移植免疫及相关问题探讨 瑞金医院检验科 顾志冬.

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1 移植免疫及相关问题探讨 瑞金医院检验科 顾志冬

2 免疫排斥与器官移植相关检验技术 移植(transplantation):指用自体或异体的正常细胞、组织或器官置换病变的或功能缺损的细胞、组织与器官，以维持和重建机体生理功能的治疗方法。 供者（donor） 受者（recipient） 移植物（graft） 移植排斥反应（graft rejection）

3 目的：救治末期器官衰竭、恶性血液病、 肿瘤以及某些遗传病。 要求：尽可能让移植物能在受体体内生存 或暂存常时间。 困惑：排斥反应、继发感染。 策略“immunotolerance”（免疫耐受）， 监测和预防。

4 免疫排斥（immune rejection）：指器官、组织或细胞移植后，受体发生免疫应答，引起针对移植物的免疫损伤而使其丧失功能的一个过程。
表现：hyperacute rejection acute rejection chronic rejection

5 移植类型： 1、autologous transplantation自身移植 2、syngeneic transplantation同系移植 3、allogeneic transplantation同种异体、 异基因移植★ 4、xenogeneic transplantation异种移植 根据移植物所植部位—原位～ 　异位～

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7 主要内容 一、免疫排斥反应发生的机制 二、移植排斥反应的类型 三、移植中的组织配型 四、移植排斥的免疫学防治 五、干细胞移植
六、移植排斥的特殊免疫学问题 七、排斥反应的免疫学检验 八、移植后药物浓度的检测

8 一、免疫排斥反应发生的机制 （一）移植抗原（transplantation antigen） 1、主要组织相容性抗原 又人类白细胞抗原
（major histo compatibility antigen，MHA） 又人类白细胞抗原 （human leukocyte antigen，HLA） 2、次要组织相容性抗原 （minor histo compatibility antigen，mHA） 3、其他同种异型抗原 （血型、不同组织特异性抗原）

9 1、主要组织相容性抗原（MHA）：一组存在于各种脊椎动物某对染色体特定区域的基因群，其编码的基因产物分布于各种有核细胞的表面，为重要的细胞膜抗原，也称之主要组织相容性复合体（MHC）。
人和脊椎动物都有各自独特的MHA。除小鼠 和大鼠有专门命名外，其他种属的MHA均称白细胞抗原（leukocyte antigen，LA）。 （Human leukocyte antigen，HLA）

10 HLA：位于人类的第6对染色体的短臂上， 由400万个碱基组成，分Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ类（复杂）。 例—— HLA Ⅰ类基因：HLA-A,-B,-C和-E～-H,-X; HLA Ⅱ类基因：HLA-DP,-DQ,-DR和-DN ～-DO HLA Ⅲ类基因：位于HLA-Ⅰ和Ⅱ的之间。 关于HLA Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ类分子的结构（略）。 关于HLA分型、应用与鉴定（后叙）。

11 （二）T细胞识别同种异型抗原的机制 直接识别 间接识别 同种异型抗原的直接识别和间接识别

12 直接识别（direct recognition）：指受者T细胞直接识别供者抗原递呈细胞表面的MHC分子等。（急性、反应强）
间接识别（ indirect recognition ）：指受者T细胞识别经过受者抗原递呈细胞加工处理的来源供者MHC分子的肽。（慢性、弱） direct recognition对环孢素敏感 indirect recognition对环孢素不敏感

13 （三）移植排斥反应的效应机制 1、超急性排斥反应： 时间：几分、几时～48小时 发生机制：预存于受体的抗移植物抗体随血
流进入移植物，通过与血管内皮 细胞结合，激发一系列免疫损伤 应答。 过程：补体活化- 血小板黏附聚集- 凝血系统 活化- 血栓形成- 缺血性坏死～ 血型不符、多次妊娠、反复输血、移植过～

14 2、急性排斥反应： 时间：数周～数月内 机制：①残留于供体移植物中的APC对受体的 免疫系统提供最初的抗原性刺激，激 活免疫应答～（direct path） ②通过受体的APC对移植物抗原的识别 后，再刺激并激活免疫应答反应～ （indirect path） 分类：急性体液排斥反应/急性细胞排斥反应

