垂直板聚丙烯酰胺凝胶连续电泳分离乳酸脱氢酶同工酶 （活性染色鉴定法）

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1 垂直板聚丙烯酰胺凝胶连续电泳分离乳酸脱氢酶同工酶 （活性染色鉴定法）
垂直板聚丙烯酰胺凝胶连续电泳分离乳酸脱氢酶同工酶 （活性染色鉴定法）

2 课前思考题 垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理？凝胶聚合的催化体系有哪些？
哪些因素影响聚丙烯酰胺凝胶的特性？在实际工作中，如何选择合适的凝胶浓度使蛋白质混合物得到最大限度的分离？ 净电荷聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质的特点是什么？ 什么是连续系统和不连续系统？有何优缺点？ 简述SDS-垂直板聚丙烯酰胺凝胶不连续电泳测定蛋白质相对分子质量的原理。 乳酸脱氢酶同工酶活性染色的原理是什么？与常用的考马斯亮蓝染色法有什么不同？在实验过程中需要注意什么问题？ 样品中加入溴酚蓝和蔗糖的作用是什么？ 电泳时正负电极接反会有什么现象发生？

3 实验原理 关于垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳 关于连续系统和不连续系统 关于乳酸脱氢酶同工酶及酶活性染色

4 垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳 电泳 带电颗粒在电场的作用下，向着与其电性相反的电极方向移动，这种现象称之为电泳。
电泳 带电颗粒在电场的作用下，向着与其电性相反的电极方向移动，这种现象称之为电泳。 聚丙烯酰胺凝胶 是由单体丙烯酰胺(Acr)和交联剂N,N’-亚甲基双丙烯酰胺(Bis)在催化剂过硫酸铵(AP)和加速剂N,N,N’,N’-四甲基乙二胺(TEMED)作用下聚合交联而成的三维网状结构的凝胶，通过改变凝胶浓度及交联度来调节凝胶的孔径，具有良好的分子筛效应。它已成为目前生化实验室最常用的支持介质。以它为支持物发展起来的各种聚丙烯酰胺凝胶电泳技术，不仅能分离、小量制备生物大分子，而且可以用来研究生物大分子的性质如电荷、相对分子质量、等电点以及构象等。 垂直板电泳 将配制好的凝胶溶液注入到两块垂直放置的玻璃板之间聚胶，然后加样进行电泳。

5 AP-TMTED催化体系 TEMED催化AP生成硫酸自由基： 硫酸自由基的氧原子激活Acr单体并形成单体长链：
S2O82－ SO4·¯ 硫酸自由基的氧原子激活Acr单体并形成单体长链： Bis将单体长链间连成网状结构：

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7 化学聚合的凝胶孔径较小，常用于制备分离胶，重复性好。聚合反应受各种因素的影响：
• 催化剂和加速剂的浓度 应选择合适的AP和TEMED浓度使聚合时间控制在30—60min内较好，过量的催化剂和加速剂会引起烧胶和蛋白质条带的畸变。 • pH TEMED只能以游离碱的形式发挥作用，在酸性条件下，叔胺缺少自由碱基，引发AP产生自由基的过程会被延迟，聚合时间延长。 • 温度 聚合速度与温度有关，一般是高温聚合快，而聚合的速度影响交联孔径的大小，所以凝胶聚合时必须保持温度恒定，通常用与电泳相同的温度。 • 分子氧 分子氧的存在会阻止碳链的延长，妨碍聚合作用，在聚合过程中要尽量避免接触空气。 • 杂质 某些金属离子或其它杂质也会影响凝胶的化学聚合，所以应选择高纯度的Acr、Bis和AP。

8 凝胶总浓度及交联度对凝胶的影响 凝胶溶液中单体和交联剂的总浓度和两者的比例是决定聚丙烯酰胺凝胶特性包括其机械性能、弹性、透明度、粘着度及孔径大小的主要因素。T为凝胶溶液中单体和交联剂的总质量浓度，C为凝胶溶液中交联剂占单体和交联剂总量的质量分数。 式中，a为丙烯酰胺单体的质量(g)，b为交联剂的质量(g)，m为溶液的终体积(mL)。 凝胶a、b的比例决定了凝胶的物理性状。当a:b小于10时，凝胶脆且硬，不透明，呈乳白色；当a:b大于100时，即使用5%的丙烯酰胺凝胶也呈糊状；通常用a:b在30左右，并且丙烯酰胺浓度高于3%，凝胶富有弹性并且透明。

