兔肝DNA的提取与二苯胺显色法测定DNA含量 目的基因SNP位点的鉴定及其意义

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1 兔肝DNA的提取与二苯胺显色法测定DNA含量 目的基因SNP位点的鉴定及其意义
综合性设计性实验-5 生物基因组序列比对分析，分子进化 兔肝DNA的提取与二苯胺显色法测定DNA含量 目的基因SNP位点的鉴定及其意义

2 此实验共包括如下三个部分 第一部分：生物基因组序列比对分析，分子进化 第二部分：兔肝DNA的提取和测定
第三部分：目的基因SNP位点的鉴定及其意义

3 第一部分：生物基因组序列比对分析、分子进化
全基因组序列数据的积累,使得不同生物之间的进化关系可以从分子水平上进行研究。不同于以往单纯依赖于生物形态学特征,这种分析更加深刻更加本质。利用分子序列使得我们可以研究,从单细胞生物到植物、动物甚至人的进化关系。 比较基因组学(Comparative Genomics)是基于基因组图谱和测序基础上，对已知的基因和基因组结构进行比较，来了解基因的功能、表达机理和物种进化的学科。利用模式生物基因组与人类基因组之间编码顺序上和结构上的同源性，克隆人类疾病基因，揭示基因功能和疾病分子机制，阐明物种进化关系，及基因组的内在结构。目前从模式生物基因组研究中得出一些规律：模式生物基因组一般比较小，但编码基因的比例较高，重复顺序和非编码顺序较少；其GC%比较高；内含子和外显子的结构组织比较保守，剪切位点在多种生物中一致。

4 比较作图就是利用共同的遗传标记（主要是分子标记、基因的cDNA克隆以及基因组克隆）对相关物种进行物理或遗传作图，比较这些标记在不同物种基因组中的分布情况，提示染色体或染色体片段上的同线性（synteny）或共线性（collinearity），从而对不同物种的基因组结构及基因组进化历程进行精确分析。基因组比较作图的研究，不仅提示了同属甚至同科物种基因组间的同源性和差异性，对不同物种在起源、演化过程中的变化的研究具有巨大的启示作用 。 比较作图的研究意义在于：一、根据不同种的基因组基因及其排列顺序的高度保守特点绘制而成的比较图，可以研究和探明它们的进化线索。广泛的比较作图可为多个种所用，建立它们之间的联系框架或系统。

5 基因组比对软件 Mauve VISTA

6 分子进化 一个最基本的假设是地球上所有物种都有一个共同的祖先，从这个祖先开始以数状形式发展，通常称为生命之树（tree of life）。
分子进化研究的目的：通过序列同源性的比较，分析序列间的变化进而了解基因的进化以及生物系统发生的内在规律。 分子进化有两个主要研究对象，以全基因组序列为研究对象分析物种进化；以某基因在多个物种的同源序列为研究对象分析基因的进化

7 系统发生树性质： 理论上，一个DNA序列在物种形成或基因复制时，分裂成两个子序列，因此系统发育树一般是二歧的； 末端分支
如果是一棵有根树，则树根代表在进化历史上是最早的、并且与其它所有分类单元都有联系的分类单元，反映时间顺序； 如果找不到可以作为树根的单元，则系统发生树是无根树，反映距离； 从根节点出发到任何一个节点的路径指明进化时间或者进化距离。 末端物种 中间枝条 根 末端分支 节点

8 基因分子进化分析步骤 （1）以目的基因为种子序列，搜索其在其它物种中的同源序列

9 （2）将上述同源基因的核酸或蛋白序列作序列比对，Clustal X

10 （3）构建系统发生树：MEGA，PHYLIP，PAUP

11 （4）评价所建立的树，分析其生物学意义

12 第二部分：兔肝脱氧核糖核酸（DNA）的提取和测定
实验目的 学习从动物组织中提取DNA及其含量、纯度测定的原理和方法 掌握离心机及岛津UV-120的使用方法

13 实验原理 利用脱氧核糖核酸蛋白和核糖核酸在电解质中不同的溶解度使二者分离，在0.15M的氯化钠溶液中脱氧核糖核酸蛋白的溶解度最低。相反，核糖核蛋白能在0.15M氯化钠中溶解，因此可利用不同浓度的氯化钠溶液将核酸核蛋白、脱氧核糖核酸蛋白解离出来，而蛋白质变性沉淀，再用氯仿－异丙醇抽提，将蛋白质沉淀除去，而DNA则溶解。

14 实验操作 1. 弃上清留沉淀 兔肝 称取4 g 加 8ml 1X SSC 1X SSC洗 两次 取8ml匀浆液 离 心 匀浆、过滤
2.弃上清留沉淀 加至8ml 1X SSC 加至 8ml 0.15M NaCl-0.1M Na2EDTA 3.弃上清留沉淀 （脱氧核糖核蛋白） 實驗 P1

15 加约2倍 体积 95% 乙醇 沉淀 加 0.15M NaCl-0.1M Na2EDTA至4ml 搅拌10min 逐滴加入0.5ml 15% SDS 加1ml 5M NaCl 去塞！离心 加塞反复 倒置抽提 10min 吸取上清液 勿吸到中间层！ 等体积氯仿-异丙醇混合液 DNA析出 用玻棒挑出 挑取DNA至一离 心管(小烧杯)用10ml 0.01N NaOH溶解 重复 一次 轻搅

16 注意事项 尽可能避免DNA的断裂 1. 匀浆时应保持低温，且匀浆时间应短； 2. 实验中使用的吸取DNA水溶液的滴管口应粗短并成钝口。
整个实验过程应在低温条件下进行。 搅拌时动作要轻，反复倒置抽提，不可激烈振荡。

