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流式細胞儀 基本原理與應用 美商必帝股份有限公司
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What is Flow Cytometry? 以流體(Flow)來帶動細胞(Cyto)或粒子,對其特性進行檢測(-metry)的一種分析技術。 大小 結構複雜度與顆粒性 細胞膜表面抗原(ligand, receptor, adhesion molecule…etc) 細胞內抗原(cytokine, enzyme, signal transduction molecule…etc) DNA含量 …etc.
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Flow Cytometry 之特色 High Speed:可在一分鐘內檢測104〜105 細胞。 以單一細胞為分析基礎
( /sec) 以單一細胞為分析基礎 可同時進行多參數分析 運用雷射激發,配合各種抗體與染料來染色,並藉檢測特色螢光來辨識及計數細胞。 毋需細胞分離步驟即可篩選出目標細胞進行分析或是加以撿選收集。
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What Can a Flow Cytometer Tell Us About a Cell?
它的相對大小 (Forward Scatter—FSC) 它的相對顆粒度或內部複雜度 (Side Scatter—SSC) 它的相對螢光亮度
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流式細胞儀的基本組成 液流系統 — 光學系統 —
利用鞘液(FACSFlow Sheath Fluid)將細胞依序送至測量區受檢 光學系統 — 利用雷射光源、透鏡、光柵、濾片與反射鏡等激發並收集細胞產生之螢光與散射光,並導至各探測器內 電子系統 — 1.將探測器測到的光學訊號轉換為電子訊號 2.分析所輸出的電流訊號,以脈衝高度(H)、寬度(W)、積分面積(A)顯示 3.量化並放大訊號傳至電腦
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BD FACSCaliburTM 基本桌上型三/四色分析儀
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FACS CaliburTM 的液流系統 流動室 螢光 散射光 偵測區 激發光源 樣品流動區 Hydrodynamic Focusing
液流聚焦 流動室
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FACS CaliburTM 的光學系統
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激發光源 標準配備: 488nm 藍光雷射 Optional: 635nm 紅光雷射 樣品流動區 偵測區 激發光源 散射光 螢光
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散射光測量原理 FSC Sensor Laser SSC Sensor
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散射光特性 波長與入射光一致,為細胞固有的物理及生理特性,可依此對未染色的細胞進行分析
-- 前向散射光(FSC):與細胞大小有關 -- 側向散射光(SSC):與細胞內部的結構及顆粒性有關
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散射光分析圖例 Lysed Whole Blood Neutrophils Side Scatter Monocytes
Forward Scatter Side Scatter Lymphocytes Monocytes Neutrophils
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螢光激發原理
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常見螢光分子Emission Spectra
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光學濾片 螢光激發波長依所選螢光染劑而異,可經由不同之光學濾片導至各個探測器內 光學濾片
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螢光代表意義 Emitted Fluorescence Intensity Binding Sites
FITC FITC FITC FITC FITC FITC FITC FITC FITC FITC Number of Events Fluorescent Intensity
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FACS CaliburTM 的光學系統
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2-16° Forward Scatter (FSC)
FACS CaliburTM 的光學系統 2-16° Forward Scatter (FSC) “Size” 90° Side Scatter (SSC) “Granularity” FITC GFP PE Cy3 PI PerCP PerCP-Cy5.5 PE-Cy7 APC
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電子系統 將探測器測到的光學訊號轉換為電子訊號(脈衝) 分析所輸出的電流訊號,以脈衝高度(H)、寬度(W)、積分面積(A)顯示
量化並放大訊號傳至電腦
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訊號之產生與處理
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訊號之產生與處理
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線性--對數之轉換
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線性--對數之轉換 基本原則: -- 訊號強弱差<10倍or需線性關係:使用線性放大器(如散射光,DNA分析) -- 訊號強弱差>10倍or需分析弱螢光表現:使用對數放大器(如螢光)
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實驗數據之呈現 List-mode
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實驗數據之呈現(Histogram Plot)
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實驗數據之呈現(Dot Plot)
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圈選 (gating) 功能 挑選出有意義細胞族群。 可用來篩選實驗數據。 R1
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Review
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螢光補償(Compensation)
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Emission Spectra
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FITC Fluorescence Overlap
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FITC Compensation
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FITC Compensation
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PE Fluorescence Overlap
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PE Compensation
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PerCP Fluorescence
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Compensation Examples
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Applications of Flow Cytometry
細胞表面抗原分析(Cell Surface Antigens/Markers) 細胞內抗原分析(Intracellular Antigens) -- Cytokines, Signal Transduction molecules…etc. DNA分析 -- Cell viability, Cell cycle, Apoptosis…etc. 細胞功能參數分析 -- Free radicals, Ca2+, Protein expression (reporter genes) …etc. CBA (Cytometric Bead Array) ……
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細胞表面抗原分析 定性分析:陰、陽性界定 定量分析:表面受體因刺激而表達量增強或減弱 Ligand Receptor
adhesion molecule …etc 定性分析:陰、陽性界定 定量分析:表面受體因刺激而表達量增強或減弱
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淋巴球免疫分型 Whole Blood RBC Leukocyte (CD45+) Platelet Granulocyte
Lymphocyte Monocyte (CD14+) T cell (CD3+) B cell (CD19+) NK cell (CD3-, CD16+/CD56+) Helper T cell (CD4+) Cytotoxic T cell (CD8+)
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Helper T cell T cell / B cell Suppressor T cell
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Permeabilizing solution
細胞內抗原分析 Cytokine Enzyme signal transduction molecule …etc. Permeabilizing solution 定性分析:陰、陽性界定 定量分析:因刺激而表達量增強或減弱
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Advantages of Intracellular Flow Cytometry
Single cell level Define antigen-secreting cells by combination of surface and intracellular staining Rapid detection
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Combination Cell Surface and Intracellular Protein Staining
Picture From
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Cytokine Profiles of Memory T Cell Subsets
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Signal Transduction
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Flow Cytometry v.s Western Blot
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Comparison
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Intracellular Staining in Activated Lysed Whole Blood
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DNA 含量分析 Ethanol Detergent Nucleic Acid Dye 細胞週期分析 Apoptosis
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DNA 特異性染劑 Propidium Ethidium N+ C2H2)3 NH2 C2H5 CH3 NH2 NH2 N+ C2H5
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細胞周期位相的決定 s s M G2 G2 M G0 G0 G1 G1 2N 4N DNA content Count 200 400
200 400 600 800 1000 DNA content
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Apoptosis (Sub G1)
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細胞功能參數分析 細胞的酵素活性 (Substrates) 細胞膜、粒腺體膜電位 (DiOC6, JC-1) 細胞內氧化代謝物
細胞內酸鹼值 (Snarf-1) Ca2+流動 (Fluo-4/Fura Red, Indo-1) 細胞增殖分析 (PI, BrdU, Intracellular Cyclins) 細胞凋亡研究 (Annexin V, active Caspase-3)
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Annexin V Assay
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Annexin V/PI 雙染 Early Apoptosis
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Cytometric Beads Array (CBA)
Single Step Incubation or Two-Step Incubation
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Beads Provide a Flexible Platform
Multiple sizes Different fluorescence intensities Different colors with different intensities
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Advantages of Bead-Based Immunoassays
Analyze multiple analytes simultaneously Reduced sample volume requirements Reduced hands-on time by parallel analysis of samples Wide dynamic range of fluorescence detection (requires fewer sample dilutions)
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Proteins Measured A. Interleukin (IL)-2 B. IL-4 C. IL-5 D. IL-10 E. Tumor Necrosis Factor-a F. Interferon-g
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