Molecular Epidemiology

Presentation on theme: "Molecular Epidemiology"— Presentation transcript:

1 Molecular Epidemiology
第十六章 分子流行病学 Molecular Epidemiology 1.概述 2.研究内容 3.研究方法 4.发展与应用前景

2 Contents 1.Introduction 2.Research methods 3.Brief introduction to common laboratory techniques 4.Utilization of molecular epidemiology 5.Example for molecular epidemiological researches 6.Prospect (look into the future)

3 Section one Introduciton

4 一、分子流行病学的产生与发展历程   Progress of molecular epidemiology （一）背景 分子生物学技术的不断发展： 1．分子流行病学的研究方法越来越多： 如在分子流行病学产生的初期，主要研究手段是质粒 图谱分析、核酸杂交等技术，且程序烦琐、费事费力，目 前许多新的技术已应用于分子流行病学研究，且可自动化 或半自动化测定，如聚合酶链反应（polymerase chain reaction,PCR）、DNA序列分析、酶定量分析等等。 2．研究内容越来越多：已从研究传染病的病原体、 传染源、传播途径，逐渐延伸至非传染性疾病或健康状态， 以及人群易感性和疾病预防、治疗措施的评价等等。 3．应用范围越来越大：从预防医学到整个生命科学。

5 （二）发展历程 1.概念的演变： 近20年来分子生物学被引入流行病学研究领域。 使流行病学研究中的组间比较更为准确； 对发病机制的认识更为明确； 对暴露与疾病发生过程的研究更为精确。 目前，分子流行病学成为现代流行病学的一个重 要组成部分。

6 最早使用“分子流行病学”这一术语的是Kilboure，
他于 1972年用分子生物学技术探讨了流感病毒抗原变 异与流感大流行之间的相互关系，旨在通过研究病毒 分子结构，来阐明流感发生大流行的原因。 但作者并未解释“分子流行病学”的涵义。之后有 关学者相继使用这一术语，不断有一些解释。

7 1993年Schulte出版了第一部分子流行病学专著，
并给分子流行病学定义为，“在流行病学研究中，应用生物学标志物，包括生化的、分子的、生理学的、免疫学的、遗传学的等信号，这些事件信号代表致病因子与所致疾病之间连续过程中一个个相关的环节。”

8 2.血清流行病学定义 血清流行病学(seroepidemiology)是应用血清学方法检测人群中特异性抗原、抗体、各种代谢产物、遗传标记、生化指标、营养成分等血液成分，借以了解疾病或健康状况在人群中的分布及其影响因素，探讨疾病发生的原因并评价预防措施的效果。血清流行病学是流行病学的一个重要分支之一。

9 血清流行病学有狭义和广义之分。 而广义上的血清流行病学实际上由于分子流行病学的迅猛发展，已逐步融入分子流行病学之中，实际上已属于分子流行病学的研究范畴。所以，我们不再将血清流行病学单作一章介绍，而是并于分子流行病学这一章中一并介绍，更具实际意义，也更有助于读者对分子流行病学的理解。

10 Definition and progresses of molecular epidemiology （一）分子流行病学的概念
二、分子流行病学的定义   Definition and progresses of molecular epidemiology （一）分子流行病学的概念 Definition of molecular epidemiology 分子流行病学(molecular epidemiology)是应用分子生物学的基本理论和技术，研究疾病或健康的人群现象。它从分子水平揭示影响疾病或健康分布的因素，为更有效地控制疾病和促进健康提供基因或分子水平的研究方法和防治手段。

11 Molecular epidemiology is a branch of epidemiology that combines theories and methods in both epidemiology and molecular biology. What defines molecular epidemiology, as opposed to conventional epidemiology, is its use of biological and in particular genetic markers as a measure of the propensity of developing a disease or as an indicator of a disease or an exposure in the study of the distribution and cause of disease.

12 Molecular epidemiology has the same objectives as conventional epidemiology: to study the occurrence, development and prognosis of disease, to evaluate the effectiveness of preventive and therapeutic interventions, and to provide essential evidence for clinical and healthcare decision making.

13 三、与传统流行病学的关系 Relationship between conventional and molecular epidemiology 分子流行病学就是要揭开暴露与疾病之间 的“黑匣子”之谜。

14 Conventional Epidemiology Exposure Disease Molecular Epidemiology

15 暴露标志 疾病标志 暴露 内剂量 生物学 早期生物 结构和 临床疾病 预后意义 效应剂量 学效应 功能改变 易感性标志 传统流行病学与分子流行病学的关系

16 Section two Research Content

17 一、生物标志 种类 暴露生物标志(exposure biomarker)
　　　　定义　与疾病/健康状态有关的暴露因素的生物标志 ①外暴露标志(external exposure marker , EEM ) ②内暴露标志(internal exposure marker , IEM) ③生物作用标志(biologically active marker, BAM) ㈠

18 效应生物标志(effect biomarker)
　　　定义　指宿主暴露后产生功能或结构性改变的生物标志 早期生物效应标志(early biological effect marker, EBEM) 结构和功能改变标志 (altered structure and function marker, ASFM) 病理标志(pathological marker, PM) 临床疾病标志(clinical disease marker, CDM) 健康状态标志(health condition marker, HCM)

19 易感性生物标志(susceptibility biomarker) 定义 指在暴露因素作用下，宿主对疾病发生、发展易感程度的生物标志
　定义　指在暴露因素作用下，宿主对疾病发生、发展易感程度的生物标志 　　　易感性 与宿主的遗传特征、生长发育、营养等有关。 　　宿主在不同疾病阶段，可以具有不同的易感性标志。

20 生物标志选定 生物标志的筛选 ①研究目的 ②候选生物标志特征的意义 ③检测方法的有效性

21 生物标志特性 ①分子特性 ②时相特性 ③个体内变异 ④个体间变异 ⑤群体间变异 ⑥储存变异

22 检测方法 ①实用性 ②可信性 ③有效性 灵敏度、特异度

23 常用的生物标志 传染病生物标志 表16-1 传染病研究常用的生物标志 类别 生物标志 意义 病原体核酸
病毒和细菌DNA、RNA, 质粒DNA、噬菌体DNA、转座子DNA，病原体基因多态性等 病原体特征研究，病原体分类、检定，传染源、传播途径确定，耐药检测及机制研究，人群感染状况等 病原体蛋白 病原体特异蛋白（包括酶蛋白）结构、表达量及功能活性 同上 病原体抗原 蛋白抗原，多糖抗原，脂类抗原 病原体分类、检定，传染源、传播途径确定，人群感染状况等 人体血清抗体 血清IgG、IgM等 人群感染状况、免疫水平，疫苗接种效果评价等 人体基因组 基因结构、表达、调控，基因多态性 机体易感性

24 慢性非传染病的生物标志 表16-2 慢性非传染性疾病常用的生物标志 类别 生物标志 意义 核酸类
基因组、癌基因、抗癌基因、修复基因、酶代谢基因结构、功能及多态性，mRNA；病原体DNA、RNA等 疾病诊断及分布，疾病易感性、环境危险因素研究，健康状态评价，人类学研究等 蛋白类 蛋白质结构、表达量及功能活性 疾病诊断及分布，疾病易感性、环境危险因素研究，健康状态评价等 酶类 酶的结构、表达量及功能活性 同上 抗原抗体类 疾病特异抗原、抗体 疾病诊断及分布，疾病易感性，环境危险因素研究等 其他类 糖类、脂类、激素类、多胺类、细胞因子类等 疾病诊断及分布，病因研究，疾病易感性，健康状态评价