15 1）急性体液排斥反应： （急性脉管排斥反应），主要由抗内皮细胞表面HLA分子的抗体所介导，不引起血栓，出现移植组织和器官的血管炎。对免疫移植剂治疗无效，被迫切除移植物。 2）急性细胞排斥反应： （加速性细胞排斥反应），发生此类反应患者的血液中，可以有抗供者的抗体，但不一定引发急性脉管排斥反应，却以移植组织或器官实质性损害、坏死为主，伴淋巴细胞侵润。（CD8+CTL的细胞毒作用等）

16 3、慢性排斥反应： 时间：术后数月～数年 机制：与免疫相关— 系急排发作致移植物退 行性变，由迟发超敏反 应介导的免疫炎症。 非免疫相关— 局部缺血、微生物感染

17 二、移植排斥反应的类型 HVGR（host versus graft reaction）
GVHR（graft versus host reaction） HVGR—指宿主对移植物攻击，排斥～ GVHR—指移植物中的过路T细胞对宿主攻击，排斥～ 临床上HVGR多见～。

18 HVGR： （一）超急性排斥反应（＜48小时） 受者体内预存针对移植物抗体～ （二）急性排斥反应（几天～2周）
CD4+Th1介导的超敏反应，CD8+CTL毒性 受体产生抗移植物抗体～；NK、MΦ激活 （三）慢性排斥反应（数周、月、年） 未明了，与上述免疫学机制有关；有非特异性免疫学机制参与（感染、并发症等）

19 GVHR（ GVHD） 发生的前提： ①受、供者HLA型不匹配，②移植物中存在足够量的免疫细胞（成熟T），③受者免疫无能或极低。
移植物抗宿主反应导致移植物抗宿主病，临床表现为急性/慢性，难以逆转死亡率高 T细胞是介导GVHR的主要效应细胞，去除骨髓中成熟T细胞有效预防GVHR的发生。

20 三、移植中的组织配型 （一）选择组织相匹配的供者 1、一般情况（供物状态、全身情况、年龄） 2、ABO血型相容（拟输血）
3、HLA相容性（受、供者HLA等位基因相合的数目越多越好） （二）HLA相容程度测试 1、血清学分型 2、细胞学分型 3、基因分型

21 1、血清学分型： 原理—利用各种已知的HLA标准血清型， 与检测细胞反应，添加补体后观察 细胞反应（CDC）～
（micro-complement dependent cytotoxicity） 技术要点—分离淋巴细胞，与标准抗血清 反应，添加补体，死细胞染色 记数、判断 评价—较理想，标准抗血清难～

22 2、细胞学分型—采用淋巴细胞混合培养（MLC），分双向/单向。
养，彼此作用，观察细胞形态 与细胞增殖，互不影响示受、 供体间HLA型相匹配，否则～ 技术要点—分离计数彼此淋巴细胞，共孵 育，染色计数转化细胞～ 评价—用于移植前的交叉配合试验，但不 能判定HLA-D型～

23 单向MLC—用已处理的标准型细胞与测试 细胞共孵育，观察测试细胞的 反应。 标准型细胞为只表达LD抗原的细胞，经丝裂 霉素C或Ｘ线处理失去增殖能力，作为刺激细 胞，与测试细胞孵育，观察测试细胞的增殖 反应，称纯合子细胞分型试验（HTC）。测 试细胞无增殖反应示彼此相同，又称阴性分 型试验。

24 当标准型细胞为只能对单倍型细胞具有识别 而增殖的现处于静止状态的淋巴细胞，经预 处理后成为致敏淋巴细胞（PL），作为反应 细胞，与测试细胞孵育时，经测试细胞的刺 激使PL转化、增殖，又称其为阳性分型试验 （ PLT）。 HTC/ PLT—均为单向MLC，技术要点类同双向～，但有许多预处理等～。 评价—实际但繁琐、技术要求高～

25 3、基因分型 ①限制性片段长度多态性（RFLP）分型 ②聚合酶链反应-序列特异性寡核苷酸探针～ （PCR-SSOP） ③PCR-序列特异性引物（PCR-SSP）分型 ④PCR-单链构象多态性（PCR-SSCP）分型 ⑤PCR指纹图谱技术 ⑥其他

26 ①限制性片段长度多态性（RFLP）分型：
利用不同个体的HLA相应碱基序列不同， 其内源性酶切位点不同，经同一组内切酶的 酶切反应后，出现酶切片段的个数、长短不 一（酶切图谱）。—— 与已知型的比对、分 析—— 用以定型。

