动物生物化学实验 动物生理生化教研室 主讲人：钟 凯.

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1 动物生物化学实验 动物生理生化教研室 主讲人：钟 凯

2 欢迎同学们进入生化世界 !

3 课程安排 本实验课程共20学时，进行以下7个实验： ⑴实验基本知识与操作 4学时 ⑵无蛋白血滤液的制备 2学时
⑴实验基本知识与操作 学时 ⑵无蛋白血滤液的制备 学时 ⑶唾液淀粉酶活性的观察 学时 ⑷血清蛋白质醋酸纤维薄膜电泳 2学时 ⑸蛋白质含量的测定 学时 ⑹动物组织中提取DNA 学时 ⑺紫外分光光度法测定DNA的含量 2学时

4 实验一 实验基本知识与操作

5 目录 量器的认识和使用 常用玻璃仪器的洗涤与干燥 思考题

6 量器的认识和使用 一、移液管的使用 移液管是一种量出式仪器，只用来测量它所放出溶液的体积。它是一根中间有一膨大部分的细长玻璃管。其下端为尖嘴状，上端管颈处刻有一条标线，是所移取的准确体积的标志。常用的移液管有5，10，25，和50mL等规格。通常又把具有刻度的直形玻璃管称为吸量管。常用的吸量管有1，2，5，和10mL等规格。移液管和吸量管所移取的体积通常可准确到0.01mL。

7 量器的认识和使用 移液管的使用方法 移取溶液时，用右手的大拇指和小指捏着移液管颈的上方，将其末端插入溶液中，左手拿洗耳球，先把球中空气压出，再将球的尖嘴接在移液管上口，慢慢松开压扁的洗耳球使溶液吸入管内。当液面升高到刻线以上时，移去洗耳球，立即用右手食指堵住上口。将移液管提出液面，使其保持垂直，同时末端靠在容器的内壁上，为此可使容器略倾斜。然后略为放松食指，并轻轻捻动管身，使液面缓慢下降，当溶液的弯月面下沿恰与刻线相切时，立即用食指压紧上口，使溶液不再流出。将移液管取出并插入承接容器中。为保持其垂直并使末端靠在容器内壁，可使承接容器略倾斜。松开食指，让管内溶液自然地全部沿容器壁流下。全部溶液流完后需等15s后再拿出移液管，以便使附着在管壁的部分溶液得以流出。如果移液管未标明“吹”字，则残留在管尖末端内的溶液不可吹出，因为移液管所标定的量出容积中并未包括这部分残留溶液。

8 量器的认识和使用 移液管的洗涤 使用移液管前，应先用铬酸洗液润洗，以除去管内壁的油污。然后用自来水冲洗残留的洗液，再用蒸馏水洗净。洗净后的移液管内壁应不挂水珠。移取溶液前，应先用滤纸将移液管末端内外的水吸干，然后用欲移取的溶液涮洗管壁2至3次，以确保所移取溶液的浓度不变。

9 量器的认识和使用 二、微量移液器的使用 随着生物技术的发展，微量移液器已成为生物化学实验中的重要工具。这类移液器有准确、可连续操作和方便等特点。其结构如图。

10 量器的认识和使用 微量移液器的操作方法：调节体积选取钮至所需值，套上吸头，旋紧。垂直持握移液器，用大拇指按下液体吸放钮至第1档，将吸头插入待吸溶液，轻轻松开大拇指使吸入钮回复原位。将移液器移入准备接收液体的容器，用大拇指再次按下吸放钮，至第1档后继续至第2档以排空液体。

11 量器的认识和使用 微量移液器的使用注意事项 ⑴吸取液体时，只推至第1档，释放液体时，推至第1档后停1～2秒后推至第2档。
⑵使用完之后，一定要把移液器调回最大量程，以免压缩弹簧导致弹簧不能回复。 ⑶移液器必须卸掉枪头后才能放到移液器架上。 返回目录