25 二、暴露测量 外暴露研究 检测鉴定生物性病原因子 流感嗜血杆菌 研究病原生物进化变异规律 o157大肠杆菌
检测鉴定生物性病原因子 流感嗜血杆菌 研究病原生物进化变异规律 o157大肠杆菌 确定传播途径 S.munchen菌感染 测量非生物性因素暴露 吸烟烟雾

26 内暴露研究 传染性疾病 ①人体感染状况 ②追踪传染源 慢性非传染病 ①内暴露水平 ②生物作用水平

27 三、效应测量 传染病 慢性非传染病 健康状态 免疫效应 病理性效应 基因表达和代谢异常 基因突变或染色体畸变

28 四、易感性测量 遗传性疾病 Huntington病应用分子流行病学方法很快确定了HD基因紧密连锁遗传位点D4S10及其DNA标志 慢性非传染病 载脂蛋白E(apoE)不同基因型在动脉粥样硬化和冠心病发病中易感性不同 传染病 不同基因特征的人群对HIV的易感性差异很大

29 五、疾病防治效果评价 传染病 预防接种效果评价 预防接种相关疾病研究 慢性非传染病 潜隐期长 多影响因素

30 Section three Research methods

31 一、生物标志的确定与标本采集 Determination of biomarkers and collection of specimens （一）生物标志的确定(determination of biomarkers) 生物标志(biomarker)分为三大类，即暴露标志(exposure marker)、效应标志(effect marker)和易感标志(susceptibility marker)。 这三类标志只不过是些笼统指标，具体到某一种 疾病或健康状况，应根据研究内容与目的确定与之密 切相关连的具体标志。

32 1.暴露标志的选择 (selection of exposure markers)
应选择那些最具代表暴露剂量而又十分客观、稳定、敏感、特异的标志。 暴露标志是指那些与疾病或健康有关的暴露因素的 生物标志，包括外暴露标志和内暴露标志。 外暴露标志(external exposure marker)：暴露因素进入机体之前的标志，如病毒、细菌、支原体等微生物及毒素、粉尘、烟雾、化学致癌物等。 内暴露标志(internal exposure marker) ：暴露因素进入机体之后的标志。

33 2.效应标志的选择 (selection of effect markers)
机体在暴露于有关危险因子以后到疾病发生这期间，会产生与之相对应的生物学效应(biological effect)或称为生物学反应 (biological response)。因此，可以产生功能性或结构性变化的生物标志，如发生变异的基因、产生的特异性产物等。 应选择那些最能代表生物学效应实际情况的标志，且同样应具特异、敏感、简便等优点。

34 3.易感标志的选择 (Selection of susceptibility marker)
易感标志是指机体对疾病发生、发展易感程度的生物标志。 在确定易感人群时，通常选择免疫学指标和 易感基因作为易感测定标志。

35 （二）标本的采集(Collection of specimens)
标本的采集、运送和储存是实验室分析 的第一步，也是很关键的一步。为了采集高 质量的标本，应注意以下几个问题：

36 1.采集最适标本 (Collection of optimal specimens)
首要问题是有的放矢，一般根据已有流行病 学资料和疾病的临床表现进行分析，初步推断可 能是哪类疾病，再根据发病规律和病程决定采集 何种标本。可以从以下几个方面考虑取材部位： ①从病原体入侵部位取材； ②从病原体感染的靶器官取材； ③根据病原体的排泄途径取材； ④非传染性疾病主要从受损组织取材或其它 能反映效应指标的标本； ⑤直接采集病原标本。 此外，根据疾病的种类、病情采集标本。有 的疾病需要在发病的早期采集标本，有的则需要 在早期和晚期采集标本。

37 常采集的标本有： 病原体标本； 体液标本，如血液、尿液、胃液、精液、 分泌物等； 组织标本，如机体各种组织、毛发、 媒介体等。

38 2.标本的运送与储存 (Transport and storage
of specimens) 标本采集后应尽快送往实验室，马上检测最好， 如不能马上进行应注意适当保存。根据情况可采取 冷冻、冷藏运输，以保持活性。 采集的标本应放入适当的容器，以不易损坏和 泄漏，特别是烈性病原体标本，应加金属套罐，派 专人专车运送。 采集的标本除了防止扩散，也应防止被污染包 括生物性的、化学的或其它标本的污染。 采集的标本储存后应不影响检测结果，即在任 何时间检测都可获得一致的结果。 所有的标本都应有详细的记录和标签等。

39 二、常用实验室方法(Common lab methods)
（一）核酸研究方法(Research methods of nucleic acid) 随着分子生物学和分子遗传学的发展，人们 清楚地了解到生物的任何性状（表型）是由于其 本身的遗传物质 —— 核酸（DNA或RNA）所决 定的。对于核酸的分析最能客观地反映各种生物 现象（效应）的本质。

40 1.核酸中碱基含量的测定 (Assay of basyl content in nucleic acid)
常用的是G+C含量的测定。亲缘关系近的 病原体，它们的G+C含量相同或近似，亲缘关 系远的病原体，它们的含量不同。 因此，可用于传染病传染源和传播途径的 分析。但在某些情况下，G+C含量相同或近似 的病原体其亲缘关系不一定近似。因为上述分 析只反映了核酸的核苷酸组成，并不能反映核 苷酸序列。

41 2.核酸电泳和限制性内切酶图谱分析 (Nucleic acid electrophoresis and restriction enzyme analysis)
某些病原体，如引起腹泻的轮状病毒，它们的核酸是分节段的，直接提取核酸即可进行琼脂糖凝胶电泳，产生特定的电泳带，每一型的轮状病毒的电泳带具有特定的数目和大小、分布特征等。 其它大多数病原体或生物标本的核酸，可用限制性内切酶酶切消化以后，再进行电泳分析，不同的病原体或生物标本产生不同电泳图谱。

42 图2 T-A克隆后酶切鉴定结果 Fig 2 Enzyme digestion analysis of T-A control clone fragment of JR23 strain

43 3.核酸杂交 (nucleic acid hybridyzation)
核酸杂交需要一个探针(probe)，即一种标有示踪 分子的特异单链 DNA 或 RNA分子，这种探针 可与待测标本中的特异性序列结合。 常用于生物标本中病原体特异核苷酸序列 的检测。 常用的有斑点杂交、原位杂交、转印杂交 等方法。

44 4.寡核苷酸指纹图 (oligonucleotide finger printing)
病原体或生物标本的核酸经特定的酶消化 后，可进行双向电泳，然后再进行放射自显影， 显示出一定的图谱特征，称为指纹图 (finger printing)。此图谱具有特异性。 常用于微生物同源性分析。

45 5.质粒图谱分析(plasmid figure analysis)
不同的细菌的质粒DNA不同，因此可对 质粒DNA进行酶切反应、电泳、图谱分析。 常用于微生物同源性分析。