9 凝胶的总质量浓度T和交联度C决定凝胶的有效孔径。凝胶的三维网状结构具有分子筛效应，不同大小和形状的大分子通过孔径时所受的阻滞力不同，加上大分子的电荷效应，使各种大分子迁移率不同得以分离。在实际工作中，常依据待分离蛋白质已知相对分子质量的大小来选择所合适的凝胶浓度，使蛋白质混合物得到最大限度的分离，大多数蛋白质在7.5%凝胶中能得到满意的结果，所以这个浓度的凝胶称为标准胶。当分析一个未知样品时，常用标准胶或梯度凝胶来测试，而后确定适宜的凝胶浓度。

10 净电荷聚丙烯酰胺凝胶电泳 分离蛋白质的原理
净电荷聚丙烯酰胺凝胶电泳是对天然状态生物大分子进行的电泳，目的是为了保持蛋白质的天然构象、其亚基之间的相互作用及其生物学活性。利用蛋白质分子中所带净电荷、分子质量、形状的差异，在电场中泳动的速度和方向不同，从而达到分离的目的。多数蛋白质的pI在中性偏酸性范围，通常是将样品在碱性缓冲系统中进行电泳，蛋白质分子带负电荷，以不同速度向阳极迁移，称为阳极电泳；对于一些碱性蛋白，使用酸性缓冲系统进行电泳，蛋白质分子带正电荷而向阴极迁移，称为阴极电泳。

11 蛋白质在净电荷聚丙烯酰胺凝胶 电泳中的分离因素
电荷因素 分子大小 分子形状 电荷因素 蛋白质分子形状和大小相同，所带电荷性质和数量不同 分子大小 蛋白质分子形状和所带电荷性质和数量相同，分子大小不同 分子形状 蛋白质分子所带电荷性质和数量相同，分子形状不同

12 聚丙烯酰胺凝胶电泳的类型 连续系统 是指电泳系统采用相同孔径的凝胶、缓冲系统等条件下进行区带电泳，是利用蛋白质分子的电荷效应进行分离，凝胶的分子筛效应不明显，一般只用于分离一些比较简单的样品，缺点是分辨率不高。优点是制胶简单快捷，缓冲系统的pH恒定，可以防止样品进胶后因pH变化发生凝聚和沉淀，缓冲系统组成简单。

13 不连续系统 是指使用不同孔径的凝胶和不同缓冲体系的电泳方式，在电泳分离过程中，由于浓缩胶的堆积作用，可使样品在浓缩胶和分离胶的界面上先浓缩成一窄带，对样品进行浓缩，然后在一定浓度或浓度梯度的凝胶上进行分离，既存在电荷效应，也有分子筛效应。虽然制胶操作难度较大，但是它具有连续系统不可比拟的优越性，分辨率高。 不连续电泳的四个不连续性 凝胶浓度的不连续性；缓冲液离子成分的不连续性；缓冲液pH梯度的不连续性；电位梯度的不连续性。

14 关于乳酸脱氢酶 1959年Markert等用电泳的方法将纯化的心肌乳酸脱氢酶(LDH)分离出5条区带，由阳极到阴极依次命名为LDH1、LDH2、LDH3、LDH4、LDH5，它们均具有LDH催化活性，从而首先提出了同工酶的概念。目前已知LDH同工酶是由H和M亚基按不同比例组成的四聚体。 LDH同工酶广泛存在于动植物及微生物中，动物各组织中LDH同工酶各组分含量不同。临床上对LDH及同工酶的检测可作为某些疾病诊断的依据之一。

15 乳酸脱氢酶同工酶活性染色 用活性染色对LDH进行鉴定，将凝胶浸泡在活性染色液中，LDH与底物的反应，用甲硫吩嗪(PMS)作为电子的中间载体，氯化硝基四氮唑蓝(NBT)作为最终电子受体，底物脱下的氢最后传递给NBT，NBT被还原后，产生蓝紫色的不溶于水的物质以对LDH定位。反应式如下：

16 电泳结果实例 LDH4 LDH3 LDH5 LDH1 LDH2

17 电泳装置 采用Pharmacia公司的SE250小型夹心式垂直板电泳装置： 制胶装置 制备凝胶板 电泳装置 进行凝胶电泳
制胶装置 制备凝胶板 电泳装置 进行凝胶电泳 每组（2人）做一块胶，两组共用一套电泳装置，两套电泳槽共用一台电泳仪。

18 操作步骤 一、样品制备： 断脊椎处死小鼠，取适量小鼠骨骼肌、肝脏、心肌和脑组织，加入5倍组织重的匀浆缓冲液，用玻璃匀浆器匀浆，离心( r /min，15 min)，吸出上清液，加入等体积40 %的蔗糖（含少许溴酚蓝）混匀，放置4℃冰箱中备用。

