实验十三 组织培养与病毒的 细胞感染法 练习内容 1 ．鸡胚纤维母细胞培养法（示教） 2 ．病毒的空斑形成试验（示教） 3 ．致细胞病变作用的观察（示教）

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1 实验十三 组织培养与病毒的 细胞感染法 练习内容 1 ．鸡胚纤维母细胞培养法（示教） 2 ．病毒的空斑形成试验（示教） 3 ．致细胞病变作用的观察（示教）

2 目的要求 1 ．了解细胞培养的原理与方法 2 ．了解病毒空斑形成试验方法与意义 3 ．了解病毒对细胞致病变作用的类型。

3 一、单层细胞培养法 （一）鸡胚纤维母细胞培养法 （二）人胚肾细胞培养法 二、人双倍体细胞培养法 双倍体细胞株，是一种能在体外分裂 50 代左右而 — 直保持其双倍染色体的单 层细 胞，人双倍体细胞来源可以是人 胚肺（ 4 个月以内的胎儿）或人胚肾

4 三、传代细胞培养法 传代细胞系是一种永远在体外繁殖传代的 单屋细胞。它们通常来源于癌细胞或由双 倍 体细胞转化而来，实验室常用从人瘤细胞建 立起来的传代细胞如 Hela 细胞， KB 细胞、 HEP—2 细胞已广泛地应用于病毒实验。这些 传代细胞系的最大特点是通过规律地间 隔传 代，可以无限制地传下去，如果将它们悬浮 四、器官培养

5 五、病毒的细胞感染法 在单层 细胞上测定病毒的方法有多种， 常见的有病毒空斑形成试验、病毒空斑 形成抑制试验. 六、细胞致病作用的观察 细胞致病作用也称 “ 细胞病变作用 ” （ Cytopathic-effect ， CPE ），根据病毒 和感染细胞的不同，细胞病变作用大致 上可以分不同三个类型。

6 （一）全变型 指整个细胞都发生改变，常表现为（ 1 ）细胞 核及整个细胞都发生肿胀，胞浆呈颗粒样变 性、胞膜边缘不整齐，或（ 2 ）整个细胞发生 碎裂、皱缩、变圆、脱落。 （二）包涵体型 有的病毒可在胞核或胞浆内形成包涵体（见 表 13—3 ）。 （三）融合型 有的病毒（如麻疹病毒、单纯庖疹病毒等） 可使多数病变细胞间相互发生融合而呈 “ 巨 细胞 ” （但各个细胞的胞核仍可分辨）。

7 【结果观察】 纵观整个单层细胞，以下列符号表示其病变 程度： （－） — 无细胞病变； （ + ） —25 ％以下的细胞有病变作用； （ ++ ） 一 50 ％的细胞有病变作用； （ +++ ） 一 75 ％左右的细胞有病变作用； （ ++++ ） 一 75 ％以上的细胞有病变作用；

8 某些病毒引起细胞病变的主要特征 ( 表 13—2 )

9 实验十四 病毒的血清学试验 血清学试验的方法很多，一股实验室最 常用的是中和试验，补体结合试验和红 细胞 凝集及凝集抑制试验。近年来免 疫荧光技术、免疫酶联吸附技术、间接 红细胞凝集试验、 琼脂扩散试验以及 红细胞吸附抑制试验等技术，也成为实 验室病毒诊断的常规技术。

10 练习内容 1 ．病毒的血球凝集试验 2 ．病毒的血球撬集抑制试验

11 目的要求 1 ．了解病毒的血清学试验方法与原理 2 ．掌握病毒的血凝试验和血抑试验的 方法与结果判读 血清学试验是实验室诊断病毒和鉴定病 毒的重要手段，也是研究病毒的基本方 法之一。

12 三、病毒的血球凝集与血球凝 集抑制试验 某些病毒（如流感病毒、副流感病毒、腮腺 炎病毒、脑炎病毒等）能选择性地凝集个别 动物的红细胞，这种现象称为红细胞凝集现 象，简称血凝现象，见表玉 14 一 4 。当这些病 毒与相应的抗体发生特异性结合后，失去了 与红细胞凝集的能力，称为红细胞凝集抑制。 红细胞凝集与红细胞凝集抑制试验比补体结 合试验操作简单、快速、节约、并且血凝抑 制试验具有敏感性高，特异性强的优点. 这里 我们以新鸡城瘟病毒 NDV 为例介绍血凝和血 凝抑制试验。

13 【材料】 新城鸡瘟病毒鸡胚接种尿囊液 1 份 0.5 ％鸡血球悬液 1 管 生理盐水或 PBS 1 瓶 96 孔微量血清盘 1 块 微量稀释棒 1 支 无菌试管 1 支

14 【方法】 1 ．在微量血清盘的末孔标记为对照孔。 2 ．各孔中加生理盐水 25 微升。 3 ．取病毒鸡胚尿囊液（经离心） 0.1 毫升加 入无菌试管，然后加生理盐水 0.9 毫升（即 1 ∶ 10 稀释）。 4 ．取 1 ∶ 10 病毒稀释液 25 微升加入第 1 孔，再 吸 25 微升置 2 孔，用微量稀释棒捻转 20 次 …… 依次稀释，直至第 9 孔弃去 25 微升。 5 ．各孔中加 0.5 ％鸡红血球 25 微升充分摇匀。 6 ．置室温经 30 分钟， 40 分钟， 1 小时各观 察一次结果。以 45 分钟为准。

15 新城鸡瘟病毒血凝试验操作顺 序 ( 表 14-5 )