46 6. PCR(polymerase chain reaction)
体外基因DNA扩增技术，需要一对寡核苷酸引 物（上游和下游各一），在耐热的DNA多聚酶 的作用下，合成特异的DNA序列，包括高温变 性、低温退火、中温引物延伸三个步骤，这三 个步骤反复循环，在短时间内可扩增至几百万 倍。 此法具有高度特异、敏感、快速、简便等 优点。 常用于基因扩增、克隆、标本中特异性核 苷酸序列检测等。

47 7. DNA序列分析 (DNA sequencing)
氧末端终止法。由于与计算机相结合产生了自 动化分析仪，使核酸序列分析变得非常简便、 快速、准确、可靠。 该方法是所有核酸分析技术中最可靠的一 种方法，可用于任何来源的两个或多个DNA片 段之间核苷酸序列的比较。 所以，是追踪传染源、分析传播途径、阐 明流行规律十分可靠的分子流行病学方法。

48 8.单链构象多态性分析 ( single-stranded
conformation polymorphism,SSCP) 是将基因扩增产物变性为单链核酸，然后 进行非变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）， 观察区带的迁移率。由于迁移率与核酸的构象 密切相关，只有一个核苷酸的突变就可以改变 分子构象，因而表现在电泳迁移率上的差别。 此法可以检测基因突变。但不能确定基因 变异的位点及方式，最后还需要进行序列测定。 SSCP可用于病原体和生物标本的研究。

49 此技术可随意在克隆的基因上进行突变，然后测量突变后基因功能的改变。常用于基因结构与功能的研究。
9.基因定点突变技术 (Site-directed mutagenesis) 此技术可随意在克隆的基因上进行突变，然后测量突变后基因功能的改变。常用于基因结构与功能的研究。

50 （二）蛋白质研究方法(Research methods
of proteins) 只要有蛋白质在，就有基因在，蛋白质是 基因表达的产物，几乎所有生物体都具有蛋白 质，包括结构蛋白和功能蛋白。对蛋白质进行 研究分析，实际上是间接地对其相对应的基因 进行分析，因为蛋白质的氨基酸（aa）顺序是 由相对应的核苷酸顺序决定的，因此蛋白质分 析也具有特异性。 蛋白质技术包括PAGE、肽图分析(peptide mapping)、转印技术、色谱技术、测序技术等。

51 （三）酶学技术(Enzymatic techniques)
大多数酶属于蛋白质，因此可以用分离 蛋白质的方法分离酶，并可在特定条件下定 性、定量测定其活性，同样也可以测其分子 量。

52 （四）免疫学技术(Immunological techniques)
分子流行病学的研究中，常用分子免疫学 标记技术，如酶标记（EIA）、荧光标记（FIA）、 放射标记（RIA）三大标记技术。 单克隆抗体（McAb）技术的应用为免疫学 技术开辟了新的天地，不仅可以用于疾病的诊、 治，还可用于病原体同源性分析等。

53 （五）生物芯片技术(Biochip techniques)
按照芯片上固化的生物材料的不同，可以将生物芯片划分为基因芯片、蛋白质芯片、细胞芯片和组织芯片。与传统的仪器检测相比，生物芯片有高通量、微型化、自动化、成本低、防污染等优点。目前最成功的是基因芯片。

54 （六）其他技术(other techniques)
分子流行病学应用的实验室技术很多，除了上述介绍的技术外，还有各种色谱技术、毛细管电泳技术、其他理化分析等实验室技术。 当然分子流行病学研究方法也离不开传统流行病学的现场流行病学研究方法，即描述性、分析性、干预性研究等（见有关章节）。传统流行病学研究方法结合生物学标志检测，从分子或基因水平更深一层次揭示病因、致病机制等，是当前常用的分子流行病学研究模式。

55 三、研究设计要点(Key points for research design)
分子流行病学研究设计，是在传统流行病学研究设计 的原理和模式的基础上，再考虑分子生物学技术或生物学 标志的应用带来的有关问题。 生物学标志是指代表生物生理、组织、细胞、亚细胞 以及大分子的可识别物质。如前所述，分子流行病学就是 要揭开暴露与疾病之间的“黑匣子”之谜。 因此，在进行分子流行病学研究设计时，首先应按照 传统流行病学研究设计的一般要求，如明确的研究目的， 选择有代表性的样本及数量，各种对照组的设置，对照组 和实验组的可比性、方法的准确性、合适的资料统计分析 方法、偏倚的控制等。 这些是流行病学研究的最基本要点，如果脱离这些要 点，即使在研究中使用了先进的实验室技术，也得不到准 确的研究结果。

56 以下几点供进行分子流行病学研究设计时参考。
（一）明确研究目的 进行研究设计时首先要明确该研究要解决的问题， 确实做到有的放矢。 （二）选择客观准确的测定指标 研究中所选择的各种“标志”，必须是客观的、稳 定的和有代表性的测定指标，并且容易检测到。 生物学标志的选择是否恰当，决定着分子流行病 学研究的成败。

57 （三）选择科学的测定方法 所选择的测定方法应结合实验室条件，使用简便 快速、成熟可靠、被公认的测定方法。应用新的测定 方法时，应注意所得结果和其他方法所得结果的可比 性。 （四）研究模式的选择 流行病学研究设计模式一般分为描述流行病学、 分析流行病学和实验流行病学研究模式。不论那种研 究模式，都可以引入分子生物学理论和技术，构成分 子流行病学研究。 实验中应根据实际情况选择适当的研究模式。

58 （五）样本的选择 样本的选择是任何流行病学研究中不可避免的问题， 分子流行病学研究样本的选择其原理和方法与一般流行 病学研究设计相同，但对分子流行病学来说，样本及其 大小的选择难度更大一点。要特别注意样本来源的地区、 人群、遗传因素和环境因素的交互作用。 （六）质量控制 质量控制是分子流行病学研究设计中一个重要部分， 它直接关系到所得结果的准确性、可靠性、科学性和可 信性。

59 1.一般性实验质量控制 ①确定标本采集方案：包括采集部位、时间及方法； 标本采集后的贮存问题等； ②药品和试剂的选择：同一测定指标最好使用同一 批号的药品和试剂。更换批号时应进行对比和标准化； ③实验方法的确定：对于同一种生物标志的测定要 用统一的方法； ④仪器设备的确定：如无特殊情况，不要更换仪器。 调校后一般不应重新调校； ⑤操作要规范化：每一实验步骤都要规范化，保证 同一操作者或操作者之间的可重复性。

60 2.设立多种对照 实验开始前就应设立好对照，一般应设以下对照： ①标准对照（阳性对照）：是指含有待测或某种生物 标志，并已知其含量的生物标本； ②空白对照（阴性对照）：是指不含待测或某种生物 标志的生物标本； ③重复对照（相关对照）：是指来源于同一份待测生 物标本具有不同编号的多份生物标本或与待测生物标本有 关系的生物标本。

61 3.预实验 正式实验开始前应进行预实验，确保所用方法的 可重复性。一般包括本实验室内和实验室之间不同操 作者之间的交叉重复实验等。   误差、偏倚的控制 分子生物学技术虽然敏感、精确，但导致误差、 偏倚的因素也很多。包括: ①检测者本身、试剂、药品、材料、仪器等； ②同一受检者的生理生化变化； ③人群中的生物遗传学差异等方面。 应针对具体环节制定详细的质控方法。

