分子杂交及生物芯片技术 申川军 广州中医药大学生物化学教研室.

Presentation on theme: "分子杂交及生物芯片技术 申川军 广州中医药大学生物化学教研室."— Presentation transcript:

1 分子杂交及生物芯片技术 申川军 广州中医药大学生物化学教研室

2 参考书 屈伸 刘志国

3 目 录 第一章 生物大分子制备和分析常用技术 第二章 蛋白质、核酸的提取与分离 第三章 PCR技术 第四章 分子杂交与印迹技术 第五章 分子克隆技术 第六章 外源基因转移技术 第七章 蛋白质表达技术 第八章 分子标技术 第九章 分子改造技术 第十章 测序及人工合成技术 第十一章 基因组学技术 第十二章 蛋白质组学技术 第十三章 生物芯片技术 第十四章 生物信息学技术

4 参考书 马文丽 郑文岭 彭翼飞  

5 目录 第一章 核酸的分子结构与分子杂交的基本原理 第二章 核酸分子杂交的类型 第一节 固相核酸分子杂交类型
第一章　核酸的分子结构与分子杂交的基本原理 第二章　核酸分子杂交的类型 　第一节　固相核酸分子杂交类型 　　一、菌落原位杂交（colonyinsituhybridization） 　　二、斑点杂交（dotblot） 　　三、southern印迹杂交（southernblot） 　　四、northern印迹杂交（northernblot） 　　五、组织原位杂交（tissueinsituhybridization） 第三章　核酸探针的种类、标记及检测 　第一节　核酸探针的种类 　　dna探针 cdna探针 rna探针 寡核苷酸探针 　第二节　核酸探针的标记和检测 　　放射性同位素　　非放射性核酸探针 第四章　核酸分子杂交实验因素的优化 　探针选择 标记方法 浓度 杂交率 杂交最适温度 　杂交的严格性 反应时间 杂交促进剂 第五章　斑点杂交

6 第六章　southern印迹杂交 　第一节　southern印迹杂交的基本原理 　　一、dna从凝胶到膜上的转移方法 　　二、southern杂交膜 　　三、核酸探针的标记 　第二节　southern印迹法的基本过程 　　一、dna样品的酶切和电泳 　　二、准备用于转移的凝胶 　　三、dna从琼脂糖凝胶转移到固相支持物 　　四、探针标记 　　五、杂交 　　六、洗膜 　　七、杂交结果的检测 　　八、杂交膜的重复使用 　　九、注意事项 　　十、杂交严谨性 第七章　northern印迹杂交 第八章　原位杂交 第九章　菌落原位杂交 第十章　dna芯片技术

7 分子杂交：异源互补的核苷酸序列通过Walson-Crick碱基配对形成稳定的杂合双链分子的过程称为分子杂交。
基本概念 变性/复性： 分子杂交：异源互补的核苷酸序列通过Walson-Crick碱基配对形成稳定的杂合双链分子的过程称为分子杂交。 分子杂交技术：凝胶电泳分离待测DNA、RNA、Pr并转移固定到支持物或结合物上，然后与探针/抗体杂交分析。 探针(Probe)：已知序列的标记单链核酸片断，用于检测与其互补的待测核酸。

8 Base pairing occurs in duplex DNA and also in intra- and inter-molecular interactions in single-stranded RNA (or DNA).

9 基本概念 原位杂交（In situ hybridization, ISH）： 菌落原位杂交 (Colony ISH) 组织原位杂交(Tissue ISH)： 胚胎原位杂交(Embryo ISH) ： 斑点/狭缝杂交(Dot/slot blot) ：

10 基本概念 Bio-chip（生物芯片） DNA chip / microarray Gene chip / microarray
Oligonucleotide microarray cDNA chip Protein chip microRNA chip Lab-on-chip（芯片实验室）

11

12

13 分子杂交技术 生物大分子的印迹杂交技术

14 分子杂交技术 定义：凝胶电泳分离待测DNA、RNA、Pr并转移固定到结合物上，然后与探针/抗体杂交分析
原理：核酸变复性（序列互补）/抗原-抗体 基本工艺： 凝胶电泳（原位处理） 样品转移及固定 杂交分析（免疫结合分析）

