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微生物培养在女性 生殖道感染的诊断价值 四川大学华西第二医院临床检验科 周伟
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提 纲 背景介绍 1 生殖道标本的检测流程及方法学评价 2 特殊病原菌—B群链球菌的筛查 3 小结 4
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背景介绍 生殖道感染（reproductive tract infection） 指体内微生物平衡失调和通过性接触或医疗操作使病原体（细菌、病毒、衣原体等）由体外进入体内引起的生殖器官的感染。
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背景介绍 按感染部位 感染方式 上生殖道感染：也称盆腔炎，包括子宫内膜炎、输卵管炎、输卵管卵巢囊肿、盆腔结缔组织炎及盆腔腹膜炎等
下生殖道感染：包括外阴炎、阴道炎及宫颈炎。 感染方式 性行为（sexually transmitted disease,STD） 直接接触 医院诊疗措施 血液及母婴 自身内源性感染
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背景介绍 临床症状：外阴瘙痒、白带异常、性交不适感、急性尿道炎、腹痛和宫颈红肿压痛等。
在不同的部位可以由同一种病原体引起，或不同病原体混合感染，不同的病原体可以有相同或相似的的临床表现。
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背景介绍 常见病原微生物 杜克雷嗜血杆菌、淋病奈瑟菌、阴道毛滴虫、梅毒螺旋体、沙眼衣原体等一般都是有临床意义
酵母样菌、解脲脲原体、金黄色葡萄球菌、β溶血链球菌、肠杆菌科细菌和厌氧菌仅在某些临床条件下致病
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背景介绍 常见病原体 许多病原体仅限于特殊部位，部分如下 感染部位 可能相关病原体 阴户 梅毒螺旋体、杜克嗜血杆菌
衣原体、疱疹病毒、酵母样菌 阴道 阴道毛滴虫、酵母样菌、混合性阴道炎 子宫颈 淋病奈瑟菌、衣原体、疱疹病毒、放线菌 上尿路 淋病奈瑟菌、衣原体、需氧和厌氧细菌
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2015年我院产科生殖道标本分离菌构成比（n=521）
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2015年我院生殖道分离酵母样菌构成比（n=489株）
注：白色假丝酵母比例下降，非白色假丝酵母菌（光滑、克柔）增加 克柔假丝酵母菌对氟康唑天然耐药，光滑念珠菌对氟康唑敏感性降低
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常见病原微生物及耐药现状 阴道毛滴虫 甲硝唑敏感性大于90%-95% 甲硝唑耐药约5% 美国CDC资料
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常见病原微生耐药现状 念珠菌属 抗真菌药物 敏感率（%） 制霉菌素 99.24~100 酮康唑 89.31~94.83 氟康唑
66.25~82.76 咪康唑 31.3~55.17 特比萘酚 3.82~22.41 黎小东，宋卫忠，李平，等.广州地区妇女外阴阴道念珠菌病的病原分类及其体外药敏分析.国际检验医学杂志，2013,34（17）：
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常见病原微生耐药现状
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Gonococcal Isolate Surveillance Project, 27 sites, United States, 2014
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我院产科生殖道分离大肠埃希菌药敏 （n=127,2015年）
注：产ESBLs:31.5%；氨苄西林耐药率80%；头孢曲松耐药率41%；喹诺酮类20~38%；四代头孢、头霉素类、酶抑制剂、碳青霉烯类、阿米卡星耐药率低
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我院产科生殖道分离粪肠球菌药敏结果 （n=62,2015年）
说明：对头孢类抗生素、氨基糖苷类、克林霉素天然耐药；氨苄西林敏感性性高（>90%)
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我院产科生殖道分离B群链球菌药敏分析 （n=43，2015年）
说明： 青霉素100%敏感；红霉素耐药率85%；喹诺酮类、克林霉素耐药率>60%