62 （七）分析与总结 (Analyses and summary)
在研究设计中要预测研究结果，事先确定 明确的资料统计分析方法，并拟定资料的总结、 分析与报告的详细计划。

63 Common lab techniques

64 正确应用实验技术是分子流行病学研究成功的关键。
（一）生物标本中核酸的提取(Extraction of nucleic acid from biospecimens) 核酸携带有生物体的遗传物质，是生物体细胞的重要 组成成分。 基因分型、变异分析、多态性分析、基因序列分析等 是分子流行病学研究中非常重要的手段之一。但在进行这 些分析之前，首先要提取和纯化核酸。

65 1. DNA的提取(Extraction of DNA)
通过破坏细胞质和细胞核膜后，再除去蛋白质 可获得基因组DNA。 基本过程： （1）在EDTA和变性剂存在下加入蛋白酶K消 化除去蛋白质； （2）用 RNA 酶除去 RNA； （3）用酚和氯仿抽提 DNA； （4）用乙醇和异丙醇把 DNA从溶液中离心沉 淀出来。

66 2. RNA的提取 (Extraction of RNA)
①裂解细胞； ②除去蛋白质； ③提取核酸混合物； ④将RNA与DNA分离。

67 （二）质粒DNA的提取(Extraction of plasmid DNA)
一般首先培养足够量的细菌，先将所研究的 质粒 DNA 转化感受态细菌，然后进行克隆，培 养扩增一定量后，提取质粒DNA进行其它分析。 提取方法很多，其共同点是： ①离心沉淀细菌； ②裂解细菌； ③除去细菌残壁、染色体DNA、RNA； ④异丙醇沉淀质粒DNA。 实际应用中，有小量提取法和大量提取法之 分。

68 （三）DNA限制性内切酶酶切技术 (Restriction endonuclease technique of DNA) 限制性内切酶(restriction endonuclease)是一类 能识别双链 DNA 分子中特异核苷酸序列的 DNA 水 解酶，是基因工程、基因诊断、DNA序列分析中常 用的工具酶。 因此，内切酶酶切技术是基因分子生物学中最 基本、最重要的技术。 限制性内切酶主要来自于原核细胞，每种酶都 有自己特定的反应条件如缓冲液、反应温度、作用 时间等，根据研究目的可选用小量酶解反应，大量 酶解反应和双酶解反应等。然后进行琼脂糖凝胶电 泳，对酶切产物（DNA片段）进行鉴定分析。

69 表1 限制性内切酶酶切反应的一般条件 条件 反应类型 小量(分析用) 大量(制备用) 反应体积 20 μl 根据需要 DNA量 μg 酶用量 1-2u/μg DNA 10x缓冲液 2μl 牛血清白蛋白 100 μg/ml 反应温度 反应时间 2 h 2 h(可适当延长)

70 （四）DNA重组技术(Recombination techniques
of DNA DNA重组（DNA recombination)是指将两个基 因（或 DNA 片段）经内切酶消化切割，互相交换 连接形成新的DNA片段的过程。 常将目的基因插入质粒 DNA 载体之中，进行 基因重组，基因定点突变分析，结构与功能关系的 研究，其功能往往是通过基因表达来测定的。 DNA重组的方法主要有粘端连接法、平端连 接法和平-粘连接法。具体采用何种方法，要根据 目的基因末端的性质、载体 DNA 经内切酶切割后 的性质来选择应用。

71 粘端连接法有两种情况，主要取决于目的DNA粘端的性质。
1.粘端连接法 粘端连接法有两种情况，主要取决于目的DNA粘端的性质。 ①目的DNA两端为相同的粘性末端：带有相同粘性末端的目的DNA可以克隆到具有匹配的相同粘性末端的 线性质粒DNA中。 优点：目的DNA和质粒DNA连接处的酶切位点仍然保留。 缺点：质粒DNA容易自身环化，重组体可能带有目 的DNA的串联拷贝，目的DNA可能反方向插入。

72

73 ②目的DNA两端为非互补的粘性末端：用两种不同的
DNA 片段。用同样的两种酶将质粒 DNA 切开，这样载体 DNA末端和目的DNA末端完全互补，在DNA连接酶的作用 下，二者就可形成重组体。 此法的优点是： ① 原酶切位点仍然保留； ②目的DNA只以一个方向插入至质粒DNA中，故此法 称为定向克隆； ③载体DNA末端不互补，不能自身环化。

74 端，也称顿性末端。有些情况下，目的 DNA 虽经内切酶切割产生粘性末端，但在载体DNA 上找不到与之相匹配的酶切位点，这种情况下
2.平端连接法 某些内切酶不产生粘性末端，而是产生平 端，也称顿性末端。有些情况下，目的 DNA 虽经内切酶切割产生粘性末端，但在载体DNA 上找不到与之相匹配的酶切位点，这种情况下 需将二者或其中之一的粘性末端补平，再采用 平端连接法连接。

75 ①平接法：目的DNA和载体DNA的平端或粘性
②接头法：此法是利用核酸化学合成技术，合 成一种含有特定酶切位点的双链DNA片段（称为接 头），再用DNA连接酶将接头连接到目的DNA的两 端，然后用该内切酶切割成能与载体DNA粘性末端 互补的粘性末端，最后将二者连接。 此法适用于没有所需内切酶位点的目的DNA。

76

77 3.平-粘连接法 此法在目的DNA和载体DNA只有一个匹配 酶切位点，又要考虑目的DNA插入方向时使用， 也属于定向克隆。此法优点是单方向插入，非 重组体克隆背景低。 上述各种方法建立的重组质粒DNA是否成 功需要鉴定。 常用方法有： ①互补； ②插入失活； ③菌落原位杂交； ④限制性内切酶分析； ⑤DNA序列分析。 实验中可根据具体情况来选择鉴定方法。

78 （五）DNA的凝胶电泳(Gel electrophoresis of DNA)
电泳技术是分子生物学领域中常用的实验技术。 常用琼脂糖凝胶电泳和PAGE或SDS-PAGE分离、 鉴定、纯化DNA或RNA。 此法具有简便、快速、分辨率高等优点，并可 将分离片段（电泳带）从凝胶中回收用于 DNA 重 组或克隆。

79 1.琼脂糖凝胶电泳 (Agarose gel electrophoresis)
琼脂糖加热至90℃-100℃即可熔化成透明液 体，浇到电泳槽内，冷却后即可形成凝胶，用于 电泳，常用TAE作为电泳缓冲液。 电泳时根据DNA片段大小确定凝胶浓度，一 般用 %。一般检测鉴定时，用常规琼脂糖 凝胶电泳，要想从凝胶中回收DNA，需要低熔点 琼脂糖凝胶电泳，若要分析单链DNA，需要碱性 琼脂糖凝胶电泳。

