分子生物学实验 Experiments of molecular biology

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1 分子生物学实验 Experiments of molecular biology
一、 教学目的 《分子生物学实验》课程主要从提取和分析遗传物质和基因为基础，从DNA的分离、纯化、克隆到目的基因的鉴定、表达等过程设计了一系列基础实验，形成一个涵盖现代分子生物学基础实验内容的实验课程教学体系，包括现代分子生物学基本技术方法，帮助学生巩固有关分子生物学的相关理论知识，并较系统地学习和掌握分子生物学的基本实验方法、技术和操作技能。 二、 教学要求 通过学习使学生对所有实验内容有一个整体的了解； 熟悉分子生物学实验技术（包括DNA技术、RNA技术、蛋白质技术、杂交技术等）的基本原理方法，掌握DNA提取纯化,定量, DNA克隆, 电泳等基本实验技术，重点掌握质粒DNA纯化技术, 酶切技术, DNA片段回收,重组连接技术, 电泳技术, 转化技术, 基本PCR技术以及蛋白质的诱导表达技术等； 要求学生分子生物学实验实验室操作安全与污染物处理； 学习仪器设备的使用

2 分子生物学实验室要求 穿实验服进入实验室； 保持实验室安静； 保持实验室清洁干净和实验台面整洁； 实验前要预习实验教材；
不准穿拖鞋进入实验室； 不准在实验室吃东西、喝水； 要求刷卡进入实验室；    

3 实验一核酸的提取 （质粒DNA的提取和纯化）
【目的要求】 1．学习载体的基本结构 2．了解碱裂解法质粒提取过程中各步骤的设计思想； 3．掌握碱裂解法提取质粒的原理方法和各项基本技术；

4 【实验原理】 碱裂解法提取质粒是根据共价闭合环状质粒DNA和线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离质粒DNA。在pH值介于 这个狭窄的范围内，线性的DNA双螺旋结构解开而被变性，尽管在这样的条件下，共价闭环质粒DNA的氢键会被断裂，但两条互补链彼此相互盘绕，仍会紧密地结合在一起。当加入pH4.8乙酸钾高盐缓冲液恢复pH至中性时，共价闭合环状的质粒DNA的两条互补链仍保持在一起，因此复性迅速而准确，而线性的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开，复性就不会那么迅速而准确，它们缠绕形成网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA，蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。

5 【实验材料和用品】 恒温培养箱、恒温摇床、台式离心机、高压灭菌锅、Enpendorf管、含pET-29a质粒及含目的基因质粒的大肠杆菌、碱裂解溶液，酚、氯仿、乙醇、TE缓冲液、胰RNA酶

6 【实验步骤】 1. Pick single colony and inoculate 5 ml of LB broth containing 200 g/l Ampicillin or 1mg/5ml with a loosened cap and a piece of tape to hold it in place. Shake at 250 RPM 37oC overnight. 2. Centrifuge 1.5mL cells in 1.5 mL Eppendorf tube at top speed for 1 minute. Discard supernatant.  3. Resuspend cell pellet in 100 ul of GTE buffer (50 mM Glucose, 25 mM Tris-Cl, 10 mM EDTA, pH 8).  Vortex gently if necessary. 4. Add 100 ul of NaOH and SDS lysis solution (0.2 M NaOH, 1% SDS) respectively. Invert tube 6-8 times. 5. IMMEDIATELY add 150 ul of 5 M potassium acetate solution (pH 4.8). This solution neutralizes NaOH in the previous lysis step while precipitating the genomic DNA and SDS in an insoluble white precipitate. Spin at top speed 1 min.

