第三节 电泳技术 Electrophoresis

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1 第三节 电泳技术 Electrophoresis

2 技术起源 1937年，瑞典科学家Tiselius设计了世界上第一台电泳仪，建立了移界电泳法(Moving boundary electrophoresis)，并于1948年荣获诺贝尔奖。70年以来，电泳技术围绕制胶、电泳、染色三个技术环节，不断改进，以实现下列目标： 1、提高分辨率及灵敏度。 2、简化操作，缩短电泳时间。 3、扩大应用范围。 各类电泳技术已广泛应用于生命科学各个领域。 AWK Tiselius (1902—1971)

3 目录 1. 电泳技术的基本原理 2. 聚丙烯酰胺凝胶电泳原理 3. 醋酸纤维素薄膜电泳 4. 等电聚焦
5. SDS-PAGE测定蛋白质分子量 6. 双向凝胶电泳 7. 高效毛细管电泳(HPCE) 8. 电泳技术相关延伸应用

4 本节教学目的 1、掌握电泳技术的基本原理。 2、掌握SDS-PAGE测定蛋白质分子量的原理和技术。
3、学习等电聚焦电泳、双向凝胶电泳、毛细管电泳 原理及应用。 4、了解免疫印记技术等电泳相关延伸应用。

5 1.电泳技术的基本原理 电泳：带电粒子在电场中的定向移动。

6 1.电泳技术的基本原理 (1)、E = U/L (2)、F= q*E (3)、F’ = 6π*r*η*v = 6π*r*η*d/t
(4)、F = F’ (5)、q*E = 6π*r*η*d/t (6)、m = v/E = q*v*t/(6π*r*η*d)=q/(6π*r*η) (7)、mA/mB = k(qA/qB)*(rB/rA) U: 电压 L: 电极之间的距离 E: 电场强度 F: 电场对带电分子作用力 F’: 溶液对带电分子粘滞力 η: 溶液黏度系数 r: 带电分子半径 d: 带电分子移动距离 t: 带电分子移动时间 v: 带电分子泳动速度 m: 单位电场强度内带电分子迁移速度

7 1.电泳技术的基本原理 小结：影响泳动率u的因素 内因： 1.净电荷 2.质点大小 3.质点形状 外因： 1.E ( U/L)
2.缓冲液的pH (pH恒定) 3.离子强度[I] 最适: 4.电渗：液体对固体支持物的相对移动

8 1.电泳技术的基本原理 电泳类型 ⑴区带电泳 纸电泳、醋酸纤维素薄膜电泳、粉末电泳、细丝电泳、凝胶电泳。
凝胶电泳包括：琼脂糖凝胶、淀粉凝胶、硅胶凝胶、聚丙烯酰胺凝胶 聚丙烯酰胺凝胶电泳包括：垂直板、盘状、等电聚焦、梯度、免疫电泳 ⑵自由界面电泳 支持物为溶液，很少用。

9 2.聚丙烯酰胺凝胶电泳原理 聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺(acrylamide，简称Acr)和交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺(N,N-methylene-bisacylamide,简称Bis)在加速剂 N,N,N,N-四甲基乙二胺(N,N,N,N-tetram-ethyl ethylenedia mine，简称TEMED)和催化剂过硫酸铵(ammonium persulfate (NH4)2S2O3，简称AP)或核黄素(ribofavin即vita min B2,C17H2O6N4)的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶，以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis，简称PAGE)。

10 2.聚丙烯酰胺凝胶电泳原理 光聚合：核黄素为催化剂(阳光,日光)，制大孔胶。 化学聚合：制小孔胶。
引发剂：过硫酸铵(NH4)2S2O3 APS 加速剂：N,N,N’,N’-四甲基乙二胺 TEMED

11 2.聚丙烯酰胺凝胶电泳原理 反应方程式： NH N, N’-甲叉 （亚甲基） 双丙烯酰胺 聚丙烯酰胺 丙烯酰胺 CH2=CH—CONH2 +
—CH2—CH—[CH2—CH]x—CH2— CONH2 C=O CH2 NH O 丙烯酰胺 N, N’-甲叉 （亚甲基） 双丙烯酰胺 聚丙烯酰胺