80 图 3 pBSK+-NDV HN DNA琼脂糖凝胶电泳
1：Marker；2,3,5,6,9,10,12：突变株；4,7,8,11：野毒株

81 2.聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel
electrophoresis, PAGE PAGE分两种： ①非变性PAGE：非变性PAGE用于分离纯 化双链DNA片段，缺点是不能测定DNA的大小， 因为迁移率受碱基组成和序列的影响，同样大 小的DNA片段由于空间结构不同，其迁移率出 现差异。 ②变性PAGE：变性PAGE用于分离和纯化 单链DNA片段，DNA的迁移率与碱基组成和序 列有关，可用于DNA序列分析，分离同位素标 记的探针等。

82 图 4 风疹病毒E1基因表达产物SDS-PAGE （上清，考马斯亮蓝染色） 1: Negative control GS115
图 4 风疹病毒E1基因表达产物SDS-PAGE （上清，考马斯亮蓝染色） 1: Negative control GS115 2: Plasmid control pGAPZαA 3: Low range protein marker 4: Expression strain 1 5: Expression strain 2

83 3.从凝胶中回收和纯化DNA (Recovery from gel and purificaiton of DNA) 在进行基因克隆、重组、探针标记等实验 中，需要从凝胶中回收DNA，回收的方法有： 低熔点琼脂糖法 压碎浸泡法 透析袋洗脱法 DEAE-纤维素膜法等。 上述每种方法均有各自的使用范围、回收 率和特点，应根据情况选择合适的回收方法。

84 （六）核酸杂交(Nucleic acid hybridization)
据DNA碱基互补配对原理，先制备一条带有 标记的多核苷酸链作为探针,检测标本中与之相对 应的那条互补链，称为核酸杂交 ( nucleic acid hybridization)。 核酸杂交技术具有高度特异性，广泛用于对 待测DNA或RNA进行定性和半定量分析。

85 核酸探针分为基因组DNA探针、cDNA探针、
cRNA探针及人工合成的寡核苷酸探针等。实验 时根据研究目的选择不同类型的探针。探针需用 标记物标记。 标记物一般分为放射性标记和非放射性标记。 两种标记方法各有优缺点，放射性标记灵敏度和 特异性高，但应用不当时放射性物质易造成环境 污染和人体损害，同时也比较昂贵。 所以，近年来非放射性标记方法越来越多， 并不断完善。放射性标记物有3H，14C，32P，35S， 125I，131I等。非放射性标记物有生物素(biotin)、 地高辛(digoxigenin，Dig)、荧光素(fluorescin)、 标记金属等。

86 核酸杂交方法很多，如： 斑点杂交(dot hybridization) 原位杂交(In-situ hybridization) Southern杂交(Southern hybridization) Northern杂交(Northern hybridization)等。

87 （七）聚合酶链反应(polymerase chain
reaction, PCR PCR 技术在分子流行病学研究中具有非常 重要的地位。已被广泛地应用于体外基因扩增、 基因诊断、基因克隆、基因序列分析、基因定点 突变分析等。 优点是简便、快速、灵敏等。 缺点是实验室污染问题，易出现假阳性。

88 基本原理是： 根据待测基因两端设计一对引物，即上游引物 和下游引物，在标本中模板存在的情况下，耐热 DNA聚合酶可利用四种dNTP使引物沿着模板延伸。 整个过程可分为三个步骤： ①变性94-97℃ 30-50S； ②退火25-65℃ 60-90S； ③延伸70-74℃ S。 一般重复25-30个循环，即可进行琼脂糖凝胶电 泳。用杂交、PCR-SSCP、序列分析等对扩增产物进 行分析。 PCR技术不断发展和完善，并产生了一些改良 的PCR方法，如定量PCR、原位PCR、RT-PCR、 免疫PCR等等。

89 （八）DNA序列分析(DNA sequencing)
分析、突变株检测等研究的重要手段。测序方法很 多，常用的是双脱氧末端终止法。 基本原理： 特异性引物和DNA模板相退火，在DNA聚合酶作 用下进行延伸反应，在双脱氧核苷三磷酸（ddNTP） 作用下进行特异性链的终止，然后用PAGE区分长度 相差一个核苷酸（nt）的DNA，通过一定的显示阅读 nt序列。 目前测序工作已与计算机相结合，趋向于自动化， 因此大量测序仪应运而生，并得到广泛应用。

90 固定末端 ACGTTGCACGTA “A”反应 “C”反应 “G”反应 “T”反应 A AC ACG ACGT ACGTTGCA ACGTTGC ACGTTG ACGTT ACGTTGCACGTA ACGTTGCAC ACGTTGCACG ACGTTGCACGT

91

92 PAGE： A C G T DNA序列测定基本原理示意图 — ACGTTGCACGTA — ACGTTGCACGT — ACGTTGCACG

93

94 （九）蛋白质的SDS-PAGE及肽图分析(SDS-PAGE of proteins and peptide analysis)
不同的蛋白质由于肽链中氨基酸组成不同，其 所带电荷的性质和数量有差异，构象也不同。因此， 当分子量相同的两种蛋白质进行PAGE时，它们的 迁移率可能有很大差异。 当在样品中加入 SDS 和2-ME时，2-ME能使蛋白质分子中的二硫键还原；SDS能使蛋白质分子的氢键、疏水键打开，并结合到蛋白质分子上，形成蛋白质-SDS复合物。由于SDS带有大量的负电荷，它的量远远超过蛋白质自身的电荷量，使蛋白质-SDS复合物带有相同密度的负电荷。因此，消除了不同蛋白质间原有电荷的影响。

95 SDS与蛋白质结合还能使蛋白质构象发生改
为18A，而长轴则随蛋白质分子量成正比地变化。 这样电泳时不再受蛋白质原有电荷和形状的影响， 迁移率只与蛋白质分子量有关，就能测定样品中 的各蛋白数目和分子量（MW）。 蛋白质MW与相对迁移率呈反比。相对迁移 率=样品迁移距离（cm）/溴酚蓝迁移距离（cm）。 根据标准蛋白制备标准曲线：一般用5种已知分子 量的蛋白。估计待测样品蛋白分子量在这5种标准 蛋白范围之内，使结果会更准确。

96 MW 测定蛋白质分子量标准曲线简图

97 2.肽图分析 SDS-PAGE所得到的电泳条带可以进一步分析 其氨基酸构成。基本原理：将SDS-PAGE的蛋白带 切下，用125I标记。用胰蛋白酶消化125I然后进行电 泳和层析，经放射自显影后，可得到特征性的图谱， 称为肽图(peptide mapping)。 肽图的差异反映底物蛋白质的氨基酸残基顺序 的不同，当然这种差异最终是由基因结构的不同所 决定的。 肽图分析可用于分析蛋白质的一级结构、抗原 变异、基因结构比较、病毒分型等。

98 （十）细胞转化与转染技术 Cell transformation and transfection techniques
我们习惯将质粒DNA导入细菌细胞内，称为 转化(transformation)。将质粒DNA导入真核细胞 内称为转染（transfection)。 1.转化 当获得新的质粒DNA或重组体时需要 转化到宿主菌体内，进一步扩增，以便获取大量 DNA进行进一步研究。 转化的方法有多种，常用CaCl2法。CaCl2处 理细菌后，细胞壁细胞膜结构发生改变，使质粒 DNA从细胞外导入细胞内。将转化反应物（内含 已转化的和未转化的细菌）涂到选择性培养皿上， 转化成功的细菌能在抗性培养基上生长形成菌落。