12 常用玻璃仪器的洗涤与干燥 1.初用玻璃仪器的清洗
新购买的玻璃仪器表面常附着有碱性物质，可先用洗涤灵稀释液，肥皂水或去污粉等洗刷，再用自来水洗净，然后浸泡在1%-2%盐酸溶液中过夜，再用自来水冲洗，最后用蒸馏水冲洗3次，80℃烤干备用。

13 常用玻璃仪器的洗涤与干燥 2.使用过的玻璃仪器的清洗 (1)一般玻璃仪器 如试管，烧杯，锥形瓶等，先用自来水洗刷去净污物，再用毛刷沾取洗衣粉，洗涤灵稀释液或去污粉刷洗器皿内外壁，自来水多次冲洗去除洗涤剂，并洗至容器内壁不挂水珠，最后用蒸馏水洗3次，烤干或倒置控干备用。 (2)量器 如吸量管，量瓶等，使用后立即用自来水冲洗，直至不挂水珠，再用蒸馏水冲洗3次，风干备用。若冲洗后的器皿仍挂水珠，则将其晾干后，泡在铬酸洗液中4-6小时，再用自来水冲洗，最后用蒸馏水洗3次控干。 返回目录

14 思考题 ⑴移液器使用完之后为什么要调回最大量程？ ⑵移液器释放液体时应注意什么？

15 实验二 无蛋白血滤液的制备

16 目录 实验目的 实验原理 实验试剂和仪器 实验步骤 实验结果 注意事项 思考题

17 实验目的 分析血液中许多成分时，常需除去蛋白质，制成无蛋白血滤液。如血液中的非蛋白氮，尿酸，肌酸等测定皆需先把血液制成无蛋白血滤液后，再进行分析测定。蛋白质沉淀剂如钨酸，三氯醋酸或氢氧化锌皆可用于制备无蛋白血滤液，可根据不同的需要而加以选择。 返回目录

18 实验原理 无蛋白血滤液制备的基本原理是以蛋白质沉淀剂沉淀蛋白，用过滤法或离心法除去沉淀的蛋白。我们今天的实验采用的是钨酸法。
原理： 钨酸钠与硫酸混合，生成钨酸： Na2WO4 + H2SO4 → H2WO4 十Na2SO4 血液中蛋白质在pH 值小于等电点的溶液中可被钨酸沉淀。沉淀液过滤或离心，上清液即为无色而透明、pH 约等于6 的无蛋白血滤液。 返回目录

19 实验试剂和仪器 试剂： ⑴10 ％钨酸钠溶液 ⑵0.333mol/L 硫酸溶液 仪器： 移液管、锥形瓶和定性滤纸等。 返回目录

20 实验步骤 ⑴取50ml 锥形瓶1 只，加入蒸馏水7 份；
⑵用吸管吸取抗凝血1 份，擦去管壁外血液，将吸管插入锥形瓶底部，缓缓放出血液。放完血液后，将吸管提高吸取上清液再吹入，反复洗管3 次。充分混合，使红细胞完全溶解； ⑶加入0.333mol/l 硫酸溶液1 份，随加随摇，充分混匀，此时血液由鲜红变成棕色，静置5-10min ，使其酸化完全； ⑷加入10 ％钨酸钠1 份，随加随摇； ⑸放置约5min 后，如振摇亦不再发生泡沫，说明蛋白质已完全变性沉淀。 ⑹用定量滤纸过滤。 用此法制得的无蛋白血滤液为10 倍稀释的血滤液。即每毫升血滤液相当于0.lml。 返回目录

21 实验结果 用定量滤纸过滤后应该得到完全澄清无色之无蛋白血滤液。如果得到仍带有红色的血滤液则说明蛋白质未被完全去除。 返回目录

22 注意事项： 用吸管吸取血液时，动作要缓慢，释放入锥形瓶前要擦干净管壁外的血液。 加入试剂时注意要边加边摇。
制做过滤装置时要注意滤纸要紧贴漏斗的内壁。 过滤时速度很慢，切忌捣破滤纸以加快速度。 返回目录