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检测流程 标本采集 标本的选择和采集方法非常重要 常规不鼓励选择阴道标本 厌氧菌培养仅限于特定标本 尽量在抗菌药物使用前进行采样
采集部位大量的正常菌群使结果难以解释
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可以进行厌氧培养的标本：来自剖腹产的胎盘、子宫（子宫内膜）、后穹窿穿刺术、输卵管、卵巢、前庭大腺
不能进行厌氧培养的标本：宫颈内膜、阴道、尿道、阴道、恶露、会阴等 怀疑BV时，阴道分泌物涂片或唾液酸酶测定比培养更有效
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前庭大腺：直接针吸采集标本；通过指触诊 从舌下腺大管采集腺脓肿的脓液标本
子宫内膜：最好通过吸引刮匙采集。不应该使用无保护的拭子通过子宫颈采集。 盆腔炎：所有标本都通过侵入性操作技术采集：输卵管或卵巢标本外科手术；后穹窿穿刺术采集腹水。 子宫内节育环：将整个装置包括所有渗出液置于无菌容器送检，避免阴道或宫颈定植菌污染。 衣原体感染：宫颈柱状上皮细胞内寄生，通过拭子快速擦拭宫颈内区域采集细胞和分泌物。衣原体不能在阴道鳞状上皮细胞系生长，不会导致阴道炎，不能送检阴道分泌物
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外阴损伤部位经刮取、吸引和活检采集的标本，仅对梅毒有诊断价值。如果有梅毒样病变，使用干纱布仔细刮擦病变部位直至出现浆液（避免出血，会干扰暗视野显微镜检查结果解释），将一滴置于干净玻片上，立即观察螺旋性运动。 儿科要求：藻酸钙拭子适合用于采集儿童生殖道标本。生殖道标本通常用于调查潜在的虐待或月经前外阴阴道炎或尿道炎。青春期前的女孩绝大多数性传播疾病与阴道相关而不是子宫颈。
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子宫颈或宫颈内标本 避免受到阴道分泌物的污染 去除子宫颈外口粘液 润滑剂可能对淋病奈瑟菌有毒性
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正确的储存及运送标本 样本未能及时送达实验室时，必须储存在适当的环境下，以防止病原菌死亡，或因共生菌滋生过多，使得病原菌分离不出来，如淋球菌培养标本需37℃保温，厌氧培养标本禁止冷藏。 使用标本运送培养基：保持细菌活性。
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尿道分泌物检测 适应证：尿道炎、阴道滴虫病、念珠菌性阴道炎（SMIs推荐诊断念珠菌性阴道炎应同时采集阴道、宫颈和尿道拭子常规培养酵母菌）。常表现为急性尿道综合征或尿道膀胱炎 尿道炎病原：常见的包括肠杆菌科细菌和腐生葡萄球菌；不常见病原沙眼衣原体、淋病奈瑟菌、解脲脲原体、金黄色葡萄球菌、β溶血链球菌、产单核李斯特菌、阴道毛滴虫、HSV和腺病毒等。 标本主要采集尿道拭子或首次晨尿或长时（4h以上）间不排尿的首次尿 SMIs：UK Standards for Microbiology Investigation
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涂片革兰染色 生理盐水湿片 培养 检查方法 结果解释和评价 女性NG局部感染主要在宫颈，尿道感染常见于子宫切除患者；诊断NG感染敏感性较低
发现运动的滴虫有诊断价值，敏感性60% 培养 淋病奈瑟菌：GC选择性分离培养基、5%-10%CO2环境，尽快接种，金标准，可进行AST. 沙眼衣原体培养：临床应用不广，与NAATs相比，敏感性约为70% 阴道毛滴虫培养：临床应用不广，与NAATs相比，敏感性约为70% 生殖支原体培养：常规开展困难，生长慢，需特殊培养基，敏感性低 解脲脲原体和人型支原体培养：生长相对快，适合临床常规开展。UU和Mh可在健康人呼吸道和泌尿生殖道定值。无菌部位分离出有临床意义，非无菌部位应结合临床分析。 酵母菌培养：诊断念珠菌性阴道炎的标准之一
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阴道、宫颈、宫腔分泌物检测 适应证:VVC、BV、滴虫病、宫颈炎、子宫内膜炎、盆腔炎性疾病（PID）
标本类型：阴道分泌物、高位阴道拭子、宫颈拭子、各种抽吸物、胚胎产物
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阴道、宫颈、宫腔分泌物检测 病原 阴道正常菌群：乳杆菌属、链球菌属、肠球菌属、CNS等。
厌氧菌如拟杆菌属和厌氧球菌、阴道加德纳、酵母菌、大肠埃希菌样菌（coli-forms）、UU和支原体也属阴道正常菌群，但特定条件下也可引起阴道感染。