17 加入15% SDS时要慢，边搅边滴加（两人配合）。
SDS的温度不能太低，易凝固。吸过SDS的吸管要及时清洗。 加入CHCl3/IAA液离心后，分为三层，由上到下为：无机相-蛋白相-有机相。DNA溶解在无机相中，吸取无机相时动作要轻，不要吸到蛋白相。 CHCl3/IAA会溶解有机玻璃，用完后不能竖直放置在试管架上，必须冲洗干净。

18 离心机的使用 打开电源开关； 平衡放置离心管；盖上盖子。 调节时间旋钮至10min； 缓慢调节速度旋钮至9档，每5-10s上升1档；
离心完毕后机器自动停止，待完全停止后，打开盖子取出离心管。 离心管必须平衡后，才能启动离心机； 离心机的盖子必须盖紧； 离心过程中不要用重物撞击离心机； 要等离心机完全停止转动后再打开盖子。

19 二苯胺显色法测定DNA含量 实验原理 DNA的α-脱氧核糖在酸性条件下转变成ω-羟基-r酮基戊醛，与二苯胺共热后形成蓝色化合物，该化合物在595nm处最大吸收。 每ml含20－400µg范围内光密度与DNA的浓度成正比。反应液中加入少量乙醛，可提高反应的灵敏度。

20 实验操作 取8支试管，按实验指导的表格加入试剂。 加毕置沸水浴10分钟，取出冷却；以0号管（空白管）调零点，于595nm波长比色。
以光密度为纵坐标，DNA含量（µg/ml）为横坐标，绘制标准曲线. 将实验中所得到的兔肝DNA溶液作为待测样品，取两只试管，分别标“U”和“B”，按表加入试剂。 混匀，置沸水中10min, 取出冷却。 在595nm处，以B管调零，测得待测液的光密度值，从标准曲线上查出相当于该光密度值DNA的含量。

21 核酸紫外吸收光谱的测定 核酸在220-320nm处呈特征性吸收，在260nm处有最大吸收，测A260/A280可得知核酸的大致纯度。
A260/A ≈ 表示DNA纯 > RNA含量高 < 蛋白含量高

22 岛津UV-120分光光度计 双波长分光光度计，该种机采用两个光源，可在可见光和紫外区对物质进行分析，钨丝灯发出光的适宜范围在360－1000nm，氘灯发出光的适宜范围在150－400nm。 通过两种光源的切换，可以在两种波长范围内使用。 使用石英杯作为比色杯。

23 岛津UV-120使用方法 打开电源，指示灯亮，调至UV，打开样品室盖 打开氘灯（向下按至Heat几秒后扳至ON） 预热10min
调节波长、灵敏度 旋扭调至“0-100%T”，放入空白管与样品，调0% T 盖上盖子，旋扭调至“ABS 0-2”，调0% A 拉出样品，读数。开盖，记录。

24 实验操作 以0.01N NaOH 为空白管，在260nm和280nm波长处测定样品液的吸光度，求出样品液的A260/A280比值和DNA浓度。

25 第三部分：目的基因SNP位点的鉴定及其意义
SNP(single nucleotide polymophism) 即单核苷酸多态，是指群体中变异频率大于1 %的单个核苷酸改变而导致的核酸序列多态，包括置换、颠换、缺失和插入。 一般来说，一个 SNP 位点只有两种等位基因，因此又叫双等位基因。SNP在人基因组中的发生频率比较高，大约平均每1000个碱基中就有一个多态位点。 …C C A T T G A C... …G G T A A C T G... …C C G T T G A C... …G G C A A C T G...

26 SNP对基因功能影响 根据在基因中的位置，SNP 可分为基因编码区SNP(coding SNP, cSNP)、基因内含子区SNP和基因调控区SNP(regulatory SNP, rSNP)。其中cSNP根据是否改变编码的氨基酸又可分为同义cSNP (synonymous cSNP)和非同义cSNP (non-synonymous cSNP)。 非同义cSNP：，蛋白激酶PRKCH基因内的一个非同义cSNP(1425G/A)，等位位点从G到A 的改变可导致激酶的活力增强，进而激活其信号通路，使患脑梗塞的风险增加。 同义cSNP：多向性耐药基因1(MDR1)第3435 位的一个同义SNP(3435C/T)可改变MDR1 基因产物的功能。这种机制不是通过改变mRNA 及蛋白的产量水平，而是通过改变mRNA 的构象、蛋白的折叠及细胞定位，进而影响基因功能的发挥。 内含子区SNP：葡萄糖激酶调节蛋白(GCKR)基因第16 号内含子中的一个SNP(rs780094, T/C)，相比C等位位点，含T等位位点时，个体表现为葡萄糖水平较低、胰岛素耐受较少，患2型糖尿病的风险较低。 调控区rSNP：IFN-γ基因启动子区含一个rSNP(-764G/C)，相比C 等位位点，含G 等位位点时，IFN-g 基因启动子与转录因子的结合增强，启动子活力提高到2~3倍。

27 目的基因SNP的查询

28 输入基因名称与物种名称， 如 NGAL,homo

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32 实验设计 请介绍除了NCBI以外的SNP数据库及其使用；
查询人Fascin，Ezrin，NGAL receptor等基因的SNP位点，列出它们编码区的SNP，讨论这些SNP对蛋白结构与功能的影响； 请列举检测SNP的实验技术，并评价其优缺点； 请设计一个实验检测一个基因的SNP，并分析这些SNP与某种疾病的关系； 若要判断SNP与疾病有明显关系，需要什么条件。