.66%) Bacillus subtilis Strain MA139 DQ Bacillus subtilis Strain MO5 AY 登陆数据库比对16S rDNA的结果发现Snb2与114株枯草芽孢杆菌的相似性高达99％以上，

38 菌株L396 16S rDNA序列比对的部分结果 菌株 序列登录号 同源性(%) 菌株所属
Sinorhizobium fredii strain LMG 8317 X 1417/1421 (99.71%) 费氏中华根瘤菌 Sinorhizobium fredii strain LMG 6216 AM Sinorhizobium fredii strain LMG 6218 AM Sinorhizobium fredii strain USDA205 AY Sinorhizobium fredii strain HH103 AY Sinorhizobium fredii strain HH003 AY Sinorhizobium fredii strain LMG 6217 X Sinorhizobium sp. 15C-4 AF 中华根瘤菌 Sinorhizobium fredii AB 1415/1419 (99.57%) Sinorhizobium fredii strain USDA257 AY 1416/1421 (99.65%) Sinorhizobium fredii strain SjzZ4 DQ 1415/1421 (99.57%) strain: ATCC 35423 D 1412/1421 (99.36%) Sinorhizobium fredii strain SjzE4 DQ 而菌株L396的16S rDNA序列与41株费氏中华根瘤菌的相似性高达99％以上。

39 菌株Snb2 为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）；
菌株L396为费氏中华根瘤菌（Sinorhizobium fredii）。 在杨苏声主编的《细菌分类学》一书中指出，16S rDNA序列差异≤1％－1.5％的细菌菌株属于同一个种 。结合形态学鉴定和分子鉴定，我们得出结论菌株Snb2 为枯草芽孢杆菌； 菌株L396为费氏中华根瘤菌。

40 两出发菌株对八种抗生素的敏感性测定 A.L396 B.Snb2
标记抗生素的筛选 链霉素 青霉素 氨卞青霉素 新霉素 庆大霉素 红霉素 卡那霉素 氯霉素 两出发菌株对八种抗生素的敏感性测定 A.L396 B.Snb2 B A 用平板管碟法测定了出发菌株对八种抗生素的敏感性，发现两出发菌株对多种抗生素具有差异的敏感性，如链霉素，青霉素，氨卞青霉素、卡那霉素等。为了避免将来出现标记抗生素对出发菌株突变的影响，对所选则的八种抗生素连续六代的测定，结果发现，出发菌株Snb2有突变现象，但对青霉素具有相互补的抗性和敏感性。所以以青霉素作为菌株Snb2被选抗生素标记，进行以下抗生素最适浓度的筛选。

41 L396原生质体热灭活 50 菌株L396原生质体热灭活温度、处理时间与致死率间的关系 120 100 60．2 60 94．5 58．7
38．1 55 94．1 69．4 30．6 20．2 50 致死率（％） 180 150 120 90 75 45 处理时间（min） 温度（℃） 菌株L396原生质体热灭活温度、处理时间与致死率间的关系 经过测定发现L396原生质体在50 ℃条件下处理120分钟就可达到100％失活。为了避免过高温度对原生质体的伤害，采用50℃灭活、处理时间为120min为标记。

42 L396：1.5mg/mL； Snb2：2.0mg/mL； 溶菌酶浓度对出发菌株原生质体形成的影响

43 结合对原生质体活性的影响，确定35℃作为该酶解反应的最佳温度
酶解温度对出发菌株原生质体形成的影响

44 本研究结果表明处于对数生长中期时，对酶裂解液的敏感性、原生质体的产生量以及原生质体化的速度均高于其他时期。所以在今后的试验中以使用对数生长中期的菌体为主。
菌龄对出发菌株原生质体形成的影响