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阴道、宫颈、宫腔分泌物检测 病原 外阴阴道炎：主要青春期前女性，常见致病菌GAS、SA、白念、NG、HI。不常见病原如沙门菌、志贺菌、饶虫等。 细菌性阴道病（BV）：相关病原包括普雷沃菌、阴道加德纳菌、动弯杆菌属、消化链球菌属和人型支原体等。 B群链球菌: 单核细胞增生李斯特菌：可致孕妇、新生儿和免疫抑制患者严重感染
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阴道、宫颈、宫腔分泌物检测 脓毒性流产：可导致严重的孕妇感染甚至生命危险。大多数感染为多种病原，并涉及厌氧菌。梭菌属脓毒症并发流产具有潜在致病性。 化脓性宫颈炎：明确的病原包括CT、HSV、NG。 产后子宫内膜炎：主要为外阴阴道菌群上行进入子宫引起感染 输卵管炎：涉及多种病原，包括CT、NG、Mh、混合细菌，输卵管标本较子宫内膜拭子更好。
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阴道、宫颈、宫腔分泌物检测 盆腔炎性疾病（PID）：通常是一种多病原微生物感染性疾病，常见病原包括CT、NG、HIV、厌氧菌、肠杆菌科细菌、化脓性链球菌，其它如CMV、滴虫、肠球菌、放线菌、生殖支原体、Mh、UU（有争议） 宫内节育器（IUCDs）：宫内放置避孕器可能与PID有关。感染可由多种病原引起，分离出放线菌尤其衣氏放线菌可能有临床意义。
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检测方法 结果解释和评价 阴道分泌物涂片镜检 病原菌培养 诊断BV：与分离培养阴道加德纳菌相比，涂片革兰染色检查诊断BV相关度更高；
检查滴虫：敏感性仅50%-70%，阴性结果不能排除滴虫感染可能。 检查酵母菌：10%-20%女性阴道定值念珠菌或其他酵母，与培养法，敏感性约50%。 检查淋病奈瑟菌：宫颈分泌物革兰染色发现细胞内革兰阴性双球菌是诊断淋病奈瑟菌宫颈炎特异性指标，但非敏感指标，仅50%患者阳性；多形核白细胞对NG和CT宫颈炎阴性预示值较高；阴道分泌物不适合检测NG。 病原菌培养 对可疑滴虫病但镜检阴性的女性，应进行阴道分泌物培养阴道毛滴虫； 尽管HSV-2感染与宫颈炎有关，但使用特异性试验（如培养或血清学试验）检测HSV-2情况目前不清楚
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B群链球菌检测 B群链球菌（Group B streptococci，GBS） ，又名无乳链球菌（Streptococcus alactiae），具有较强的粘附能力，可定植于人体的阴道、直肠，是人体重要的条件致病菌。 B群链球菌（Group B streptococci，GBS）又名无乳链球菌（Streptococcus agalactiae）是一种革兰阳性的β溶血性链球菌，因其细胞壁多糖C物质属于Lancefield抗原分类中的B类而得名. GBS具有较强的粘附能力，可粘附于阴道、直肠的上皮细胞及血管内皮细胞，因此是人体较为重要的一种条件致病菌。由于分娩时可以发生垂直传播，所以GBS也是导致新生儿感染的重要病原菌，在产科学领域具有重要地位。 在20世纪70年代，GBS已被证实为围产期母婴感染的主要致病菌之一，在围产医学中占有不可忽视的地位，同时它也是婴幼儿败血症和脑膜炎最常见的原因 32
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B群链球菌筛查 GBS的危害 母体： 产道定植：10-30% 宫内侵入：流产、早产、宫内 发育迟缓、产后相关感染 新生儿： 肺炎： 败血症：
脑膜炎：20-60%神经系统后遗症 50-65% 国外流行病学资料显示，孕妇产道GBS的定植率约为6-45%；这些GBS可通过吸附和穿透能力，进入宫腔，造成宫内感染，通过产生水解蛋白酶等毒力因子和炎症反应等作用机制，进而诱发流产、早产、宫内发育迟缓以及产后相关感染。 对于产道有GBS定植的孕妇，约有50-65%会在分娩过程中通过羊水吸入或产道接触将GBS垂直传递给新生儿。由于新生儿皮肤薄弱及免疫系统发育不健全，极易发生GBS感染，主要包括早发型感染和迟发型感染。早发型感染是指发病年龄<7天的感染，主要表现为肺炎，通常迅速出现呼吸衰竭继而进展为败血症，是导致新生儿死亡的重要原因（死亡率5-20%）；晚发型感染则主要为血流感染导致的脑膜炎，经有效治疗后，仍有20-60%的患儿会出现严重的神经系统后遗症，包括智力发育迟缓、脑瘫及不可逆的视/听神经受损等，严重影响患儿的生存质量及预后，给家庭和社会带来了极大的负担。 死亡率5-20% 33
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《围产期GBS预防指南》 Prevention of Perinatal Group B Streptococcal Disease 为了防止早发性GBS疾病，解决所面临的挑战 ,2010年美国疾病预防控制中心（CDC）制定了《围产期GBS预防指南》 该指南已经获得以下认可： 美国妇产科学院 美国儿科学会 美国护士助产士协会 美国家庭医生协会 美国微生物学会 美国流行病学会 美国药理学会