7 6. Transfer supernatant to new tube, being careful not to pick up any white flakes.  Precipitate the nucleic acids with 0.5mL of isopropanol on ice for 10 minutes and centrifuge at top speed for 1 minute. 7. Aspirate off all the isopropanol supernatant. Dissolve the pellet in 0.4 ml of TE buffer (10 mM Tris-Cl, 1 mM EDTA, pH 7.5). Add 10ul of RNAse A solution (20 mg/ml stock stored at -20 °C), vortex and incubate at 37 °C for 20 to 30 minutes to digest remaining RNA. 8. Extract proteins from the plasmid DNA using phenol/chloroform/ isoamyl alcohol (PCIA) by adding about 0.4 ml. Vortex vigorously for 30 seconds. Centrifuge at full speed for 5 minutes at room temperature. Note organic PCIA layer will be at the bottom of the tube. 9. Remove upper aqueous layer containing the plasmid DNA carefully avoiding the white precipitated protein layer above the PCIA layer, transferring to a clean 1.5 ml eppendorf tube.

8 10. Repeat 9 step again. 11. Add 1 ml of absolute ethanol to precipitate the plasmid DNA and 50 ml of 3 M Sodiun acetate solution on ice for 10 minutes. Centrifuge at full speed for 5 minutes at room temperature. 12. Discard ethanol solution and resuspend DNA pellet in 50ul of TE buffer. 13. Dissolve 5uL in 995ul of water, and spec (blank spectrophotometer to water). The absorbance at 260 nm multiplied by ten is the concentration of the DNA in units of mg/ml for a 1 cm pathlength cuvette (i.e. 50 mg/ml/OD 260nm). 14.Store it at -20 °C.

9 核酸的分离与纯化 不论是基因工程还是蛋白质工程，核酸分子是这些技术应用所涉及的主要对象，所以核酸的分离与提取是生化与分子生物学研究中非常重要的基本技术。核酸样品的质量将直接关系到实验的成败。

10 核酸的种类： 真核生物的染色体DNA为双链线性分子；真核细胞器DNA为双链环状分子； 原核生物的基因组DNA、质粒DNA为双链环状分子； RNA分子在大多数生物体内均是单链线性分子；不同类型的RNA分子可具有不同的结构特点，如真核mRNA分子多数在3’端带有ploy(A)结构;tRNA 的三叶草结构。 病毒的DNA、RNA，其存在形式多种多样，有双链环状、单链环状、双链线状和单链线状等。

11 一、核酸分离提取的原则 分离纯化核酸总的原则 ①应保证核酸一级结构的完整性； ②排除其它分子的污染，保证较高纯度。

12 3.为了保征分离核酸的完整性和纯度，在实验过程中，应注意以下事宜：
①尽量简化操作步骤，缩短提取过程，以减少各种有害因素对核酸的破坏； ②减少化学因素对核酸的降解，为避免过酸、过碱对核酸链中磷酸二酯键的破坏，操作多在pH4-10条件下进行；

13 ③减少物理因素对核酸的破坏，物理破坏因素主要是机械剪切力，其次是高温。
④防止核酸的生物降解，细胞内或外界的各种核酸酶（ DNA酶、 RNA酶）酶解核酸链中的磷酸二酯键，直接破坏核酸的一级结构。

14 其中DNA酶，需要金属二价离子Mg2+，Ca2+的激活，使用金属二价离子螯合剂乙二胺四乙酸(EDTA)、柠檬酸盐，基本上可以抑制DNA酶的活性。
而RNA酶，不但分布广泛、极易污染样品，而且耐高温、耐酸、耐碱，不易失活，所以生物降解是RNA提取过程中的主要危害因素。

15 二、真核细胞染色体DNA的制备 提取高质量基因组DNA的主要用途： PCR扩增的模板 用于构建基因组文库 用于Southern blot 杂交分析

16 真核细胞染色体DNA的制备过程 1. 真核细胞的破碎
（1）物理方式:超声波法、匀浆法、液氮破碎法、Al2O3粉研磨法等。这些物理操作均可导致DNA链的断裂。 （2）为了获得大分子量的DNA，一般采用蛋白酶K和去污剂温和处理法。