27 ②聚合酶链反应-序列特异性寡核苷酸探针～
（PCR-SSOP）： 将待检细胞HLA基因片段经PCR扩增、产 物转移至尼龙膜上，再与核素标记的特异性 寡核苷酸探针进行杂交，—— 结合完好说明 其基因序列相似（互补）。

28 ③PCR-序列特异性引物（PCR-SSP）分型：
先设计特异性引物（SSP），因为此SSP只能 和相应的等位基因特异性片段的碱基序列互 补结合～ ④PCR-单链构象多态性（PCR-SSCP）分型： 相同长度的单链DNA，其碱基顺序不同即便只 有单个碱基不同，经不变性的中性聚丙烯胺 凝胶电泳后，可反映不同的空间构象（泳动 速度、迁移率）。

29 ⑤PCR指纹图谱技术： DNA指纹图是指，由于不同个体的DNA具有不 同的分子构象，其在非变性聚丙烯胺凝胶电 泳中呈现的特异性区带图谱。 操作步骤是，先分别得到供者/受者的DNA指 纹图；然后将得到供者和受者的混合DNA指纹 图，并作一致性比较分析～

30 （三）交叉配型试验 目的：检测受者体内是否存在抗供者的特异性抗体以及受者对供者HLA抗原的相容程度。 技术要点：供者淋巴细胞+受者血清
（混合）供者淋巴细胞+受者淋巴细胞 等等 方法：1、微量细胞毒试验，2、流式细胞 术，3、混合培养，4、CML～

31 四、移植排斥的免疫学防治 移植排斥反应是根据临床表现、移植物功能状态、实验室多种相关检测结果的综合性判断的。
移植排斥反应是移植失败的主因；是移植免疫致力克服的关键难题。 关注点（一）排斥反应的监测 （二）排斥反应的防治

32 （一）排斥反应的监测 1、细胞免疫学监测①T淋巴细胞数量、功能以及亚群比例等，②杀细胞活性（CTL和NK）。
2、细胞因子监测：Th1型/ Th2型 Th1型包括IL-2、TNF-a、IFN-r等 Th2型包括IL-4、IL-10等 3、抗HLA抗体检测 4、蛋白、酶类、补体检测

33 3、抗HLA抗体检测： 原理：与异体排斥反应有关的体液、细胞免疫效应主要是针对HLA抗原的～，移植前所检测的包括面不够（其他抗体/群体反应性抗体(PRA)？ 群体反应性抗体(PRA)： 是指器官移植受者体内的抗HLA（特异+其他），因为测得血清中PRA的水平更有助于移植时受者对移植物的敏感程度。 移植术前后的PRA高低与术后急性排斥反应明显有关。

34 （二）排斥反应的防治 1、HLA配型（组织配型） 2、免疫抑制剂 3、移植耐受的诱导 4、移植物等的预处理

35 1、HLA配型— 越接近，成功率越高。 HLA配型应包括对HLA-Ⅰ类分子和其Ⅱ类分子的配型。尤其Ⅱ类分子的匹配与否，更关系到移植物能否长期存活问题。 HLA的配型包括HLA交叉配型、预存抗体的检测。 交叉配型包括淋巴细胞间、T细胞淋巴细胞毒性间、 B细胞淋巴细胞毒性间、流式细胞法、自身等。

36 2、免疫抑制剂 　 1）药物: 皮质类固醇 细胞增殖抑制剂（霉酚酸酯；MMF） 抑制T细胞活化（环孢素；CsA） （普乐可复；FK605） 2）抗体： 抗淋巴细胞、抗胸腺细胞、抗CD3等 3）输血： 与活化Ts细胞、产生封闭抗体等

37 3、移植耐受的诱导： 1）照射： X线照射（全淋巴照射-细胞破坏） 紫外线照射（灭活传递细胞功能，活化 Ts） 2）药物： 环磷酰胺、环孢霉素A等，诱导免疫耐 受可能与诱导Ts细胞增生有关。 3）抗体： 抗淋巴细胞血清、抗T细胞表面分子抗 体，使得T细胞等无能～

38 4、移植物等的预处理 1）移植物的预处理： 不同组织器官的移植，其移植物的处理不尽相同（外科修整、动脉灌洗）。 动脉灌洗，清除残留于待移植器官内的血液及细胞成分，尤其是免疫细胞（过客细胞），以防止过客细胞导致的GVHR。 用灌洗液前例腺素E1、硫酸镁、Collins液；或添加抗体～ 2）受体的准备（略）