45 L396的形成率为57.17％； Snb2的形成率为43.53％； 在最佳的原生质体制备条件下，最终得出结论L396的形成率为57.17％；Snb2的形成率为43.53％ 。

46 原生质体的释放过程 菌株Snb2原生质体释放过程的观察 菌株L396原生质体释放过程的观察 这几张图片反应了出发菌株释放原生质体的过程。

47 出发菌株在不同种类再生培养基上的再生率 菌株 再生培养基一 再生培养基二 再生培养基三 HCNB 再生培养基四 YMA高渗培养基 L396
64.0％ 70.0％ 51.5％ 92.5％ 48.5％ 72.5％ Snb2 43.0％ 32.0％ 52.0％ 66.0％ 41.5％ 29.0％ 结果如下：在供试的六种高渗再生培养基中，两株菌在HCNB上的再生率较高，因此确定HCNB为最佳再生培养基。

48 出发菌株原生质体在HCNB上的再生菌落 菌株L396 菌株Snb2 这是两株菌的原生质体在再生培养基HCNB上再生后形成的菌落。

49 获得398个菌株，经过6次转代培养，最终有49个融合子能够保持稳定的生长；
经过多次试验，共获得398个菌株，经过6次转代培养，最终有49个融合子能够保持稳定的生长；

50 出发菌株与部分融合子的菌落形态差异 Snb2 L396 Rh3 Rh5 Rh25 Rh4 Snb2 Snb2
在获得49株融合子中，融合子在菌落形态和菌落扩展方式上各有不同，但大致可分为四种类型。与单一亲本菌株具有很相似的特征，有小部分融合子菌株在菌落形态和菌落扩展方式上与出发菌株有不同程度的差异 。 出发菌株与部分融合子的菌落形态差异

51 部分融合子菌体形态及菌体大小比较 菌株编号 菌体形态 菌体大小（µm） L396 长椭圆形
3.46±1.24（1.75～5.35）×1.56±0.38（1.1～1.95） RH2 短杆状 1.54±0.36（1.01～2.27）×0.77±0.18（0.50～1.14） RH3 1.59±0.27（0.82～2.07）×0.83±0.11（0.56～1.24） RH5 短椭圆形 3.12±0.75（1.79～5.23）×1.16±0.23（0.79～1.69） RH6 1.50±0.24（1.10～1.93）×0.42±0.05（0.30～0.51） RH10 1.42±0.31（1.06～1.97）×0.71±0.15（0.53～0.98） RH17 2.01±0.43（1.55～2.18）×0.98±0.32（0.56～1.75） RH13 1.38±0.23（1.05～1.74）×0.57±0.06（0.27～0.78） RH21 1.52±0.22（1.21～2.01）×0.57±0.38（0.45～0.75） RH26 2.94±0.74（2.28～5.59）×1.73±0.36（1.08～2.28） RH42 3.03±0.59（1.23～3.34）×1.11±0.56（0.57～1.55） Snb2 1.32±0.68（1.25～2.5）×0.65±0.25（0.50～0.90） 比较了融合子与亲本菌株的菌体形态和菌体大小，获得的融合子在菌体形态上多与芽孢杆菌Snb2有很大的相似性，有些则综合体现了出发菌株的形态，出现了短椭圆形；

52 部分融合子亚甲蓝染色和革兰氏染色 RH1 RH5 RH4 RH26 RH32
这是部分融合子的亚甲蓝染色和革兰氏染色，可以清楚的看出菌体的形状和菌体的大小。

53 部分融合子对茄腐镰刀菌的拮抗作用测定 RH2 RH3 RH5 RH26 RH34 RH43

54 部分融合子对尖孢镰刀菌的拮抗作用测定 RH2 RH3 RH5 RH26 RH34 RH43

55 融合子处理96h对线虫J2的毒杀效果 此表反应了获得的融合子处理大豆胞囊线虫96h后线虫的校正死亡率，结果表明只有RH19、RH21、RH22、RH46四株融合子处理线虫的校正死亡率大于出发菌株Snb2处理线虫的死亡率。也只有一株融合子RH23处理线虫的死亡率小于出发菌株L396。

56 融合子结瘤能力测定 RH3、RH5、RH20、RH23、RH26、 RH31、RH36、RH41、RH47。

57 对照孢子萌发 处理孢子萌发 这是处理的结果。无菌水处理的孢子正常萌发，且萌发的速度较快，芽管的粗细均匀，无任何形态上的异常；发酵液处理的孢子非但萌发的较慢，而且萌发产生的芽管出现形态上的畸形，进而无法发育成为正常菌丝。