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对所有孕妇于妊娠35～37 周进行GBS筛查，结果阳性者进行预防性治疗；
在妊娠37 周之前分娩； 羊膜破裂18小时； 分娩温度超过38.0° C 根据统计,这种方案会对26.7%的分娩者进行预防性治疗, 可以预防86 %的新生儿早发GBS 感染
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B群链球菌筛查 早期产道定植干预是控制GBS感染的有效措施 美国CDC:对35-37周孕妇进行GBS常规筛查，阳性者进行抗生素预防治疗。
抗生素：青霉素（一线）、克林霉素 国外对GBS的认识及研究已经较为深入，通过实践对比发现，对GBS进行常规筛检能有效的降低婴儿早期侵入性感染的发生率，因此1996年美国疾病控制中心（CDC）与其他机构共同制定了《围产期B族链球菌感染筛查及防治指南》，并于2002年和2010年进行了修改，提出应该对35-37孕周的孕妇进行阴道GBS的常规筛查，对于筛查阳性的患者则采取抗生素预防治疗，一线使用青霉素，对于青霉素过敏的患者则使用红霉素或克林霉素。这一方法的实施很大程度上减少了围产期B群链球菌感染的发生率和危害，发病率从90年代早期1.7/1000个新生儿降低到了近些年的 /1000个新生儿。目前，包括澳大利亚、新西兰、欧洲等多个国家已参照美国CDC指南，开展了晚孕期孕妇的GBS常规筛查，而中国在此方面几乎为空白。 更多信息参见： 36
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GBS的取样部位和方法 取样部位：阴道和直肠 阴道下1 / 肛门括约肌2~5cm
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Vaginal-rectal swab* Incubate in enrichment broth x hrs at 35-37⁰C Non-pigmented broth Pigmented broth Further tests (subculture or rapid tests) Subculture & incubate hrs at 35-37⁰C Identify GBS GBS+ GBS- Re-incubate overnight Report as GBS- Report as GBS+ No indicator color growth GBS indicator color growth observed DNA probe, latex agglutination, or nucleic acid amplification test Antibiotic susceptibility testing If PCN-allergic & at high risk for anaphylaxis CDC’S RECOMMENDATIONS FOR PRENATAL GBS CULTURES Here is the algorithm for prenatal GBS laboratory testing for 2010. I will discuss each step in more detail in the following slides
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GBS感染分娩期抗生素治疗方案 有无青霉素过敏
青霉素G，首次剂量500万单位（静脉注射）然后每4小时250〜300万单位，直至分娩或者氨苄西林，首次剂量2g（静脉注射），然后每4个小时1g，直到分娩 病人在接受青霉素或头孢菌素时有无出现下列任一症状？ 过敏症、血管性水肿、呼吸窘迫、荨麻疹 头孢唑啉，首次剂量2G，然后每8个小时1g，直到分娩 是否对红霉素和克林霉素敏感 万古霉素每12小时1g（静脉注射）直至分娩 克林霉素每8小时900mg（静脉注射）直至分娩
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小结 女性生殖道标本微生物培养主要检测各种临床综合征的病原，包括外阴阴道炎、细菌性阴道病、生殖器溃疡、尿道炎、宫颈炎、子宫内膜炎、输卵管炎和卵巢脓肿等 杜克雷嗜血杆菌、淋病奈瑟菌、阴道毛滴虫、梅毒螺旋体、沙眼衣原体等一般都是有临床意义 金黄色葡萄球菌、β溶血链球菌、肠杆菌科细菌和厌氧菌仅在某些临床条件下致病 标本来源、革兰染色（多形核中性粒细胞）、潜在病原较正常菌群的相对数量有助于判断哪些细菌需要进行鉴定和药敏 应避免对来自标本的所有细菌均进行分离、鉴定和药敏试验，避免浪费实验室资源和对患者造成过度治疗
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谢谢聆听
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