39 五、干细胞移植 干细胞指人体中尚未发育的原始细胞，具有“树干”和“根源”的双重意义。 干细胞的定向分化

40 干细胞的发育受多种内在机制和微环境因素的影响。体外经一定条件可使其定向分化—细胞、组织、器官等。
干细胞种类：胚胎～指受精卵分裂发育成 囊胚时的内层细胞团（全能 性）。 成体～指成年动物中某些具 再生、修复能力的干细胞。

41 干细胞移植的临床应用： 　1、作为种子细胞，用于细胞治疗或组织细胞替代治疗。 　2、研究胚胎发育的调控机制 　3、作为疾病基因治疗的理想载体 　4、用于药物筛选和新药开发 　5、催生了细胞性心肌成形术

42 六、移植排斥的特殊免疫学问题 指跨物种间的移植（异种移植），解决供体器官的同时，强烈的排斥反应～ （一）异种间移植的排斥反应
　（一）异种间移植的排斥反应 　 1、特性：①、②、③、④、⑤ 　 2、类型（附图） 　 3、预防： ① 脾切除， ② 阻断补体活 性， ③ 吸附除去天然抗体 （二）骨髓移植的排斥反应

43 （一）异种间移植的排斥反应 1、特性：①、细胞表面“异物”更多～ ②、急性血管性排斥反应～ ③、加速性细胞排斥反应～
④、受者体内本存抗体，可促进 ADCC的发生与发展 ⑤、异种间的免疫障碍大于同种 2、类型（附图）

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45 协调性(concordant):指属异种，但种属比较近的异种移植排斥；非协调性(discordant):指异种移植排斥发生在种系间较远的～。
根据参与反应发生的的机制不同， 协调性—容易型/困难型 非协调性—抗体介导型/补体介导型 协调性与非协调性区别：前者为诱导型抗体 后者为天然型抗体

46 3、预防： 　① 脾切除， 　　 ② 阻断补体活性， 　　 ③ 吸附除去天然抗体

47 （二）骨髓移植的排斥反应 同种异基因（异体）骨髓移植用于治疗白血病、再障等，目前面临两大主要问题： 1、白血病的复发
　1、白血病的复发 　2、移植物抗宿主反应（GVHR） GVHR定义（略） GVHR发生原因（略） GVHR发生机制（初）： ①CD4+Th1/Th2 ②CD8+Tc1/Tc2 ③NK、单核、粒细胞等 慢性GVHR被视为一种自身免疫病。

48 七、排斥反应的免疫学检验 （一）体液免疫水平的检测
检测指标—ABO血型、其他血型、抗HLA抗体及供者组织细胞抗体、血管内皮、细胞抗体、冷凝集素抗体等。 测定方法（略）

49 　（二）细胞免疫水平检测 检测指标—参与细胞免疫有关的细胞数量、 功能和产生细胞因子水平。 检测手段—外周血T细胞及其亚类的计数 T细胞转化试验（4h） NK细胞活性测定 血清细胞因子的测定 黏附分子及其配体的检测

50 （三）补体水平的检测 检测指标—补体成分（C1q）、其裂解产物 （C3a）及总补体活性（CH50） 检测方法（略） （四）急性时相反应物质的检测 检测指标—C反应蛋白、TNF-a、IL-1、-6

51 八、移植后药物浓度的检测 为什么要进行药物浓度监测 如何进行药物浓度监测 1）药物浓度监测的临床指征 2）药物浓度监测的目的
3）药物监测的种类与方法 4）药物浓度监测的要点

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54 治疗药物监测的临床意义 一．治疗药物检测的概念
治疗药物监测是指临床生化实验室通过理化方法测定病人体液中药物浓度，对病人施行个体化的治疗方案以保证较好的治疗效果和较高的安全性的一种措施。

55 药物浓度监测的缺点 费用昂贵 影响因素复杂

56 需进行监测的常见药物 呋塞米（速尿） 利尿药 环孢素、FK506、MPA、雷帕霉素 免疫抑制剂 甲氯蝶呤等 抗恶性肿瘤药
庆大霉素、链霉素、卡那霉素、丁胺卡那霉素、氯霉素等 抗生素 阿司匹林、对乙酰氨基酚 解热镇痛药 碳酸锂 抗躁狂症药 丙咪嗪、阿米替林、去甲替林等 抗抑郁药 氨茶碱 平喘药 普萘洛尔、美托洛尔、阿替洛尔 β受体阻断剂 苯妥因铵、苯巴比妥、乙琥胺、卡马西平、丙戊酸钠 抗癫痫药 利多卡因、普鲁卡因胺、奎尼丁、乙胺碘呋酮、因卡胺、异丙吡胺等 抗心律失常药 地高辛、洋地黄毒苷 强心甙 药　　　品 分 类

