ELISA检测原理及方法 杭州赫贝，专业实验外包服务 联系人：李海龙13857120082.

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1 ELISA检测原理及方法 杭州赫贝，专业实验外包服务 联系人：李海龙

2 实验目的 实验原理 常用ELISA方法 实验材料 操作步骤

3 实验目的 酶联免疫吸附测定（ 简称ELISA）是在免疫酶技术的基础上发展起来的一种新型的免疫测定技术,通过抗原（抗体）吸附在固相载体上，加待测抗体（抗原）, 再加相应酶标记抗体（抗原）,生成抗原（抗体）－－待测抗体（抗原）－－酶标记抗体的复合物，再与该酶的底物反应生成有色产物。借助分光光度计的光吸收计算抗体（抗原）的量。

4 实验原理 （1）抗原或抗体吸附于固相载体表面，并保持其免疫学活性；
（2）抗原或抗体通过共价键与酶连接形成酶结合物，并且此种酶结合物仍能保持其 免疫学和酶学活性； （3）酶结合物与相应抗原或抗体结合后，可根据加入底物的颜色反应来判定是否有免疫反应的存在，并且颜色反应的深浅与待检样品中相应抗原或抗体的量成正比。

5 常用ELISA方法

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10 实验材料 1.包被缓冲液（PH9.6 0.05M 碳酸盐缓冲液）： NaCO3 1.59g NaHCO3 2.93g 加去离子水1L。
2.洗涤缓冲液（PH M PBS）: KH2PO g NaHPO4.12H2O g NaCl g KCl g Tween % 0.5ml 3.稀释液（1%BSA）： BSA 1g 加PBS100ml。 4.封闭液： 5%蔗糖和2%BSA或5%脱脂乳。 5. 96孔酶标板。 6.酶标仪。 7.显色液和终止液。

11 间接ELISA检测抗体操作步骤 1. 包被抗原：将定量好的抗原用包被液稀释到适当浓度，一般为1～10ul/孔，每孔加200ul，37℃ 温育1小时后，4℃冰箱放置16～18小时。 2. 洗涤：倒尽板孔中液体，加300ul洗涤液，静放三分钟，反复三次，最后将反应板倒 置在吸水纸上，使孔中洗涤液流尽。 3. 封闭：加5%蔗糖和2%BSA的封闭液200ul，37℃放置1小时。 4. 洗涤同2。 5. 加被检血清：用稀释液将被检血清作倍比稀释，在每个稀释梯度取100ul样品加入包被好抗原的酶标板空中，同时作空白对照和阴性对照，37℃放置2h。 6. 洗涤同2。 7. 加对应的辣根过氧化物酶标记的抗体, 每孔100ul, 放置37℃ 1小时。 8. 洗涤同2。 9. 显色：显色液100ul，室温暗处10－－15分钟。 10. 加终止液：每孔50微升。 11. 观察结果：用酶联免疫检测仪记录450nm读数。

12 注意事项 　　1.　在试验过程中，应分别以阳性对照与阴性对照控制试验条件，待检样品应作重复，以保证实验结果的准确性。有时本底较高，说明有非特异性反应，可采用羊血清、兔血清或BSA等封闭。 　　2.　固相载体的选择：许多物质可作为固相载体，如聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙酰胺和纤维素等。目前常用的是96孔聚苯乙烯凹孔板。不管何种载体，在使用前均可进行筛选：用等量抗原包被，在同一实验条件下进行反应，观察其显色反应是否均一性，据此判明其吸附性能是否良好。 　　3. 包被抗体(或抗原)的选择：将抗体(或抗原)吸附在固相载体表面时，要求纯度要高,吸附时一般要求PH在9.0～9.6之间。吸附温度，一般多采用4℃18～24小时。蛋白质包被的最适浓度需进行滴定：采用不同的蛋白质浓度进行包被后，在其它试验条件相同时，观察阳性标本的OD值。选择OD值最大而蛋白量最少的浓度。对于多数蛋白质来说通常为1～10μg／ml。 　　4.　酶标抗体工作浓度的选择：首先用直接ELISA法进行初步效价的滴定。然后再固定其它条件或采取“方阵法”在正式实验系统里准确地滴定其工作浓度。

13 谢谢 杭州赫贝，专业实验外包服务 联系人：李海龙