模块九 植物遗传转化技术.

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1 模块九 植物遗传转化技术

2 知识点3 转基因植株的检测 进行基因转化后，外源基因是否整合到植物基因组上并得到有效是我们要回答的问题。因为只有整合有外源基因的植株我们才能认为是转基因植株，得到有效的表达的植株才能可能在生产上应用。

3 1.外源目的基因PCR鉴定 利用PCR测定导入作物植株基因的特 定DNA序列是否存在。PCR可对插入两个 已知DNA序列之间的特定DNA序列进行特 别和灵敏的扩增。通常，导入的基因结 构（基因卡盒）由3部分构成：启动子、 结构基因、终止子。

4 PCR扩增反应体系 常规PCR检测用引物 反应成分 终浓度 所需体积 10×Buffer 1ⅹ 1.5ul 25mM MgCl2 1.5mM
5uM PrimerⅠ 0.2uM 0.6ul 5uM PrimerⅡ 10mM dNTP 0.2mM 0.3ul 5U/ulTaq 酶 1.25U 0.25ul 25ng/ul DNA 20-40ng 2ul ddH2O to  Total 15ul 常规PCR检测用引物 检测基因 引物序列(5'-3') 产物(bp) CaMV35S 正TCATCCCTTACGTCAGTGGAG 反CCATCATTGCGATAAAGGAAA 165 NOS 正GAATCCTGTTGCCGGTCTTG 反T T ATCCTAGTTTGCGCGCTA 180 Lectin 正GCCCTCTACTCCACCCCCATCC 反GCCCATCTGCAAGCCTTTTTGTG 1l8 ZEIN 正TGAACCCATCCATGCAGT 反GGCAAGACCATTGGTGA L73 Bt 正CAGAGCTCCTATGTTCTCTTGGAT 反AGCTCGGTACCTCGACTTATTCAG 521

5 2.外源基因转录的RT-PCR检测 反转录酶 AAAn3’ mRNA Olig(dT)n Taq DNA聚合酶 双链cDNA 第一链cDNA mRNA RT-PCR即反转录PCR（reverse transcription PCR ）是先将RNA 转录成cDNA，接着以cDNA为模板进 行PCR扩增的技术。 由于RT-PCR的敏感性，应用 PCR定量法可研究低表达活性基因的 mRNA生理变化动态。 反转录PCR

6 3.实时荧光定量PCR（real time fluorescence quantitative PCR）测定法：
实时荧光定量PCR是在PCR 反应体系中加入荧光基团，利 用对荧光信号积累的实时检测 来监测整个PCR进程，最后通 过标准曲线对未知模板进行定 量分析的方法。

7 实时定量PCR仪

8 几种外源基因实时荧光定量PCR用引物和探针
检测基因 引物序列(5'-3') 产物(bp) NPTⅡ 正AGGATCTCGTCGTGACCCAT 反GCACGGAAGCGGTCA FAM-CGCCCAGCCGGCCACAGTCGAT-TAMRA 183 BAR 正ACAAGCACGGTCAACTTCC 反ACTCGGCCGTCCAGTCGTA FAM-CCGAGCCGCAGGAACCGCAGGAG-TAMRA 175 NOS 正ATCGTTCAAACATTTGGCA 反ATTGCGGGACTCTAATCATA FAM-CATCGCAAGACCGGCAACAGG- TAMRA 165 CaMV35S 正CGTCTTCAAAGCAAGTGGATTG 反TCTTGCGAAGGATAGTGGGATT FAM-TCTCCACTGACGTAAGGGATGACGCA-TAMRA 80