23 思考题 ⑴钨酸法沉淀蛋白质的原理是什么？ ⑵在临床检验中为什么要制备无蛋白血滤液？ ⑶加入硫酸和钨酸钠的顺序对实验结果有影响吗？
⑷用移液管吸取血液等粘稠液体时应注意什么？

24 实验三 唾液淀粉酶活性的观察

25 目录 实验目的 实验原理 实验试剂和仪器 实验步骤 实验结果 注意事项 思考题

26 实验目的 酶是化学本质为蛋白质的生物催化剂。其活性受到很多因素的影响，如温度、pH值以及抑制剂激活剂等。通过本次的实验观察，同学们应该更加深刻的理解理论课上所讲的酶促反应动力学的内容。 返回目录

27 实验原理 在本实验中，以稀释的唾液作为淀粉酶液。唾液内的淀粉酶可将淀粉逐步水解成各种不同大小的糊精分子，最终产物为麦芽糖和少量的葡萄糖。它们遇碘呈不同的颜色。直链淀粉（即可溶性淀粉）遇碘呈蓝色；糊精按分子从大到小的顺序，遇碘可呈蓝色、紫色、暗褐色和红色，最小的糊精和麦芽糖遇碘不显颜色。

28 实验原理 淀粉在唾液淀粉酶的作用下水解： 淀粉→紫色糊精→红色糊精→麦芽糖及少量葡萄糖 遇I2分别呈现：
蓝色→紫色→红色→不显色 由于在不同温度，不同pH，或者在有激活剂或抑制剂存在的条件下唾液淀粉酶的活性高低不同，则淀粉被水解的程度不同，所以，可由酶反应混合物遇碘所呈现的颜色来判断，从而可了解上述诸因素对酶活性的影响。 返回目录

29 实验材料及设备 仪器：恒温水浴锅 试剂 0.5%淀粉溶液 0.3% NaCl溶液 0.3% CuSO4溶液 碘液 返回目录

30 实验步骤 1.  唾液淀粉酶的制备 (1)  提取：实验者先用水漱口清洁口腔，然后含一小口（约5mL）蒸馏水于口中轻嗽一、二分钟。 (2)  稀释：将酶提取液用水定容至100mL。作为唾液淀粉酶的样品液。 （由于不同人或同一人不同时间收集到的唾液淀粉酶的活性并不相同，稀释倍数可以是50～300倍，甚至超过此范围。）

31 实验步骤 2.温度对酶活性的影响 取3支试管，编号后各加入淀粉溶液2毫升。将第l、2号试管放入37℃恒温水浴中保温，第3号试管放入冰水中冷却，5分钟后，向第l号试管中加人煮沸5一15分钟的稀释唾液l毫升；向第2、3号试管加稀释唾液各l毫升。摇匀，20分钟后取出3支试管，各加碘溶液2滴，混匀，比较各管溶液的颜色。判断淀粉被唾液酶水解的程度，并说明温度对唾液酶活性的影响。

32 实验步骤 3.抑制剂和激活剂对酶活性的影响 取3支试管，编号。向第l支试管中加入l%氯化钠溶液l毫升，向第2支试管中加入0.1%的硫酸铜溶液l毫升，向第3支试管中加入蒸馏水l毫升作对照。再向每支试管各加入0.l%淀粉溶液3毫升和稀释的唾液l毫升。摇匀各管内容物，一齐放入37℃恒温水浴中保温，10~15分钟后取出。冷后，各滴入2一3滴碘溶液，混匀。观察比较3支试管颜色的深浅。 　　 返回目录

33 实验结果 抑制剂和激活剂对酶活性的影响 温度对酶促反应速度的影响
37℃水浴中的试管加入碘液后呈现浅黄色（碘液颜色）；0 ℃水浴中的试管加入碘液后呈现紫红色或者蓝色；沸水浴中的试管加入碘液后呈现蓝色。 抑制剂和激活剂对酶活性的影响 加入1％NaCl溶液的试管加入碘液后呈现浅黄色；加入蒸馏水的试管加入碘液后呈现红色；加入1％硫酸铜溶液的试管加入碘液后呈现蓝色。 返回目录