99 2.转染 转染技术已广泛用于生物学、医学等各 个领域，主要用于基因结构与构成的研究，基因表 达与调控的研究，基因治疗与转基因动植物的研究 等等。 细胞转染的方法有多种，如脂质体介导转染法、 电击法、DEAE葡聚糖介导法、磷酸钙介导法等。 其中脂质体法较常用，脂质体介导转染法转染效率 是磷酸钙法的几十倍，甚至上百倍，并具有广谱、 操作使用简便的优势。 脂质体试剂Lipofectin或Lopofectamine能与靶 DNA的磷酸骨架结合而生成的复合物能轻易通过细 胞膜进入细胞内，完成转染过程。

100 （十一）基因定点突变分析(Site-directed mutagenesis)
1.模板(template)：含有待突变的DNA重组载体，通常为单链； 2.引物(primer)：含突变位点； 3.突变反应(mutagenesis)：新合成的一股，含突变位点； 4.克隆突变株(cloning of mutant)：转化大肠杆菌，挑选突变株； 5.纯化DNA(purification of DNA)：微量法； 6.转染与表达(transfection and expression)：选择合适的表达系统； 7.功能测定(functional assay)：依研究目的而定。

101 （十二）生物芯片技术(Biochip techniques)
如前所述，基因芯片技术是生物芯片技术中最成熟的一种。实验技术主要包括一下步骤： 1.芯片制备 以玻璃片或硅片为载体，采用原位合成和微矩阵的方法将基因探针排列在载体上。 2.样品制备 检测样品往往复杂、量少，需要提取扩增，然后荧光标记以提高灵敏度和使用者的安全性。 3.杂交反应 选择合适的反应条件使荧光标记的样品与芯片上的探针反应，产生一系列信号。 4.信号检测与结果分析 芯片上的各反应点的荧光位置、强弱经过芯片扫描仪和相关软件可将荧光转换成数据，即可获得有关生物信息。

102 存在问题： 1.特异性尚需提高； 2.操作简便化需要提高； 3.增加信号检测灵敏度； 4.提高集成化程度。 前景： 尽管存在问题，但与其它检测方法相比，优势明显，在很多领域有独特优势，随着研究的深入和不断完善，基因芯片技术将为我们提供一条认识生命本质的捷径。 基因结构决定物种，基因功能决定生命的话，那么基因芯片就是帮助我们认识生命。

103 除了上述常用分子生物学方法外，分子流行 病学中还常用到血清学方法和免疫学方法。如各 种沉淀反应、各种凝集反应、ELISA、免疫荧光 技术、放射免疫技术、免疫细胞的分离纯化、细 胞表面标记检测方法、免疫细胞增殖试验、免疫 细胞杀伤试验、各种细胞因子的活性检测等等。 关于这些方法的原理、操作等可参考有关书籍。

104 Utilization of molecular epidemiology
Section four Utilization of molecular epidemiology

105 一、病因探讨(Probe for cause of a disease)
  （一）对生物病因的研究(Study on biological cause of a disease) 由于抗生素、疫苗、药物的开发和应用，许多 由生物因素引起的传染性疾病得到控制，个别疾病 如天花已在全球范围内被消灭。但原危害严重的疾 病如结核仍然存在，并继续危害人类健康。另外， 一些新的传染性疾病也不断出现，如愈演愈烈的艾 滋病(acquired immunodeficiency syndrome, AIDS) 等。 分子流行病学对诸如AIDS的病原体---人类免 疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus, HIV) 等病原体的分子结构，特别是基因结构与功能、分 型和鉴定、检测等方面做出了不可磨灭的贡献。

106 （二）对非生物性病因的研究(Study on non-biological cause of a disease)
非生物性致病因素在日常生活中也常常遇到。暴 露于危险因子是疾病的开始，也是一级预防的理论基 础。 非生物性致病因素主要包括各种物理和化学因素， 如各种射线、温度、湿度、高空作业、化学物质或药 物等，暴露于这些因素后对宿主基因有何影响？产生 何种效应？ 例如，亚硝酸盐类化合物与胃癌有关，但到底亚 硝酸盐类如何作用于胃部细胞基因，如何诱发癌变， 哪些人群更易感等问题，都需要用分子流行病学手段 从基因水平入手，解决上述问题。

107 二、危险因素评价(Evaluation of risk factors)
  与人类疾病或健康有关的危险因素有许多。 例如，肿瘤病毒(oncovirus)能诱发肿瘤，风疹 病毒和巨细胞病毒等病毒能由母体传给胎儿，造 成胎儿宫内感染，严重的可导致胎儿畸形，或 死产、流产。 这些因素在人群中危害程度有多大，诱发 肿瘤或畸形的发生概率如何等，都需要用分子 流行病学方法加以解决。

108 对于生物性危险因素，首先我们应了解它的生
物标志(biomarker)分布情况，在机体内产生何种生 物效应，以便提出防治对策。 对非生物性危险因素，我们应了解机体暴露后， 产生的生物效应如何？对不同人群危害程度有多大？ 如何确定高危人群？也需要从基因入手。 例如，亚硝胺盐类致癌是在抑癌基因失活的基 础上发生的？还是在癌基因异常活跃的情况下发挥 致癌作用的，还是两种基因均异常才有作用。要弄 清楚这些问题就必须对有关基因进行分析研究。

109 有些疾病有家庭（族）“集聚性”，如同处于相
似生活环境之下，有的家族癌症发生率极高，即使 其家庭成员生活在不同的地域，仍然有高的发生癌 症的危险性，如果分析其基因型，肯定会存在某种 遗传缺陷，当暴露于某种致病因子时显得非常 “ 脆 弱”，易诱发癌症。 某种基因缺陷也是一种危险因素，而且容易被 忽视。“人类基因组计划”(human genome project)完 成以后，许多此类危险因素将被“揭密”。

110 三、致病因子致病机理探讨(Study on pathogenesis mechanisms of pathogenic agents)
  分子流行病学无论是对传染病还是一些慢性 疾病发生、发展的研究都具有特殊意义。以肿瘤 为例，肿瘤是当今所有疾病中病死率、死亡率均 位于前列的疾病，致病因素复杂，是当今世界范 围研究热点之一。 分子水平研究发现，不管何种致癌物其诱导 癌变的过程均有其某些共性。

111 首先是诱变作用（mutagenisis)，致癌物进入体内
作用于有关正常细胞，影响抑癌基因的正常功能，或 激活癌基因。 其次是癌变启动（initiation)，致癌物作用于抑癌 基因和癌基因，导致细胞的正常调控机制紊乱； 第三，细胞的调控机制被打乱，细胞发生转化（transformation)，转化的细胞如果逃逸机体免疫系 统监视、清除、就会无限分裂繁殖下去； 第四，肿瘤开始形成，并迅速增大； 第五，当肿瘤发展到一定程度时，机体生理功能 受损，开始出现临床症状，并可出现扩散。

112 上述几个阶段，不同类型肿瘤可出现很大差 异，同一肿瘤也可因机体免疫状况的差异及基因 受损的程度不同，各个阶段持续时间也可不同。 当了解了疾病的发生发展过程后，就会有针对性 采取各种相应的防治措施，包括： 避免暴露于致病因子（一级预防）； 暴露后除了采取措施阻断致癌因子的作用外， 还可以监控，做出早期诊断（二级预防）； 肿瘤形成后，除了有效的治疗手段，还可采 取措施防止复发和扩散等（三级预防）。