17 2. 去除蛋白质 常用酚、氯仿抽提。反复的抽提操作对DNA链的机械剪切机会较多，所以有人使用高浓度甲酰胺解聚核蛋白联合透析的方法，可以获得200kb以上的DNA片段，适用于粘粒(cosmid)构建基因组文库。 根据不同的实验要求，可选择不同的实验方法制备真核细胞染色体DNA。

18 3.DNA沉淀：一般采用2倍体积乙醇沉淀 或用异丙醇（0.6） 4.DNA溶解：一般采用TE

19 三、RNA的分离与纯化 -真核细胞RNA的制备
从细胞中分离RNA的纯度与完整性对于许多分子生物学实验至关重要。如Northern blot及cDNA合成及体外翻译等实验的成败，在很大程度上决定于RNA的质量。

20 RNA主要由以下几类分子组成：rRNA(占RNA总量的80％—85％)、tRNA和核内小分子RNA(占10％-15％)、mRNA(占1％～5％)。
rRNA在总RNA分子中含量最丰富，由28S、18S、5S及4S几类组成，它们之间同源性大，分子量变化不大，所以可根据它们的密度和分子大小，通过密度梯度离心，凝胶电泳或离子交换层析进行分离。

21 mRNA分子种类繁多，分子量大小不均一，在细胞中含量少，绝大多数mRNA分子(除血红蛋白及有些组蛋白mRNA以外)，均在3’端存在20-250个多聚腺核苷酸poly(A)。利用此特征，可很方便地从总RNA中，用寡聚(dT)亲和层析柱分离mRNA。 mRNA分子群体编码细胞内所有的多肽和蛋白质，而mRNA是分子生物学的主要研究对象之一。

22 鉴定所提取总RNA分子的质量，可以通过琼脂糖电泳后观察是否有明显得28S、18S条带来判断。

23 Fig.1 Total RNA isolated from Trichoderma reesei induced by different inducers
1. 微晶纤维素 2. 天然稻草粉

24 RNA 分离的关键因素是尽量减少 RNA酶的污染！
如何创造一个无RNase的环境 ？ 极力避免外源RNase的污染：主要来源于操作者的手、实验的器皿和试剂 尽力抑制内源性RNase的活力：主要来源于样品中的组织细胞。

25 怎样去除外源性RNase的污染？ (1)操作者的手直接触摸之处，毫无疑问会留下RNase，说话带出的唾液也富含RNase。故整个操作过程中，应戴口罩和手套。 (2)空气中飞尘携带的细菌、霉菌等微生物，也是污染外源RNase的一条途径，所以操作过程应在比较洁净的环境中进行。

26 (3)玻璃器经过常规洗净后，应用0.1％焦碳酸二乙酯(diethyl pyrocarbonate，DEPC)浸泡处理(37℃，2小时)，再用双蒸灭菌水漂洗几次。高压消毒去除DEPC，然后200℃烘烤4小时以上或180℃烘烤过夜。 (4)塑料器材最好使用灭菌的一次性塑料用品，Eppendorf管、微量加样吸头最好是新的，使用前进行高压蒸汽消毒。

27 (5)所有溶液应加DEPC至0.1％，室温处理过夜，或室温下磁力搅拌20分钟，然后高压蒸汽灭菌处理（或加热至70℃1小时或60℃过夜，以去除所有残留的DEPC）。
(6)所用的化学试剂应为新包装，称量时使用干烤处理的称量勺。所有操作均应在冰浴中进行，低温条件可减低RNA酶的活性。

28 如何抑制内源性RNase的活性？ 要尽可能早地去除细胞内蛋白，加入RNase抑制剂，力争在提取的起始阶段对RNase活力进行有效地抑制。

29 RNase抑制物： （1）低特异性RNase抑制物： 不同类型的低特异性RNase抑制物均可不同程度地抑制Raise的活性，其中包括 DEPC 皂土(bentonite):Al2O3·4SiO2·H2O 复合硅酸盐(Macaloid) 肝素 氧钒基—核苷复合物 多胺

