第七章 动物细胞培养 动物细胞融合 动物细胞融合：(cell fusion)

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1 第七章 动物细胞培养 动物细胞融合 动物细胞融合：(cell fusion)
第七章 动物细胞培养 动物细胞融合 动物细胞融合：(cell fusion) 离体条件下，两个或多个动物细胞相融合并成一个细胞的过程。也可称为细胞杂交。

2 动物细胞融合 同核体（homokaryon），由同一生物个体的亲本细胞（基因型相同）融合所形成的融合细胞；异核体（heterokaryon），由不同种属或同一种属的不同个体的亲本细胞（基因型不同）发生融合细胞。 同种细胞在培养时靠在一起的细胞自发合并，称自发融合；异种间的细胞必须经诱导剂处理才能融合，称诱导融合。 对称融合就是两个完整的细胞间的融合，非对称融合就是一个亲本的核或细胞质失活后再与另外一个完整的细胞进行的融合。

3 荧光显微镜下观察细胞融合 电镜下观察细胞融合

4 动物细胞融合 发展史： 19世纪30年代，科学家们相继在肺结核、天花、水痘、麻疹等疾病患者的病理组织细胞中观察到多核细胞。
19世纪70年代，科学家们在蛙的血细胞中也看到了多核细胞的现象。 1958年，日本科学家0kada用灭活的仙台病毒诱导人的艾氏腹水肿瘤细胞融合多核细胞成功。

5 动物细胞融合 意义： 1．有性杂交变无性杂交,加快育种速度； 2．进行细胞融合可打破远缘杂交的不亲和性，培育远缘杂交新种；
3．创造新细胞质杂种； 4．制备单克隆抗体、核质替换和细胞器的互作研究。

6 动物细胞融合 融合的过程： 相互靠近→细胞桥形成→胞质渗透→细胞核融合

7 动物细胞融合 方法： 生物法—仙台病毒法 化学法—PEG结合高Ca2＋、高pH诱导法 物理法—电融合诱导法

8 动物细胞融合 生物法： 常用的病毒有疱疹病毒(herpes virus)、牛痘病毒(cowpox virus)和副黏液病毒科病毒等，属于副黏液病毒科的仙台病毒(Sendai virus)应用最为广泛。 该方法建立最早，但是病毒制备困难、操作复杂、重复性和融合率低。 目前，这种方法主要用于实验室研究。 副粘液病毒属常用的除了仙台病毒，还有新城鸡瘟病毒和副流感病毒。都是总体诱导融合效率都较低。

9 病毒诱导细胞融合示意图

10 动物细胞融合 化学法： 常用的化学融合剂主要包括NaNO3、高pH的高浓度Ca2+、聚乙二醇(PEG)、溶血卵磷脂、聚甘油、油酸、油胺和二价阳离子载体等。其中以PEG的使用最为广泛。 用PEG诱导细胞融合是Potecrvo在1975年获得成功的。 PEG的分子量在 d（道尔顿）之间。一般浓度为40%-50%， pH= ，在37℃下作用2~3min效果最佳。 PEG的作用机理： 由于PEG分子具有轻微的负极性，故可以与具有正极性基团的水、蛋白质和碳水化合物等形成H键，当PEG分子链足够长时，在相邻原生质体之间形成分子桥，其结果是使原生质体发生粘连。与膜相连的PEG分子被洗掉后，膜上电荷发生紊乱而重新分配。当两层膜紧密接触的区域电荷重新分配时，可能使一种原生质体上的带正电荷的基团连接到另一种原生质体的带负电荷的基团上，进而促使原生质体的融合；另外，PEG能增加类脂膜的流动性，也使原生质体的核、细胞器发生融合成为可能。

11 动物细胞融合 PEG法： 优点是融合成本低，勿需特殊设备；融合效率高；融合过程不受物种限制。是目前主要的细胞融合的方法。

12 动物细胞融合 物理法： 最常使用的就是电诱导融合法。
1979年，Senda等首先应用微电极，成功诱导植物原生质体发生融合。1981年，Zimmermann等又进一步采用加在平行电极板上的高压脉冲诱导植物原生质体、哺乳类细胞和酵母菌的融合。 需要特殊的设备—细胞融合仪。 在高电压，短时间内的直流电脉冲的诱导下，原生质体质膜表面的电荷和氧化还原电位发生改变，使异种原生质体黏合并发生质膜瞬间破裂，进而闭合成完整的膜形成融合体。

13 电镜下观察电诱导融合细胞

14 动物细胞融合 电融合法： 优点是融合效率高；融合技术操作简便，操作时间短；对细胞的没有毒害作用。
缺点是需要特殊设备，前期细胞的处理和准备要求较高。

15 动物细胞融合 融合效率的影响因素： （1）亲本细胞表面性质影响较大。 （2）细胞种类不同，融合效果也不同。
（3）细胞融合时需要适宜温度和运动状态。 （4）细胞融合过程中，通常耗氧量较大，缺氧时经常不融合。 （5）有些细胞融合时需要Ca2＋，否则不融合，细胞蛋白质亦发生变化。 （6）最适合的pH为7.4～7.8之间，在此范围之外，融合率均较低。