113 四、病原体变异规律探讨(Study on variation law of pathogens)
分子流行病学是对病原体变异规律研究必不可少的手段。血清库的建立为这一方面的研究提供了方便条件，因为病原体抗原变异是一个长期演变过程，是由其遗传物质和在人群免疫力选择压力之下，逐渐产生的。

114 图 5 流行性感冒病毒长期变异的血清流行病学研究
(GiEmberg etal,1980年)

115 五、人群易感性评估 Evaluation of population susceptibility   （一）对传染性疾病易感性的研究 人群对传染病的易感性包括两个方面： 1.对该病原体的特异性免疫水平 即特异性抗体水平和细胞免疫水平，以此来判 断人群对该病原体的易感程度； 2.遗传易感性 如有研究表明HLA特定抗原的分布与疟疾病例 分布和发病的严重程度有关。特异性抗体水平属于 血清流行病学内容，而传染病的遗传易感性研究则 属于分子流行病学的重要内容之一。

116 （二）非传染性疾病易感性研究 对非传染性的慢性疾病研究中发现，遗传因素起着不可忽视的作用。分子流行病学研究表明，许多非传染的慢性疾病存在着易感基因，研究得比较充分的如糖尿病易感基因等。易感群体确定以后，即可做到早期预防，早期诊断，并对治疗和预后提供依据。 例如，Duru等对血管紧张素转换酶（ACE）基因与高血压的关系进行了分子流行病学研究，证明ACE基因多态性在不同人群与原发性高血压关系不一致。非洲籍美国人、高加索人的ACE基因多态性与高血压有关联；而日本人、荷兰人以及我国彝族男性ACE基因多态性却与高血压无关联。说明不同种族对高血压易感性有差异。

117 六、疾病流行规律研究 Study on epidemic law of a disease   分子流行病学用于疾病流行规律的研究，有着 其它流行病学方法不可比拟的优点。 应用最多的还是传染病，调查分析和病原体分 离鉴定是以往分析流行规律的常用手段，曾对传染 源确定，传播途径的确定等流行规律的研究起到很 重要的作用。 但近年来经分子流行病学研究分析，上述研究 方法往往精确度不够。经常发现接触者与传染源之 间的病原体属于同一血清型，但经对有关靶基因 进行核酸序列分析表明，基因型不同，说明二者病 原体并无同源性。

118 （一）传染源追踪(Follow-up of infection source)
对于控制传染病的流行，查明传染源是首要 任务。同时对分析流行规律也是必不可少的。分 子流行病学在确定传染源方面有其独到之处。 例如，最著名的例子之一是有关美国一牙科 医生与7位HIV阳性病人的关系。 但当同源性相同时，也可能病人和医生并无 传播与被传播关系，有可能两者来源于另外一个 同一个传染源。

119 （二）确定传播途径(Determination of transmission route)
切断传播途径是预防疾病流行的重要手段。以 往传播途径或传播媒介的确定常用排除法，并结合 病原体的分离和鉴定。分子流行病学所采用的分子 生物学新技术弥补了有关缺陷。 例如，Allardet-Servent等，用内切酶图谱分析 对某医院泌尿科的一次绿脓杆菌感染爆发进行传播 途径分析，发现从患者和环境中分离的细菌各不相 同，甚至病人间分离的也不相同，从而表明医院内 感染的可能性不大。

120 （三）确定传播范围(Determination of transmission scope)
以往在疾病爆发或流行所涉及的范围确定，主要依据在这期间的有效暴露史、潜伏期长短、临床表现及实验室所能检出的生物学标志，来判断确定受累及人数和地域范围。生物学标志为表型标志，因而容易出现偏差。 分子流行病学的引入使这一问题得到解决。 例如，Taylor等（1982）对Salmonella muechen菌感染的爆发进行分子流行病学调查。 绝大部分病人有大麻暴露史 从病人家里的大麻分离到的病原菌，从表型上看与其它来源的菌株无法区分。 通过质粒图谱分析证明，所有暴露大麻有关的菌株都具有两个小分子的质粒，而对照组中没有发现这两个质粒。证明大麻是这次爆发的传播因素，其传播范围即该污染的大麻的分布范围。

121 （四）病原体同源性分析（Homogenicity analysis of pathogens
病原体同源性分析对于病原体分类、病原学 诊断与鉴别诊断、传染源追踪、传播途径的阐明、 各种环境污染源的调查等方面都具有非常重要的 意义。 所谓同源性(homogenicity)是指从不同地区、 不同时间得到的不同标本中独立分离出的病原体 具有相同的特性，因此我们判断它们来自同源。 这种相同特性包括表型和基因型。表型往往以病 原学、血清学、免疫学方法即可解决，而基因型 分析则依靠分子流行病学方法。

122 七、疾病防制措施研究及其效果评价 Study on measures for prevention and control of a disease and evaluation for their effectiveness   （一）传染病的防制及效果评价 分子流行病学方法对传染源的确定，传播途径的阐明，传播媒介和易感人群的确立更加准确，因而据此提出的防制措施更加富有针对性，效果也更好。

123 例如，传染病的防制最有效的手段是疫苗预防。
现在疫苗的种类不断增多，如灭活疫苗（死疫苗）、 减毒活疫苗、亚单位疫苗、基因疫苗等，接种途径和手段更趋简便、快速。 目前，应用最多的还是减毒活疫苗，此疫苗的优点是接种剂量小，免疫应答持续时间长，所以免疫效果较好。缺点是偶尔可引起与野毒株相同的疾病。 因此，在区别是由野毒株还是由疫苗株引起的疾病时，就必须应用分子流行病学方法加以证实，从而对疫苗免疫效果做出准确评价。

124 （二）非传染性疾病的防制及效果评价 如前所述，分子流行病学研究从暴露到疾病 发生的各个环节。因此，对慢性非传染病的三级 预防开辟了更广阔的应用前景。 如本节第三部分谈到的，肿瘤的发生可人为 地分为几个阶段：诱导阶段——起始阶段—— 转化阶段——形成阶段——临床阶段。 当了解这些主要阶段之后，可以有针对性采 取预防措施，尤其是1、2级预防，并可以根据不 同阶段的持续时间，采取防范措施。如避免暴露， 阻断致癌因子的诱导作用，抑制癌变启始，早期 诊断，早期治疗，防止复发和扩散等。 对上述措施的效果评价，也均需应用分子流 行病学的方法。

125 Section five Example for molecular epidemiology

126 一、研究题目与目的 Title and objectives of research 研究题目：“风疹病毒分子流行病学研究”。 作者：薛永磊、王志玉。 研究目的：了解RV的变异规律及流行趋势。 为进一步采取预防措施提供理论依据。

127 二、检测标志的选择(Selection of biomarkers)
RV结构蛋白基因顺序：NH2-C-E2-E1-COOH 要从分子水平了解RV的流行规律或趋势， 必须从它的基因入手，而不能单纯从它的表型 做文章。RV的结构蛋白基因有三个即c、e2和 e1，而e1编码产物---E1具有多个抗原位点，抗 原性强，是RV最重要的结构蛋白。 因此，对e1基因的核苷酸序列进行分析既 能简化实验操作程序，又能阐明RV 的基因变 异和流行规律。所以，选择e1基因的一级结构 即核苷酸序列作为测定指标。