30 （2）去除蛋白质的物质： 蛋白质变性剂：酚、氯仿；尿素 蛋白酶K 去污剂：SDS、十二烷酰肌氨酸钠(sarkosyl)、脱氧胆酸钠(DOC)是阴离子去污剂 解偶剂(胍类)：盐酸胍、异硫氰酸胍是一类强力的蛋白质变性剂，可溶解蛋白质，并使蛋白质二级结构消失，细胞结构降解，核蛋白迅速与核酸分离，所以又称解偶剂。

31 （3）RNase的特异抑制剂 RNase阻抑蛋白(RNasin)： 这是一类从大鼠肝或人胎盘中提取出来的酸性糖蛋白质。RNasin能与RNase非共价结合从而抑制它们的活力，RNasin是RNA酶的一种非竞争性抑制剂。抑制效果较好，被广泛用于体外翻译体系、mRNA反转录合成cDNA及体外转录实验。

32 You will need: Guanidine isothiocyanate (Sigma) 1M sodium citrate, pH 7 (DEPC-treated, autoclaved) Sarcosyl (Na-lauryl sarcosine, Sigma) b-mercaptoethanol (Sigma) 2M sodium acetate, pH4 (DEPC-treated, autoclaved) 3M sodium acetate, 100mM magnesium acetate, pH 5.2 Absolute ethanol Propan-2-ol (isopropanol) 70% ethanol (made with DEPC-treated, autoclaved water) 0.5% SDS (made with sterile, DEPC-treated water) Solution D - 4M guanidine isothiocyanate, 25mM sodium citrate, pH7, 0.5% sarcosyl, 100mM b-mercaptoethanol. Solution D can be made and stored at 4°C without b-mercaptoethanol for several months. b-mercaptoethanol should be added to 100mM immediately prior to use. b-mercaptoethanol is used to prevent the reformation of the intra-molecular disulphide bridges , one of the reasons for the extreme stability of ribonucleases.

33 1) Tissue is homogenized as rapidly as possible, at 4°C, in solution D (500ul per 50mg tissue) with an eppendorf pestle homogenizer until a smooth, lysed, homogenous suspension is obtained. 2) Add 50ul 2M sodium acetate, pH4.0 and mix vigorously. 3) Add 500ul phenol and mix vigorously. 4) Add 100ul chloroform, mix vigorously and incubate on ice for 15 minutes. 5) Centrifuge mixture at 10,000g for 10 minutes in a microfuge at 4°C. 6) Remove upper, aqueous phase to a clean, sterile, DEPC-treated eppendorf tube. After centrifugation, RNA is present in the aqueous phase while, due to protonation at the acidic pH used, genomic DNA is partitioned into the phenol phase. 7) Extract the upper aqueous layer with an equal volume phenol/chloroform and centrifuge as before. Repeat the extractions until no interface material is seen. 8) Precipitate the aqueous phase by the addition of an equal volume (500ul) of propan-2-ol. Incubate at -20°C for 20 minutes. 9) Pellet RNA by centrifugation at maximum speed in a microfuge for 10 minutes. 10) Wash the RNA once in 70% ethanol and vacuum dry. 11) Re-dissolve in 200ul 0.5% SDS at 65°C. 12) Extract with an equal volume (200ul) of phenol/chloroform as above. Repeat until no interface material is visible. 13) Precipitate pure RNA by the addition of 20ul 3M sodium acetate, 100mM acetate, pH 5.2 and 500ul absolute ethanol. Incubate at -20°C for 20 minutes. 14) Pellet RNA by centrifugation at maximum speed in a microfuge for 10 minutes. 15) Wash the RNA once in 70% ethanol and vacuum dry. 16) Dissolve RNA in appropriate buffer i.e. DEPC-treated, sterile TE, pH 8 or 0.5% SDS if no enzymic manipulation of the RNA is needed. SDS is an inhibitor of ribonucleases. RNA quality can be assessed by electrophoresis under denaturing conditions using agarose/formaldehyde gels and the MOPS buffer system.