58 RH5发酵滤液对茄腐镰刀菌孢子萌发的影响 Gf Fe Fd Ec Dc CDb BCb ABa Aa
不同浓度发酵液处理镰刀菌孢子，结果发现发酵原液处理的孢子萌发率仅为2.3％，当稀释到10倍时，分生孢子的萌发情况与无菌水对照处理相差无几。

59 C D A B F E 融合子RH5发酵液处理对茄腐镰刀菌菌丝体的影响
发酵滤液原液处理的菌丝体则发生了较大的不规则变化，主要表现在三个方面：一是菌丝体内部发生变化，菌丝体中的原生质体发生聚合，分裂成为折光率较高的小颗粒，并且原生质体颗粒聚集成团；其次菌丝体发生畸变，菌丝体明显分隔数增多，并且菌丝顶端细胞略有膨大 ，菌丝发育受阻，生长缓慢；最终菌丝出现溶解现象，菌丝细胞壁部分消解，细胞内容物外渗，整个菌丝最终降解、消失。 融合子RH5发酵液处理对茄腐镰刀菌菌丝体的影响 A. 对照菌丝 B. 菌丝体中原生质体凝聚 C,D. 菌丝体变形 EF. 菌丝体溶解

60 结果与分析 RH5不同浓度菌悬液的促生效果 CK 106 108 1010 1012
这个试验还反映了对大豆幼苗的促生情况，10d后明显可见大豆生长受到了促进作用，随着菌悬液浓度增大，促生效果也就越明显。

61 采用不同细菌菌株包衣处理大豆种子对大豆根系胞囊形成的影响
Treatment 辽宁 Liaoning 黑龙江 Heilongjiang 平均单株胞囊数 胞囊抑制率% CK 30.0 -- 27.5 Nemab127 5.0 83.3 17.4 36.7 Nemab176 6.6 78.0 13.0 52.7 Nemab184 56.7 13.8 49.8 Nemab246 7.0 76.7 6.0 78.2 Nemab293 1.2 96.0 3.0 89.1 Nemab306 8.4 72.0 2.9 89.5 Nemab307 2.0 93.3 11.1 59.6 Nemab309 4.0 86.7 3.9 85.8 Nemab311 1.5 98.3 11.8 57.1 Nemab320 5.2 81.1 Nemab323 0.8 97.3 4.5 83.6 Nemab342 3.6 88.0 9.3 66.2 Nemab400 6.2 79.3 97.1 Nemab402 16.0 41.8

62 结论： 1.可以利用细菌控制大豆胞囊线虫病和真菌引起的根腐病; 2.利用拮抗根瘤菌控制大豆胞囊线虫病和真菌引起的根腐病是一个更好的方法; 3.利用芽孢杆菌和拮抗根瘤菌原生质体融合技术可以提高根瘤菌的拮抗作用,同时融合子对大豆幼苗的生长促进作用明显。

63 致谢 王媛媛 博士 陈立杰 博士 朱晓峰 博士研究生 王 雪 博士研究生 李进荣 硕士 秦 博 硕士
致谢 王媛媛 博士 陈立杰 博士 朱晓峰 博士研究生 王 雪 博士研究生 李进荣 硕士 秦 博 硕士

64 谢 谢! 以上是我对我论文的陈述部分，在此次答辨的最后，我要衷心感谢我尊敬的导师：段玉玺教授，老师教我学习，教我做人，也将我领上了科学的道路，在此谢谢恩师。同时还要感谢在我九年求学生涯中所有培育、关心、支持、帮助我的老师、同学、亲人和朋友！！！！谢谢大家！

65 预祝大会圆满成功! 各位专家老师大家好，欢迎参加优秀论文答辩会。由于我个人的原因，使我从11号答辩人晋升为1号答辩人，在此感谢各位老师和同学对我的关照！！