12 2.聚丙烯酰胺凝胶电泳原理 三种物理效应 ⑴样品浓缩效应 ⑵分子筛效应 ⑶电荷效应

13 2.聚丙烯酰胺凝胶电泳原理 样品浓缩效应：由凝胶系统的不连续性产生。 ①凝胶孔径不连续性 ②缓冲液离子成份的不连续性 ③pH的不连续性

14 2.聚丙烯酰胺凝胶电泳原理 ①凝胶孔径不连续性 单体浓度 交联度 大孔胶:T=3% C=2.0% 小孔胶:T=7% C=2.5%

15 2.聚丙烯酰胺凝胶电泳原理 ①凝胶孔径不连续性 凝胶网孔大小: 聚合链长度:由Acr浓度决定 交联程度:由Acr与Bis相对比例
Bis的浓度低,孔径大,可在聚合前调节单体与Bis的浓度比 如: Acr Bis T(%) 小孔 g g % 大孔 g g %

16 2.聚丙烯酰胺凝胶电泳原理 凝胶浓度(T)的选择与被分离物质分子量密切相关。 分子量范围 适用的凝胶浓度/(%) 蛋 白 质
分子量范围 适用的凝胶浓度/(%) 蛋 白 质 < 1-4× 1-5×104-1× 1× >5× 核酸(RNA) < –20 104– 105-2×

17 2.聚丙烯酰胺凝胶电泳原理 ②缓冲液离子成份的不连续性 大孔胶 pH=6.7 先行离子：Cl-存在于凝胶层中任何pH值下
随后离子：Gly-存在于电极缓冲液中 pI=6.0 pKα1= pKα2=9.70 在pH=6.7时，只有少数解离为Gly-，多数为Gly+-。 Pr分子在pH6.7时以Pr-形式存在

18 2.聚丙烯酰胺凝胶电泳原理 ③pH的不连续性 pH 大孔(浓缩)胶 小孔(分离)胶 缓冲液

19 2.聚丙烯酰胺凝胶电泳原理 样品浓缩效应（不连续性） 不连续性可控制Gly的解离度，从而控制有效迁移率。
迁移率:Cl- > Pr- > Gly- (Pr被压成薄层) 在大孔胶中：要求Gly的有效迁移率低于所有Pr，经计算pH=6.7。 在小孔胶中：要求Gly超过所有Pr，Pr留在后面进行普通的电泳与分子筛分离分成多个区带。(此PH实测为9.5)

20 2.聚丙烯酰胺凝胶电泳原理 不连续缓冲体系 不连续凝胶孔径 不连续pH 不连续电位梯度 浓缩效应

21 2.聚丙烯酰胺凝胶电泳原理 不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳 Tris-Gly, pH 8.3 Tris-HCl, pH 6.8
+ Tris-Gly, pH 8.3 Tris-HCl, pH 6.8 Tris-HCl, pH 8.8 - Tris-Gly, pH 8.3 不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳

22 2.聚丙烯酰胺凝胶电泳原理 浓缩胶（大孔胶） 浓缩胶缓冲液pH6.8 Tris-HCl, 电极缓冲液pH8.3 Tris-Gly
解离度 ：Cl> 蛋> Gly mclcl>m蛋蛋>mGlyGly 凝胶中Cl－为快离子， Gly－为慢离子，蛋白质样品被夹在中间。 缓冲液 样品 浓缩胶 分离胶 SDS-PAGE过程有浓缩效应和分子筛效应

23 2.聚丙烯酰胺凝胶电泳原理 快离子 慢离子 蛋白质样品 浓缩效应示意图

24 2.聚丙烯酰胺凝胶电泳原理 浓 缩 效 应 样品进入浓缩胶有一个堆积浓缩效应(缓冲液pH8.3)
蛋白质从“－”极向“＋”极移动，从浓缩胶进入分离胶，速度变慢，堆积浓缩。 缓冲液 样品 浓缩胶 分离胶 浓 缩 效 应

25 2.聚丙烯酰胺凝胶电泳原理 浓 缩 效 应 样品进入浓缩胶有一个堆积浓缩效应(缓冲液pH8.3)
蛋白质从“－”极向“＋”极移动，从浓缩胶进入分离胶，速度变慢，堆积浓缩。 缓冲液 样品 浓缩胶 分离胶 浓 缩 效 应

26 2.聚丙烯酰胺凝胶电泳原理 浓 缩 效 应 样品进入浓缩胶有一个堆积浓缩效应(缓冲液pH8.3)
蛋白质从“－”极向“＋”极移动，从浓缩胶进入分离胶，速度变慢，堆积浓缩。 缓冲液 浓缩胶 样品 分离胶 浓 缩 效 应