34 注意事项： 沸水浴中的试管在加入碘液之前一定要在自来水下冷却。这是因为淀粉与碘液生产的蓝色物质加热会变成无色，如果不冷却而直接加入碘液会使生成的蓝色物质变为无色，导致得出错误的实验结果。 返回目录

35 思考题 1.  什么是酶的最适温度？有何实践意义？ 2.  什么是酶的最适pH？它是否是一个常数？它与哪些因素有关？这种性质对于选择测定酶活力的条件有什么意义？ 3.  酶反应的抑制作用有哪些类型？各根据什么划分的？它们各有什么特点？

36 实验四 血清蛋白质醋酸纤维薄膜电泳

37 目录 实验目的 实验原理 实验试剂和仪器 实验步骤 实验结果 注意事项 思考题

38 实验目的 电泳法是蛋白质分离纯化的重要方法。通过本次实验同学们应了解电泳技术的基本原理，学习血清蛋白质醋酸纤维薄膜电泳的操作方法。 返回目录

39 实验原理 血清中各种蛋白质的等电点大都低于pH7.0，在pH8.6缓冲液中，它们均电离成阴离子，在电场中向阳极移动。由于各种蛋白质在同一pH环境中所带电荷多少及分子大小不同，所以在电场中的泳动速度不同。一般来说，蛋白质分子量小而带电荷多者，泳动速度快，分子量大而带电荷少者泳动速度慢,因此可以利用其泳速不同将之分开。

40 实验原理 本实验用醋酸纤维薄膜作为支持物进行电泳，依上述原理可将血清蛋白质分离为五条区带，从阳极到阴极依次为清蛋白，α1球蛋白，α2球蛋白，β球蛋白和γ球蛋白。 醋酸纤维薄膜由二乙酸纤维素制成，具有均一的泡沫结构，厚度120微米，有较强的渗透性，对分子移动无阻力，作为支持物进行蛋白电泳，有微量、快速、简便、分离清晰及无吸附现象等优点。 返回目录

41 实验仪器与试剂 (一)仪器 电泳仪；电泳槽；加样器；醋酸纤维薄膜(2×8cm)。

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44 实验仪器与试剂 (二)试剂 1.巴比妥缓冲液(pH8.6，离子强度0.06) ：称取巴比妥钠12.76克，巴比妥1.66克，用蒸馏水溶解稀释至1000ml。 2.氨基黑10B染色液： 取氨基黑10B0.5克，加冰醋酸10ml及甲醇50ml，用蒸馏水稀释至100ml。 3.漂洗液： 取95%乙醇45ml，加冰醋酸5ml，混匀后，用蒸馏水稀释至100ml。 返回目录

45 实验步骤 (一)准备电泳槽 根据电泳槽膜支架的宽度，剪裁尺寸合适的滤纸条。在两个电极槽中，各倒入等体积的电极缓冲液，在电泳槽的两个膜支架上，各放两层滤纸条，使滤纸一端的长边与支架前沿对齐，另一端浸入电极缓冲液内。当滤纸条全部润湿后，用玻璃棒轻轻挤压在膜支架上的滤纸以驱赶气泡，使滤纸的一端能紧贴在膜支架上。滤纸条是两个电极槽联系醋酸纤维素薄膜的桥梁，因而称为滤纸桥。

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47 实验步骤 (二)点样 1.取醋酸纤维薄膜，于无光泽面距一端1.5cm处用铅笔画一线，表示点样位置。 2.取盖玻片蘸新鲜血清，点在加样线上，待血清渗入薄膜后移开。