19 二、制备凝胶： 凝胶模的组装 凝胶模由一块玻璃板、一块凹形氧化铝板和两条间隔条组成，将它们按下图组装，四周对齐，注意手指勿接触玻璃和氧化铝板内侧的灌胶面，注意间隔条的安装。

20 将凝胶模安装在固定架上 将凝胶模插入固定架， 使凹形氧化铝板紧贴固定 架的背板，将固定架放在 一个水平玻璃板上，使凝 胶模各部件与固定架下缘
对齐，轻轻拧紧螺丝，使 压条紧压凝胶模。 背板 压条 固定架 橡胶垫 底座 凸轮

21 将固定架安装在底座上 将固定架置于凝胶 模底座上，螺丝朝外， 固定架两侧插入凸轮， 凸轮旋转180o使凝胶模 的下缘在固定架的橡胶 垫上压紧，形成一个密 闭的夹心式凝胶模。

22 制胶(T=7.5%，C=2.6%) 两组按照表中的比例和顺序在小烧杯中配制凝胶溶液，加入AP后，立即混匀，沿玻璃板尽快倒入玻璃板和金属板缝隙中，注意不要有气泡，当凝胶液面距短板（白金属板）上缘0.3 cm时，立即轻轻将样品槽模板插入凝胶溶液中，注意样品槽中不要有气泡，凝胶溶液应充满样品槽间隙。制胶装置室温垂直放置，30~60 min聚合反应完成。

23 制备连续聚丙烯酰胺凝胶电泳凝胶的配方 （两组）
凝胶溶液组成 体积 Tris-Gly缓冲液 5 mL 30%凝胶贮液 2.5 mL 重蒸水（含TEMED） 10%AP 60μL

24 三、准备电泳： 将凝胶板安装在电泳槽本体上 将凝胶板从制胶装置上取下，安装到电泳槽本体上，使凹形氧化铝板紧贴在本体的密封橡胶封条上，用弹簧夹夹紧，在凝胶板和本体之间形成一个封闭的上液槽。 凝胶板 电泳槽本体

25 加样 取125mL电极缓冲液贮液，用去离子水稀释到250mL，加入上、下缓冲液槽中，注意上槽液要高过凹形板，凝胶板与下液槽的缝隙处无气泡。将印有样品槽模板形状的塑料片贴在玻璃板上，使其与样品槽重合（加样后电泳前将塑料片取下），小心拔出样品槽模板。用微量进样器吸取一定体积的样品溶液，小心地将样品加在样品槽底部。注意每种样品使用同一支进样器，以免样品相互污染。

26 骨骼肌 μL 心肌 μL 肝脏 μL 脑 μL

27 四、电泳： 加样后，盖上电泳 槽安全盖，接通电源， 注意正负电极的连接， 将电泳仪调至恒压80 V， 待指示剂全部进入凝胶
电极导线 安全盖 上液槽 下液槽 橡胶封条 弹簧夹 冷却水口 四、电泳： 加样后，盖上电泳 槽安全盖，接通电源， 注意正负电极的连接， 将电泳仪调至恒压80 V， 待指示剂全部进入凝胶 后，电压提高到120 V， 继续电泳，直到溴酚蓝 前沿到达距凝胶下端约 0.5 cm时，关闭电源， 停止电泳（本实验可将 溴酚蓝走出0.5h~1h后停 止电泳）。

28 五、活性染色，脱色，照相： 电泳结束后，将凝胶板取下，用薄尺子轻轻将玻璃板和氧化铝板撬开，在凝胶下部切角标注凝胶方位，然后将带有凝胶的板反扣过来，胶面朝下，用尺子小心地将凝胶的一角剥离，使凝胶掉入装有活性染色液的培养皿中。轻轻摇动培养皿，使凝胶完全浸泡在染色液中，放入37℃恒温水浴中保温，染色过程注意避光，待大多数条带显现蓝紫色时除去染色液，显色时间一般为15~30 min。加入脱色液终止酶促反应，摇动3~5 min，凝胶底色脱去直至背景清亮，数码相机照相。

29 附：制干胶 用两张玻璃纸将凝胶制成夹心式干胶，待凝胶干透后，取下玻璃板即可得到平整透明的电泳干胶图谱。

30 其他注意事项 爱惜电泳装置，轻拿轻放，玻璃板必须用海绵清洗，避免产生划痕，损坏需赔偿。
染色液价格昂贵，按量发放（两块胶30mL），随用随取，注意避光，如果没有变绿仍可继续使用，不影响染色效果。 每班请一位同学配制脱色液1000 mL，每两组使用50 mL（染色、脱色均为两块胶同时进行）。 实验完成后，将电泳装置洗净，所用配件放回盘中，老师检查合格后方可离开。