27 2.聚丙烯酰胺凝胶电泳原理 蛋白质样品进入分离胶（小孔胶）后pH增大(pH 8.8 Tris-HC1)，Gly－解离度增大，不存在快、慢离子之分，蛋白质样品在均一电场强度和pH条件下泳动。 由于各种蛋白质分子量不同，因此质点的 有效迁移率不同，形成不同区带。 缓冲液 浓缩胶 分离胶 分 子 筛 效 应

28 2.聚丙烯酰胺凝胶电泳原理 蛋白质样品进入分离胶（小孔胶）后pH增大(pH 8.8 Tris-HC1)，Gly－解离度增大，不存在快、慢离子之分，蛋白质样品在均一电场强度和pH条件下泳动。 由于各种蛋白质分子量不同，因此质点的 有效迁移率不同，形成不同区带。 缓冲液 浓缩胶 分离胶 分 子 筛 效 应

29 2.聚丙烯酰胺凝胶电泳原理 电 荷 效 应 蛋白质样品进入分离胶后
缓冲液 浓缩胶 分离胶 蛋白质样品进入分离胶后 pH增大(pH 8.8)，Gly－解离度增大，不存在快、慢离子之分，蛋白质样品在均一电场强度和pH条件下泳动。 由于各种蛋白质pI不同，所载有效电荷不同，因此质点的 有效迁移率不同，形成不同区带。 电 荷 效 应

30 2.聚丙烯酰胺凝胶电泳原理

31 温馨提示 1、丙烯酰胺有神经毒性，勿接触皮肤； 2、制胶玻璃板要保持光滑洁净； 3、妥善安装好制胶板，避免液体渗漏；
4、加样孔及凝胶底部不能有气泡。

32 3.醋酸纤维素薄膜电泳

33 3.醋酸纤维素薄膜电泳 1、醋酸纤维素滤膜对过滤 物质吸附量低。 2、醋酸纤维素膜如 sartorius具有很高的流速 和热稳定性。

34 4.等电聚焦(Isoelectric focusing, IEF)
原理 Pr为两性电解质，不同Pr其aa的数量、种类及占比例不同，因此pI不同，pI范围窄且净电荷为零，因此依pI分离Pr。 EF是在凝胶中加两性载体电解质，通直流电后，可形成从阳极到阴极逐步增加的pH梯度(连续的,稳定的,线性的pH)。

35 4.等电聚焦(Isoelectric focusing, IEF)
原理 当Pr在电场中迁移到它的PI时，由于净电荷为零，不再移动。 如扩散，附近的凝胶会使其荷电阳、阴极会重新吸引它回到pI位置。因此Pr只能在pI位置被浓缩成窄、稳定的带。称这种浓缩效应为聚焦。 只要凝胶中的pH梯度范围足够窄。便可将pI相近的Pr分开，EF是电泳技术中分辨率最高的技术。

36 4.等电聚焦(Isoelectric focusing, IEF)
⑴载体两性电解质CA 分辨率0.01pH ⑵固相pH梯度(1975年) IPG 以具弱酸或弱碱性质的丙稀酰胺衍生物 CH2═CH─CO─NH─R R=─COOH R=─4级氨基 R为弱酸or弱碱,形成缓冲体系

37 4.等电聚焦(Isoelectric focusing, IEF)
体系分辨率达0.001pH pH梯度范围最窄可为0.01pH/cm CAIEF是两性分子,在凝胶聚合时形成两性分子在电场中,CA迁移到自己的pI而形成pH梯度。

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39 4.等电聚焦(Isoelectric focusing, IEF)

40 5. SDS-PAGE测定蛋白质分子量 原理 蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中电泳时，它的迁移率取决于它所带净电荷以及分子的大小和形状等因素。
1967年，Shapiro等人发现，如果在聚丙烯酰胺凝胶系统中加入阴离子去污剂十二烷基磺酸钠（sodium dodecyl sulfate，简称SDS），则蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于它的分子量，而与所带电荷和形状无关。

41 5. SDS-PAGE测定蛋白质分子量 原理 蛋白质Pr溶液中 加巯基乙醇 加SDS，打开氢键与疏水键 复合物 1.4g ： 1g
加入SDS为SO4-2改变了Pr的荷电性质。