15 分子杂交技术 1969 ，In situ hybridization（ISH） 1975，Southern，Southern blot: DNA 1977，Alwine，Northern blot：RNA 1979，Towbin，Western blot：Pr 1982，Reinher，Eastern blot：Pr(IEF)

16 分子杂交技术---探针 探针基本条件（特点） 标记物（32p, 35S, 125I, Digoxigenin, FITC）
单链核酸（ssDNA，sscDNA(更常用)） 高特异性（~500bp） 标记物稳定灵敏，检测方便安全

17 分子杂交技术---探针 探针的种类 DNA probe（基因copy数、病原基因诊断） cDNA probe（基因表达等最常用）
RNA probe（ISH） Oligonuleotide-probe （25~50bp；基因诊断，SNP分析、测序、点突变检测）

18 分子杂交技术---探针 探针标记物 放射性标记物（ [α-*N]-dNTP ） 非放射性标记物
32p(14d)、35S(87d)、3H(12y)、125I(60d) 非放射性标记物 半抗原：生物素、地高辛 荧光素：异硫氰酸荧光素（FITC）

19 分子杂交技术---探针 -32P- dNTP结构 A、 G 、 C或 T N H P 32P O OH HO OCH2

20 分子杂交技术---探针

21 分子杂交技术---探针 探针标记 随机引物法 缺口平移法 (DNaseI and DNA聚合酶I) 末端标记法
碱性磷酸酶-T4多核苷酸激酶 [γ-32p]-ATP标记DNA/RNA-5′ 末端转移酶（poly(N*)n） T4DNA聚合酶/Klenow片断 （粘末端补平）

22 分子杂交技术---探针 探针纯化 乙醇沉淀法 凝胶过滤法 （G-50 Spin column）

23 分子杂交技术—印迹 印迹（转膜）支持物： 硝酸纤维素膜（NC膜） 尼龙膜 PVDF膜（western blot）
N+-nylon （DNA/RNA） 中性膜 PVDF膜（western blot）

24 分子杂交技术—印迹 印迹（转膜）方法： 毛细管虹吸转移法 真空转移法 电转移法

25 分子杂交技术—印迹 毛细管虹吸转移法 湿滤纸 缓冲液 滤纸桥 凝胶 硝酸纤 维素膜 吸水纸 玻璃板 支持台 容器 重物

26 分子杂交技术—印迹 尼龙膜 凝胶 滤纸 海绵 凝胶支持夹 缓冲液 电极 + – 电转移法

27 分子杂交技术—印迹 真空转移法-1h

28 分子杂交技术—印迹 真空转移装置

29 分子杂交技术—印迹 Western blot (SDS-PAGE及转膜系统)

30 分子杂交技术—影响因素 离子强度(高-消除静电斥力-利于杂交) 温度（低于Tm 20-25℃） 有机试剂（去离子甲酰胺）-降低Tm
样品/探针分子的大小和复杂程度 洗涤条件（高严谨性，洗去非特异性结合探针） 支持物 添加物（吸附DNA探针，使DNA接触面增大）

31 # 预杂交 为减少探针与广泛存在的非互补核酸的非特异性结合，杂交前用封闭物将这些非特异位点封闭。
变性的非特异性DNA：常用鲑鱼精子DNA或小牛胸腺DNA。当与滤膜一起孵育后，除滤膜上已吸附样品DNA的区域外，它们可被吸附到所有其它区域，使整个背景覆盖一层。由于它们与探针无同源性，在交杂反应中可大大减少探针的非特异性结合，使背影清晰。 高分子化合物：某些高分子化合物具有封闭膜上非特异位点的能力。一般常用Denhard`t溶液，包括聚乙烯吡咯酮、小牛血清白蛋白、聚蔗糖。

32 分子杂交技术—基本流程 样品及探针制备 样品电泳分离 转膜 预杂交 杂交 洗膜 分析（压片、显色、荧光观察等）

33 分子杂交技术 Southern blot DNA提取 酶切 电泳/拍照 转膜/固定 探针制备 预杂交 杂交 洗膜 扫磷屏

34 ---UV交联仪 分子杂交技术 多用途254nm紫外辐射系统，主要用于将核酸交联于膜上。还用于琼脂凝胶中DNA的切割，RecA突变筛选，胸腺二聚体产生的部分限制性内切酶消化，UV灭菌消除PCR污染。另紫外灭菌-聚合物紫外处理。