128

129 三、测定方法(Assay methods)
如前所述，核苷酸序列分析主要有双脱氧 末端终止法和化学降解法两种。目前，多采用 前一种方法。 本研究也采用双脱氧末端终止法进行核苷 酸序列分析。

130 四、研究模式(Research mode)
采用分析流行病学研究，对来自三大洲的30 个 RV 分离株的重要结构基因e1区进行核苷酸序 列分析，比较分析不同地区、不同时间上的差异。

131 五、结果与分析(Results and analyses)
RV存在两个基因型，1970年前为同一基因型， 1975年以后出现两个基因型。 基因一型包括来自北美、欧洲和日本的28个病 毒株及本室分离的JR23株；二型包括来自中国北京 和香港的2个病毒株。E1区氨基酸顺序差异不多于3%， 因此无明显的抗原变异产生。 总体上RV的核酸、氨基酸序列高度保守。中国 的四株分离株遗传性质差别相对较大，其中379株和 BRD株构成了不同其它29株的基因 Ⅱ 型，就其遗传 来源及生物学性状需进一步研究。 JR23株与英、美、日60年代流行株序列相近，其 遗传来源可能为60年代世界流行株的中国衍生株，但 具体的初始流行时间未知。

132

133 RV E1的基因与多肽序列分析 RV JR23 E1基因序列如下：
GAGGAGGCTTTCACCTACCTCTGCACTGCACCGGGGTGCGCCACTCAAACACCTGTCCCCGTGCGCCTCGCTGGCGTCCGCTTTGAGTCCAAGATTGTGGACGGCGGCTGCTTTGCCCCATGGGACCTCGAGGCCACTGGAGCCTGCATTTGCGAGATCCCCACTGATGTCTCGTGCGAGGGCTTAGGGGCCTGGGTACCCACAGCCCCTTGCGCGCGCATCTGGAATGGCACACAGCGCGCGTGCACCTTCTGGGCTGTCAACGCCTACTCCTCTGGCGGGTACGCGCAGCTGGCCTCTTACTTCAACCCTGGCGGCAGCTACTACAAGCAGTACCACCCTACCGCGTGCGAGGTTGAACCTGCCTTCGGACACAGCGACGCGGCCTGCTGGGGCTTCCCCACCGACACCGTGATGAGCGTGTTCGCCCTTGCTAGCTACGTCCAGCACCCTCACAAGACCGTCCGGGTCAAGTTCCATACAGAGACCAGGACCGTCTGGCAACTCTCCGTTGCCGGCGTGTCGTGCAACGTCACCACTGAACACCCGTTCTGCAACACGCCGCACGGACAACTCGAGGTCCAGGTCCCGCCCGACCCCGGGGACCTGGTTGAGTACATTATGAATTACACCGGCAATCAGCAGTCCCGGTGGGGACTCGGGAGCCCGAATTGCCATGGCCCCGATTGGGCCTCCCCGGTTTGCCAACGCCATTCCCCTGACTGCTCGCGGCTTGTGGGGGCCACACCAGAGCGTCCCCGGCTGCGCCTGGTCGACGCCGACGACCCCCTGCTGCGCACTGCCCCTGGGCCCGGCGAGGTGTGGGTCACGCCTGTCATAGGCTCTCAGGCGCGCAAGTGCGGACTCCACATACGCGCTGGACCGTACGGCCATGCTACCGTCGAAATGCCCGAGTGGATCCACGCCCACACCACCAGCGACCCCTGGCACCCACCGGGCCCCTTGGGGCTGAAGTTCAAGACAGTTCGCCCGGTGGCCCTGCCACGCGCGTTAGCGCCACCCCGCAATGTGCGTGTGACCGGGTGCTACCAGTGCGGTACCCCCGCGCTGGTGGAAGGCCTTGCCCCCGGGGGAGGGAATTGCCATCTCACCGTCAATGGCGAGGACGTCGGCGCCTTCCCCCCTGGGAAGTTCGTCACCGCCGCCCTCCTCAACACCCCCCCGCCCTACCAAGTCAGCTGCGGGGGCGATAGCGATCGCGCGAGCGCGCGGGTCGTCGGCCCCGCCGCGCAATCGTTTACCGGCGTGGTGTATGGCACACACACCACTGCTGTGTCGGAGACCCGGCAGACCTGGGCGGAGTGGGCTGCTGCCCATTGGTGGCAGCTCACTCTGGGCGCCATTTGCGCCCTCCTACTCGCTGGCTTACTCGCTTGCTGTGCCAAATGCTTGTACTACTTGCGCGGCGCTATAGCGCCGCGCTAGTGGGCCCCCGCGCGAAACCCGCACTAGCCCACTAGATT

134

135

136

137 六、结论(Conclusion)   RV的流行有地域的差异，其分子流行病学特点与时间有关。由于疫苗的使用，RV产生了分子进化； RV基因稳定，不易发生变异。

138 Section six Prospect

139 一、宏观与微观相结合是现代流行病学发展的趋势
分子流行病学作为流行病学的一个新的分支和边缘学科，正在迅速发展，研究内容更加丰富，研究队伍也不断壮大，每年发表的论文呈指数增长，分子流行病学已成为流行病学教科书或专著中不可缺少的内容，分子流行病学专著也日益增多。 一、宏观与微观相结合是现代流行病学发展的趋势

140 二、人类基因组计划的完成和后基因组时代将大大推动流行病学的发展
（一）对分子流行病学的影响 1.使生物标志的选择更准确、特异、敏感、精确 2.使疾病诊断更准确 3.有助于基因分型 4.有助于了解群体遗传结构分布特征。 （二）对遗传流行病学的影响 1.有助于找到致病基因 2.有助于发现基因缺陷 3.有助于我们发现疾病的易感基因 （三）对临床流行病学的影响 1.有助于病因研究 2.使发病机制研究更加细致 3.影响疾病转归 三、分子流行病学的研究方法将会越来越先进，并不断完善 四、分子流行病学的应用领域将会越来越广泛

141 五、避免走进误区 分子流行病学方法虽然先进，应用广泛，但也有不足之处。避免出现“基因决定论”，防止“基因－病因简单化”。因此，要科学地对待人类基因与疾病、健康的关系。 绝大多数疾病是遗传（基因）因素、自然环境因素、社会因素三者相互作用的结果。也就是说，疾病的发生是一个复杂的过程，是各种因素相互作用、相互影响的结果，不能简单地归为基因，正确面对“基因热”。 另外，我们还要注意基因功能的多重性，一个基因往往有多个或多种功能。某个基因的功能往往在不同的发育或生长阶段其功能是可以改变的。 因此，基因组学又分成功能基因组学、疾病基因组学、比较基因组学、基因组信息学等。所以，要正确、全面、客观对待分子流行病学，避免片面地看问题。

142 STUDY HARD, PLAY WELL ! SLEEP SOUND, KEEP FIT ! HAVE A WONDERFUL FUTURE!!!