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49 实验步骤 (三)电泳 用竹夹子将点样端的薄膜平贴在阴极电泳槽支架的滤纸桥上(点样面朝下)，另一端平贴在阳极端支架上 。盖上电泳槽盖，使薄膜平衡10min。 用导线将电泳槽的正、负极与电泳仪的正、负极分别连接，注意不要接错。在室温下电泳，打开电源开关，用电泳仪上细调节旋扭调到每cm膜宽电流强度为0.3 mA(8片薄膜则为4.8 mA)。通电10～15min后，将电流调节到每cm膜宽电流强度为0.5 mA(8片共8 mA)，电泳时间约50～80min；电泳后调节旋扭使电流为零，关闭电泳仪切断电源。

50 实验步骤 (四)染色与漂洗 电泳毕，将薄膜浸入氨基黑10B染色液中1-2分钟，取出后用漂洗液漂洗3次，每次约5分钟，至背景无色为止，取出晾干，辨认图谱中各蛋白区带。 返回目录

51 实验结果 染色并漂洗后，理论上在薄膜上应得到5条蛋白带。由正级到负极排列分别为：清蛋白、α1－球蛋白、 α2－球蛋白、 β－球蛋白和γ－球蛋白。 返回目录

52 注意事项 点样时，一定要注意点样量，且一定不能重复点样； 注意点样端要位于负极端；
要求薄膜紧贴滤纸桥并绷直，中间不能下垂。如一电泳槽中同时安放几张薄膜，则薄膜之间应相隔几毫米。 返回目录

53 思考题 为什么需将血清样品点在薄膜条的负极端 ？ 电泳的原理是什么？根据支持介质的不同，电泳可分为哪几类？
蛋白质在电场中的泳动速度和哪些因素有关？

54 实验五 蛋白质含量的测定

55 目录 实验目的 实验原理 实验步骤 思考题

56 实验目的 通过本实验，同学们应掌握利用洗脱法测定血清中蛋白质含量的方法；学习分光光度计的工作原理及掌握分光光度计的使用方法。 返回目录

57 分光光度计的工作原理 光线的本质是电磁波的一种，有不同的波长。肉眼可见的彩色光称为可见光，波长范围在400～750nm：小于400nm的光线称为紫外光；大于750nm的光线称为红外光。 当光线通过透明溶液介质时，其辐射的波长有一部分被吸收，一部分透过、因此光线射出溶液之后，部分光波减少，这种光波的吸收和透过可用于某些物质的定性定量分析。 分光光度法依据Lambert-Beer定律：  A = KCL= -lgT   其中：T：透光率    A：吸光度（有时用光密度OD表示）               K：吸收系数    L：溶液的光径长度         C：溶液的浓度

58 分光光度计的工作原理 从上式可以看出，一束单色光通过溶液后，光波被吸收一部分，其吸收多少与溶液中溶质的浓度和溶液厚度成正比，当入射光、吸收系数K和溶液的光径长度L不变时，吸光度A与溶液的浓度C成正比。

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60 722S分光光度计的使用方法 ⑴预热：30min ⑵设定波长 ⑶置入空白 ⑷调零：打开试样盖，按0%ADJ键
⑸调100%T：盖上试样盖， 按100%ADJ键 ⑹置入吸光度标尺：按MODE键 ⑺样品置入光路 ⑻读出数据

61 实验原理： 在一定范围内，蛋白质的量与结合染料的量成正比，因此，可进行定量分析。本实验将醋酸纤维薄膜上的各蛋白区带剪下，分别用0.4mol/L NaOH将蛋白质浸洗下来，用分光光度法进行测定。 返回目录

62 实验步骤： ⑴将醋酸纤维薄膜上的各蛋白区带剪下；
⑵将各区带分别放入盛有0.4mol/L NaOH的试管中，其中清蛋白8mL，其余各管4mL； ⑶将各试管放入37℃的水浴中保温30min，每隔10min摇匀一次； ⑷将NaOH溶液作为空白管，620nm波长处调零； ⑸测定各管光密度值，计算各类蛋白质的含量。 返回目录