16 25 孔 列 12345678910 病毒稀 释度 1 ∶ 101 ∶ 201 ∶ 401 ∶ 801 ∶ 1601 ∶ 3201 ∶ 6401 ∶ 12801 ∶ 2560 对照 生理盐水（ μl ） 25 1 ∶ 10 病毒悬液 （ μl ） 25 — 弃去 25 0.5% 鸡红血球 （ μl ） 25 摇匀后，置室温静止 30—50 分钟

17 【结果判读】 各孔出现的血球凝集程度以 +++ 、 +++ 、 ++ 、 ++ 、 + 、 — 表示。 ++++ 为全部血球发生凝集，呈颗粒状薄膜 铺于孔底； +++ 约有 50 ％血球发生凝集； ++ 约有 50 ％血球发生凝集； + 约有 25 ％血球发生凝集； — 不凝集，表现为血球沉于孔底，呈一致 密小点，边缘光滑，圆润。 血凝试验的结果以 50 ％血球凝集（ ++ ）的 最高病毒稀释度为试验的血凝滴度，即为 1 个 血凝单位。

18 血球凝集抑制试验 【材料】 除血球凝集试验所用材料外，血清取 鸡免疫血清。

19 【方法】 1 ．血凝素单位的配制和调配 2 ．住微量血清盘上编号，并设血清对 照、病毒（血凝集）对照和血球对照 孔．然后 2—11 孔中各加生理盐水或 PBS25 微升。 ． 3 ．将 1 ∶ 10 血清加入 1 、 2 、 9 孔，并从 第 2 孔起作一系列倍比稀释至 1 ∶ 1280 或更 高的稀释度，每孔为 25 微升。 4 ．按操作简表加入 4 单位血凝集。

20 6 ．混匀，在室温下作用 20 分钟。 7 ．各孔中滴加 0.596 鸡血血球悬液 50 微升。 8 ．在血清对照、病毒（血凝素）对照，血球 对照孔中滴加生理盐水或 PBS 各 25 微 升。 9 ．混匀后，在室温下静止， 30 分钟， 60 分钟 各观察一次结果。一般以 60 分钟结果为准， 但如果血球下滑显著，则以 30 分钟结果判读。

21 25 1234567891011 血清稀 释度 1 ∶ 101 ∶ 201 ∶ 401 ∶ 801 ∶ 1601 ∶ 3201 ∶ 6401 ∶ 1280 血清 对照 病毒 对照 血球 对照 生理盐水（ μl ） NS2550 稀释的血清（ μl ） 25 弃去 — — 4 单位血凝（ μl ） 25 — — 摇匀后，置室温静止 30—50 分钟 0.5% 鸡红 血球（ μl ） 0.5

22 1 ．根据各孔血球凝集程度，以 “++++ 、 +++ 、 ++ 、 + ，－ ” 表示。 2 ．查看各对照孔：血清对照不凝集（－）： 病毒对照为完全凝集（ ++++ ），血球对照则 应不凝集（ — ）。 3 ．以出现完全抑制血球凝集（即不凝集） 的最高血清稀释度为其最终滴度。例如 稀释倍数： 1 ∶ 10 l ∶ 20 1 ∶ 40 l ∶ 80 1 ∶ 160 1 ∶ 320 l ∶ 640 1 ∶ 1280 结 果： － － － － － ++ +++ ++++ 此血清血凝抑制滴度为 1 ∶ 160 ，结果判读】

23 实验十五 病毒的快速诊断 目的要求 1 ．初步掌握电镜下病毒的基本形态 2 ．了解 ELISA 的原理、方法及结果判 读

24 练习 ELISA

25 酶联免疫吸附试验 （ Enzyme Linked immunosorbent assay ， ELISA ） ELISA 是当前各实验检测抗原抗体最常 用的方法之一，也是进行病毒快速诊断 的重要手段。它具有灵敏度高（ 10 － 9 一 10 － 12 克），特异性强、操作简便、易于 观察、便于现场大规模检查。

26 ELISA 的种类有许多种，但用于病毒快 速诊断常用间接法和双抗体夹心法

27 （一）间接法（ indirect method ） 1 ．抗原包被 纯化抗原用 pH9.6 碳酸盐缓冲液 适当稀释后，在微量凹孔板上，每孔加 100 微 升，置湿盒中 4 ℃过液，洗涤三次。 2 ．加待捡血清 每孔加 100 微升适当稀释的 待检血清，置湿盒中， 37 ℃ 2 小时。洗涤三次。 3 ．加酶结合物 每孔加 100 微升酶标记抗人 Ig ， 置湿盒中， 37 ℃ 2 小时。洗涤三次。 4 ．加底物 每孔加底物 100 微升，置湿盒， 37 ℃ 30 分钟。 6 ．加终止液 100 微升。 6 ．读取结果。

28 （二）双抗体夹心法（ Double antibody sandwich method ） 1 ．抗体包被 已知抗体用 pH9.6 碳酸盐缓冲液 稀释至 1—10 微克／毫升，在微量凹孔板上， 每孔加 100 微升包被，置湿盒 4 ℃过夜。洗涤三 次。 2 ．加待检标本 每孔中加含抗原的待检标 本 100 微升置湿盒 37 ℃小时。洗涤三次。 3 ．加酶结合物 每孔加酶标记的特异性抗 体 100 微升置湿盒 37 ℃小时。洗涤三次。 4 ．加底物 5 ．加终止液 6 ．读取结果

29 【结果判读】 用酶标测定仪测在 492nm 下各标本光 密度 OD 值。 ELISA 的结果易受到各种因素影响，因 此每次试验（每一块试验板）都设阳性 对照，阴性对照、稀释液对照、阳性对 照 OD 值 ≥1.0 ，阴性对照 OD 值 ≤0.2 ，结 果用 P ／ N 值表示。 P/N 值 1.5-2.1 者为可疑 P ／ N 值 <1.5 为阴性 P ／ N 值 ≥2.1 者为阳性

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