9 4.外源基因核苷酸序列分析 随着人类基因组计划的完成，DNA 序列分析技术逐渐完善，这位转基因作 物的检测提供了一个新的方法。

10 Sanger 双脱氧末端终止法原理

11 DNA自动测序仪 自动荧光垂直板凝胶电泳测序仪 代表：ABI公司377型垂直板自动测序仪
96个泳道 读长高达 bp 日分析能力达300个样品                                                                                                                                                   电泳，看谁跑得快 荧光检测探头 自动荧光毛细管凝胶电泳测序仪 代表：安玛西亚公司 MegaBACE1000 96个电泳 读长高达 bp 日分析能力达1000个样品 短片段先检测到 长片段后检测到

12 4.核酸分子杂交检测法 若退火的核酸来自不同的生 物有机体，则称形成的双链分子 就叫做杂合分子，此过程称为分 子杂交。
双链DNA或具有二级结构的RNA 变性后，具有互补序列的两条单 链的退火复性过程 若退火的核酸来自不同的生 物有机体，则称形成的双链分子 就叫做杂合分子，此过程称为分 子杂交。

13 在分子杂交时，若其中的一条链被人为标记上， 该标记可以通过某种特定方法检出，即成为所谓 的探针。探针与其互补的核育酸序列杂交后，杂 交体也就带上了同样标记，可检测出来。
这样，以特定的已知核酸序列做探针，就可以在 诸多的核酸序列中，通过杂交探测出与其互补的 序列，因而分子杂交是进行核酸序列分析，重组 子鉴定以及检测外源基因整合及表达的强有力的 手段。

14 4.1 DNA印迹杂交(Southern blotting)
根据毛细管作用的原理，使在电泳凝胶中分离的基因组DNA片段转移并结合在适当的滤膜上，然后通过同标记的单链DNA或RNA探针的杂交作用检测这些被转移的DNA片段，这种实验方法叫做DNA印迹杂交技术。 此方法是在基因组水平对转基因植株进行的检测

15 DNA印迹杂交一般步骤 探针 (probe)为带有标记的外源基因或或其同源的RNA或寡核苷酸序列。

16 4.2 RNA印迹杂交(Northern blotting)
将变性琼脂糖胶电泳分离的RNA或mRNA，转移吸 印到特殊活性滤膜或滤纸上，与标记的探针杂交，然 后放射自显影以分析RNA（大小、数量）的方法，叫 做RNA吸印杂交技术 此方法是在转录水平对转基因植株进行的检测

17 5.外源基因表达蛋白的鉴定 此方法是在表达水平对转基因 植株进行的检测
外源基因编码蛋白在转基因植 物中能够正常表达并表现出应有的 功能是植物基因转化的最终目的。 此方法是在表达水平对转基因 植株进行的检测

18 5.1酶联免疫吸附(ELISA)法 酶联免疫吸附法 (Enzyme-Linked ImmunosorbentAssays,ELISA) 基本原理是酶分子与抗体或 抗抗体分子共价结合，此种结合 不会改变抗体的免疫学特性，也 不影响酶的生物学活性。

19 酶标记抗体可与吸附在固相载体上的抗原或抗体发生 特异性结合。滴加底物溶液后，底物可在酶作用下使其所含 的供氢体由无色的还原型变成有色的氧化型，出现颜色反应。 因此，可通过底物的颜色反应来判定有无相应的免疫反应， 颜色反应的深浅与标本中相应抗体或抗原的量呈正比。 此种显色反应可通过ELISA检测仪进行定量测定，这样就 将酶化学反应的敏感性和抗原抗体反应的特异性结合起来， 使ELISA方法成为一种既特异又敏感的检测方法。

20 5.2蛋白质印迹杂交法(Western Blotting )
与Southern Blot或 Northern Blot杂交方法 类似，但Western Blot法 采用的是聚丙烯酰胺凝胶 电泳，被检测物是蛋白质， “探针”是抗体，“显色” 用标记的二抗。

21 经过PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)分离的蛋白质样品， 转移到固相载体(例如硝酸纤维素薄膜)上，固相载体以非 共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及 其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗 原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第 二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分 离的特异性目的基因表达的蛋白成分。