57 移植和免疫抑制剂的应用 1596年，意大利外科医生成功进行最早一次成功的自体组织移植. 19世纪初，尝试异体皮肤移植,但因排斥而失败。
1940年，Medewar证实了同种异体移植排斥是一种免疫现象. 1954年，美国医生Murray在单卵双生姐妹间进行肾移植获得成功。 1962年，应用HLA分型技术选择合适的供体，第一次用无亲缘关系的供体肾进行异体移植，获得成功。 80年代初，由于环孢素A等应用，明显提高了器官移植的成功率，器官移植已广泛应用于临床。

58 免疫抑制剂的发展 1960年前，硫唑嘌呤 1963年， 去氢氢化可的松 1968年， 抗胸腺细胞球蛋白 1978年， CSA
1963年，　去氢氢化可的松 1968年，　抗胸腺细胞球蛋白 1978年，　CSA 1992年，　FK506 1999年，　重组抗CD3阳性细胞单抗 2002年，　雷帕霉素 2004年，　依罗莫司

59 免疫抑制剂的发展 其它有发展前景的药物 康乐霉素C 布列奎钠（BQR） 来氟米特和同类物（MNA） CTLA41g

60 药物监测的种类与方法 方法（常见）： 荧光偏振免疫分析（ FPIA ） 微粒子荧光免疫分析（MEIA） ＥＬＩＳＡ

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62 1、竞争法原理,检测抗原…….. 2、与荧光标记抗原竞争结合抗体…………….. 3、大小分子的不同旋转速度改变偏振光方向.. 4、偏振光的改变与被检测药物 浓度有关……..

63 微粒子荧光免疫分析法(MEIA)原理

64 ELISA原理：

65 MPA – 全球质控 xxx

66 环孢霉素 – 作用机制 抑制T细胞活化…………………… 由肝内 Cyt P-450进行代谢……….
> 25 已知的代谢产物……………. 代谢产物大部分无活性…

67 CsA的检测: 在临床中不太可能 必须要12 血液样本 –不太实际 只对诺华的新山地明有效(吸收图!!) 需要注意有吸收慢的病人
测量钙调蛋白（Calcineurin）的活动 在临床中不太可能 测量曲线下面积（AUC） 必须要12 血液样本 –不太实际 测量C2 (or C3 or C4)作为AUC的指标 只对诺华的新山地明有效(吸收图!!) 需要注意有吸收慢的病人 需要保证时间准确 (2h +/- 10 min) 测量C0 值 (谷值) 最常用 对于所有环孢霉素都容易操作

68 患者对新山地明的吸收情况 峰值基本上在服药后1-2小时之间，但也有少部分在3~4小时

69 他克莫司(FK506) 1994 获FDA批准 从土壤真菌提取的一种大环内酯类抗生素 商品名: 普乐可复® (藤泽)
全球销售额 ~ $ 4亿 /年 对T细胞有选择性的抑制作用 主要由肝内 Cyt P-450进行代谢 8 种特异的代谢产物 只有 MII代谢物有100%的活性 代谢物可以在循环系统中快速除去

70 霉酚酸 （ＭＰＡ） 1995年获美国FDA批准 是从青霉素菌中获得
商品名:骁悉® (Roche), Myfortic® (Novartis) 全球销售 ~ $ 1 billion annually 可以检测血浆浓度 - 谷值 - 简单 AUC(3点法) - 游离 MPA 只有一种商业的免疫检测方法

71 小 结 按照“免疫抑制剂使用指导意见”推荐 ——检测采用全血（CSA、FK506、RAPA） ——选择更特异的方法
小 结 按照“免疫抑制剂使用指导意见”推荐 ——检测采用全血（CSA、FK506、RAPA） ——选择更特异的方法 ——对某一检测方法的理解和掌握比方法的 选择更重要 —— 方法更替时应有完备的方法学考评 ——总是在同一条件下采血（谷值、峰值、空腹） ——应参加室间质评

72 小 结 —— TAT时间的控制 ——发展新方法的必要性 　　　大型实验室应加强HPLC-MS/MS的研究和应用，以切实解决监测费用昂贵问题

73 Thank You !!