42 5. SDS-PAGE测定蛋白质分子量

43 5. SDS-PAGE测定蛋白质分子量

44 5. SDS-PAGE测定蛋白质分子量 原理 各种SDS-Pr均带相同密度的负电荷，其荷电超过了原Pr，消除了不同Pr荷电差异。
加入SDS，改变了Pr的构象，SDS-Pr为长椭圆棒，各种短轴约为1.8nm。 长轴：Mr，均呈正比例，所以 常数 斜率 迁移率

45 5. SDS-PAGE测定蛋白质分子量 影响迁移率的因素 ⑴二硫键是否完全被还原； ⑵溶液中SDS的浓度； ⑶溶液的离子强度。

46 5. SDS-PAGE测定蛋白质分子量 电泳装置

47 图2 夹心垂直板电泳槽示意图 图3 凝胶模示意图 1. 样品槽模板 2. 长玻璃板 1. 导线接头 2. 下贮槽 3. 凹形橡胶框 4
图2 夹心垂直板电泳槽示意图 图3 凝胶模示意图 1.样品槽模板 2.长玻璃板 1.导线接头 2.下贮槽 3.凹形橡胶框 4.样品槽模板 5.固定螺丝 6.上贮槽 7.冷凝系统

48 6.双向凝胶电泳 方法 ⑴直径1mm毛细管，进行等电聚焦电泳。 ⑵取出胶条。 ⑶胶条放于 垂直板凝胶顶部，水平板凝胶一端
⑷进行SDS-PAGE电泳。 以Pr的pI与MW两种特征分离，分离效率高，可将数千个Pr分开。

49 6.双向凝胶电泳

50 7.高效毛细管电泳(HPCE)

51 7.高效毛细管电泳(HPCE) 原理 ⑴毛细管壁以玻璃.硅酸为主要成份 所以管壁带一定负电荷
⑵管壁吸附溶液的阳离子(含H2O的正极端)形成双电层 ⑶形成电渗:电场高压下,双电层水合阳离子引起流体(加毛细张力)整体向负极移动.

52 7.高效毛细管电泳(HPCE) 原理 ⑷样品中不同组份受到的作用力有差别： 阳离子与电场力与电渗流同向，最快；
阴离子受方向相反的两种力作用，电渗流力大于电场力，移向负极最慢。 不带电样品受电渗流作用，移向正极(无电场力作用)。 阴离子<中性分子<阳离子

53 7.高效毛细管电泳(HPCE) 毛细管电泳（Analytical Capillary Electrophoresis ACE）的特点
⑴可分离各种成份(带电与不带电)。 ⑵电渗成为有效驱动力(普通电泳中为破坏力)。 ⑶高速度分力能力：各种制品均可在3-30‘内高速分离(45’内，分离15种糖)。 ⑷高分辨力：分辩力大于106理论段/m.最小监测量：10-6M，如脱酰胺作用。

54 7.高效毛细管电泳(HPCE) 毛细管电泳（Analytical Capillary Electrophoresis ACE）的特点
⑸质量感度：应用激光诱发荧光的检测器，可检测aM水平（10-18，PM：10-12，fM：10-15）。 ⑹用样量：μL（实际上是nL）。 ⑺自动化程度：自动加样，自动交换缓冲液，自动分离，自动数据处理。

55 7.高效毛细管电泳(HPCE) 毛细管电泳（Analytical Capillary Electrophoresis ACE）的特点
⑻适用范围广：aa衍生物 肽,Pr 核酸,药物.病毒 水溶维生素 糖类衍生物 ⑼检测：紫外/可见光 荧光 电化学 激光 同位素

56 7.高效毛细管电泳(HPCE) 电泳仪器

57 8.电泳技术相关延伸应用 凝胶干燥技术 凝胶扫描技术借助薄层扫描仪对电泳图谱扫描，以迁移率为横坐标，以吸光度为纵坐标，将电泳条带转换成峰图。
凝胶成像技术通过图像采集和图像分析，利用计算机程序自动识别图中所有可能条带。 凝胶印渍转移技术Southern Blot，Northern Blot，Western Blot

58 8.电泳技术相关延伸应用 A:GIS暗箱 B:高分辨率数码相机 C:安全门锁 D:GIS暗箱控制面板 E:PC机控制 F:紫外或白光投射仪
G:GIS 1D分析软件 H:数码热升华图片打印机

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61 8.电泳技术相关应用 多色荧光。 DNA在6%聚丙烯酰胺凝胶中分析

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