63 思考题： 比色时，设空白管的意义是什么？ 分光光度计的工作原理是什么? 本实验的测定波长为什么是620nm，而不是280nm？

64 实验六 动物组织中DNA的制备

65 目录 实验目的 实验原理 实验试剂和仪器 实验步骤 注意事项 思考题

66 实验目的 DNA是遗传的物质基础，基因是具有特定生物学功能的DNA序列，通过基因的表达能够使上一代的性状准确地在下一代表现出来。本实验旨在掌握动物组织中DNA的制备方法，为进一步研究现代分子生物学课题打下坚实的基础。 返回目录

67 实验原理 要获得纯的DNA样品，必须考虑以下几点： ⑴如何选材，如何破碎组织细胞？
⑵如何除去蛋白质？在真核细胞内，DNA与蛋白质结合成核蛋白形式。因此，分离DNA时必须使其与蛋白质解离，并除去蛋白质。 ⑶设法除去RNA的污染； ⑷防止DNA酶的降解作用。

68 (一)选材 要提取动物组织DNA，一般选择细胞膜较脆弱，容易破碎的动物脏器，如胸腺、肝脏、脾脏、胰脏、精子等。

69 (二)细胞破碎方法—机械物理法： 研磨：将剪碎的动物组织置于研钵或匀浆器中，加入少量石英砂研磨或匀浆，破碎细胞。这种方法温和，适合实验室使用。 组织捣碎器：较剧烈的破碎细胞的方法，为了防止发热和升温过高，通常是转10秒—20秒，停10秒—20秒，可反复多次。 压榨法：在1000×105Pa—2000×105Pa 的高压下使几十毫升的细胞悬液通过一个小孔突然释放至常压，细胞将彻底破碎。温和的、彻底破碎细胞的方法，但仪器费用较高(少量细胞可用French press,大量可用Manto-gaulin）。

70 (二)细胞破碎方法—机械物理法： 反复冻融法：将待破碎的细胞冷至－15℃到－20℃，然后放于室温(或40℃)迅速融化，由于细胞内形成冰粒使剩余胞液的盐浓度增高而引起细胞溶胀破碎。 超声波处理法：借助超声波的振动力破碎细胞壁和细胞器。使用时注意降温，防止过热。 冷热交替法：在90℃左右维持数分钟，立即放入冰浴中使之冷却，如此反复多次，绝大部分细胞可以被破碎。

71 (二)细胞破碎方法—化学方法 有机溶剂处理法：利用氯仿、甲苯等脂溶性溶剂或SDS（十二烷基硫酸钠）等表面活性剂处理细胞，可将细胞膜溶解，从而使细胞破裂，此法也可以与研磨法联合使用。 溶胀法：细胞膜为天然的半透膜，在低渗溶液和低浓度的稀盐溶液中，由于存在渗透压差，溶剂分子大量进入细胞，将细胞膜胀破释放出细胞内含物。

72 (三)除去RNA的方法 脱氧核糖核蛋白在浓NaCl（1-2mol／L）溶液中溶解度很大，但在0.14mol／L NaCl溶液中溶解度很低，而核糖核蛋白则溶于0.14mol／L NaCl溶液中，利用这一性质可将脱氧核糖核蛋白与绝大部分核糖核蛋白分离开来。

73 (四)除去蛋白质的方法 用氯仿一异成醇混合液振荡核蛋白溶液，使蛋白质变性，然后离心除去变性蛋白质，此时蛋白质凝胶停留在水相及氯仿相中间，而DNA溶于上层水相。用两倍体积95％乙醇溶液可将DNA钠盐沉淀出来。 用十二烷基硫酸钠（SDS）等去污剂使蛋白质变性，可以直接从生物材料中提取DNA。

74 (五)纯的DNA样品的获得 为了防止DNA酶的降解，提取时可加入适量EDTA（乙二胺四乙酸）、柠檬酸，以降低DNA酶的活性。
加入RNA酶降解剩余的RNA，获得纯的DNA。 保存：将DNA于滤纸上干燥，溶于1mlTE中低温保存。 返回目录