35 分子杂交技术 Southern blot 应用 DNA多态性分析（RFLP分析/SNP/SSCP/RAPD） 基因突变检测
基因copy数检测 重组子筛选 DNA指纹分析 测序

36 分子杂交技术 Southern blot 应用 DNA指纹分析 血迹中的DNA

37 Northern blot 分子杂交技术 基因表达分析 mRNA长度及半定量分析 用10xSSC转移RNA 至膜上 转膜
RNA 分子（TRIzol） 甲醛变性电泳 至膜上 转膜 杂交、显影 凝胶 滤膜 用10xSSC转移RNA 吸附有RNA片段的膜（亚甲蓝染色） 带有RNA片段的凝胶 分子杂交技术 Northern blot 基因表达分析 mRNA长度及半定量分析

38 分子杂交技术 Western blot 蛋白提取/样品准备 SDS-PAGE 电转/丽春红S染色 封闭 一抗孵育 洗涤一抗 二抗孵育 洗膜
结果观察/显色（Dig-AP/FITC） 组织蛋白

39 分子杂交技术 ISH 胚胎/组织制备固定 消化/再固定/洗涤 RNA探针制备 封闭 杂交/洗涤 一抗/洗涤 二抗/洗涤
斑马鱼krox20基因原位杂交图 3,5菱脑节 ISH 胚胎/组织制备固定 消化/再固定/洗涤 RNA探针制备 封闭 杂交/洗涤 一抗/洗涤 二抗/洗涤 显色(Dig-、FITC、Cy5) 抗衰老基因Klotho原位杂交图

40 分子杂交技术 FISH

41 生物芯片Biochip

42 生物芯片 定义：在斑点杂交基础上，模拟制备大规模集成电路的基本原理，集成了探针原位合成、照明平板印刷、精密控制、激光共聚焦显微技术发展来的一门分子生物学技术 原理：将大量样本固定于较小的支持物上，然后与标记好的待测样品杂交，再检测杂交信号的强弱，从而判断样本中待测DNA、RNA、Pr等分子数量或活性状态 特点：高通量、微型化、集约化、标准化等

43 生物芯片

44 生物芯片 种类 微阵列芯片（基因芯片/蛋白芯片/细胞芯片等）
微流控芯片（属于主动式芯片，如样品制备芯片、PCR芯片、毛细管电泳芯片和色谱芯片等） 芯片实验室（以生物芯片为基础的集成化分析系统 ;可完成如样品制备、试剂输送、生化反应、结果检测、信息处理和传递等一系列复杂工作 ）

45 生物芯片 基本流程： 芯片制备 样品制备（Sample-Cy3；Control-Cy5） 分子杂交 检测分析（Confocus、CCD）
原位合成法---原位光照蚀刻 微量点样法 样品制备（Sample-Cy3；Control-Cy5） 分子杂交 检测分析（Confocus、CCD）

46 生物芯片 原位光照蚀刻原理 石英片氢化后封闭 设计11um见方窗口遮罩对封闭部分光解 将nt加入通过化学偶合连接到晶片上
更换不同的遮罩进行UV光解 加入nt进行化学偶合反应 重复上两步可合成所需长度及序列的寡核甘酸

47 生物芯片 微量点样制备

48 生物芯片 激光共聚焦显微镜

49 生物芯片---应用 抗体芯片（Ab Microarray 380 ）
第一张商品化的抗体芯片是由美国BD Clontech公司推出的。这是一张用于研究抗体的芯片，芯片上排列了378种已知蛋白的单抗，这些单抗对应的蛋白都是细胞结构和功能上十分重要的蛋白，涉及信号传导、肿瘤、细胞周期调控、细胞结构、细胞凋亡和神经生物学等广泛的领域。通过这张芯片，在一次实验中就能够比较几百种蛋白的表达变化

50 生物芯片---应用 测序 基因芯片的测序原理图

51 生物芯片 基因表达

52 生物芯片---应用 基因诊断 DNA结构检测 RNA表达检测 能诊断癌症的基因芯片

53 生物芯片---应用 药物研究与开发 与药物代谢相关基因芯片

54 生物芯片---应用 中医药研究 中药特性 中药药理 中药药效

55 生物芯片---应用 用药个体化检测 个体化药物治疗基因检测芯片