75 实验材料、试剂和仪器 (一)材料：动物肝脏 (二)试剂： （1）0.14mol／LNaCl－0.15mol／L EDTA-Na溶液：
（2）20％SDS溶液： （3）氯仿一异戊醇(24:1)混合液： （4）95％乙醇溶液。 （5）80％乙醇溶液。 (三)仪器(略) 返回目录

76 实验步骤 1．取新鲜动物肝，除去结缔组织，用0.14mol／LNaCl－0.15mol／L EDTA溶液洗去血液。在冰浴中切成小块，称取10g，加入两倍体积0.14mol／LNaCl－0.15mol／L EDTA溶液，于研钵中研磨至匀浆，以3000r／min的转速离心10min。

77 实验步骤 2．在上述沉淀物中加入0.14mol／LNaCl－0.15mol／L EDTA溶液，使总体积为20mL，然后在60℃下，滴加20％SDS溶液1mL，边加边搅拌，再摇动10min，使核酸与蛋白质分离。 3. 边搅拌边加固体氯化钠2g，使其最终浓度达到l.4mol／L，再摇10min。

78 实验步骤 4．加等体积的氯仿一异戊醇，轻混，静置，离心管内的物质分为三层，上层为含DNA的水相层，下层为氯仿一异成醇混合物，中间层为变性蛋白凝胶。吸出上清液,倒入另一离心管。 5．加1/2体积的氯仿一异戊醇混合液，振摇20min，以3000r／min的转速离心10min。

79 实验步骤 6．吸出上清液，加入2倍体积95％乙醇溶液（预冷），产生沉淀。
①用玻棒搅拌，DNA的丝状物即缠在玻棒上，用80％乙醇溶液洗涤一次。 ②再以4000r／min的转速离心溶液10min，弃去上清液，沉淀用80％乙醇溶液再离心洗涤一次。 7．将沉淀置于吸水纸上，除尽乙醇，室温自然干燥后，加入1ml 蒸馏水，使DNA充分溶解，待用。 返回目录

80 注意事项 （1）避免过酸过碱或高温环境，合适的T：0－4℃，pH4-9； （2）防止机械力的切割作用，避免剧烈振荡；
（3）防止核酸酶的降解作用，可加入抑制剂－EDTA，柠檬酸钠； （4）整个操作步骤应尽量简化，缩短实验过程，减少核酸变性、降解、机械切割的机会。 返回目录

81 思考题 细胞破碎的方法有哪些？ 如何去除蛋白质？ 如何避免RNA酶的影响？ 在操作过程中为什么要避免剧烈振荡？

82 实验七 紫外分光光度法测定DNA的含量

83 目录 实验目的 实验原理和步骤 思考题

84 实验目的 通过本实验，同学们应了解并掌握紫外分光光度法测定DNA含量的原理及方法。 返回目录

85 实验原理及步骤 DNA定量 DNA在260nm处有最大的吸收峰，蛋白质在280m处有最大的吸收峰，盐和小分子则集中在230m处。因此，可以用260nm波长进行分光测定DNA浓度，OD值为1相当于大约50μg/ml双链DNA。如用1cm光径，用H2O稀释DNA样品n倍并以H2O 为空白对照，根据此时读出的OD260值即可计算出样品稀释前的浓度：DNA(mg/ml)=50×OD260读数×稀释倍数/1000

86 实验原理及步骤 DNA纯品的OD260/OD280为1.8，故根据OD260/OD280的值可以估计DNA的纯度。若比值较高说明含有RNA，比值较低说明有残余蛋白质存在。OD260/OD280的比值应在0.4～0.5之间，若比值较高说明有残余的盐存在。 返回目录

87 思考题 紫外分光光度法测定DNA溶液的浓度原理是什么？

88 课程结束!

89 祝愿同学们在科学的天空中展翅翱翔!