第二章 分子克隆载体 2001年10月17日.

Presentation on theme: "第二章 分子克隆载体 2001年10月17日."— Presentation transcript:

1 第二章 分子克隆载体 2001年10月17日

2 分子克隆载体是一类可供外源DNA插入并携带重组DNA分子进入适当宿主细胞的DNA分子。
本章主要讲授内容： 分子克隆载体的特点; 分子克隆载体的种类; 大肠杆菌分子克隆载体; 细菌和链霉菌的分子克隆载体；真菌分子克隆载体；植物克隆载体； 动物分子克隆载体； 克隆载体的选择；克隆载体的组建

3 第一节 分子克隆载体的特点

4 一、发展概况 2. 第二阶段：增大载体容量（降低载体长度），建立多克隆位点区和新的遗传标记基因。如pUC系列载体。
1.  第一阶段（1977年前）：天然质粒和重组质粒的利用，如pSC101, colE1, pCR, pBR313和pBR322 (1977, Bolivar et al) 2.  第二阶段：增大载体容量（降低载体长度），建立多克隆位点区和新的遗传标记基因。如pUC系列载体。 3.第三阶段：进一步完善载体功能以满足基因工程克隆中的不同要求，如M13mp系列载体，含T3，T7，sp6启动子载体，表达型载体及各种探针型载体。

5 二、载体特点 大肠杆菌载体 pBR322结构图 2. 至少应有一个克隆位点，以供外源DNA插入。
1. 至少有一个复制起点，因而至少可在一种生物体中自主复制。 2. 至少应有一个克隆位点，以供外源DNA插入。 3. 至少应有一个遗传标记基因，以指示载体或重组DNA分子是否进入宿主细胞 大肠杆菌载体 pBR322结构图

6 三、遗传标记基因 1. 标记基因的作用 这种指示可以是选择性的（Apr ，Tcr ，Kanr），也可以是非选择性的（如lacZ）
1）指示外源DNA分子（载体或重组分子）是否进入宿主细胞 这种指示可以是选择性的（Apr ，Tcr ，Kanr），也可以是非选择性的（如lacZ） 2）指示外源DNA分子是否插入载体分子形成了重组子。 * 这种指示也可以是选择性的（如TcS），也可以是非选择性的（如TcS， lacZα, GUS），绝大多数为后者。 **有的遗传标记基因可以完成上述两项作用。当充任第一作用时，最好是选择性标记基因；当完成第二作用时，目前多采用非选择性的—检测性标记基因。有的基因是不能用作选择性标记基因（lacZ，GUS等）。

7 2. 标记基因的种类 b. 重金属抗性基因: Cur ，Znr ，Cd r c. 代谢抗性基因: TK，抗除草剂基因
2. 标记基因的种类 1）抗性标记基因（可直接用于选择转化子） a.  抗生素抗性基因: Apr ，Tcr ，Cmr，Kanr，G418r，Hygr ，Neor b. 重金属抗性基因: Cur ，Znr ，Cd r c. 代谢抗性基因: TK，抗除草剂基因 2）营养标记基因（可直接用于选择转化子） 主要是参与氨基酸，核苷酸及其他必需营养物合成酶类的基因， 这类基因在酵母转化中使用最频繁，如TRP1，URA3，LEU2，HIS4等。 3）生化标记基因 其表达产物可催化某些易检测的生化反应，如lacZ, GUS, CAT 4） 噬菌斑

8 4. 常用的遗传标记基因 2）标记基因产物的作用机制: Apr 3）标记基因的结构与适用范围: 基因启动子, 翻译起始序列, 密码子偏爱性
3. 使用标记基因注意要点 1）标记基因与宿主细胞 2）标记基因产物的作用机制: Apr 3）标记基因的结构与适用范围: 基因启动子, 翻译起始序列, 密码子偏爱性 4）标记基因的结构变化对功能的影响: LacZ, GUS 4.  常用的遗传标记基因 1) 四环素抗性基因（Tcr） Tetracycline 可结合在核糖体30s亚基中的一种蛋白质分子上，抑制核糖体的转位过程。四环素抗性基因编码一种399 AAs蛋白质，与细菌细胞膜结合，阻止四环素分子进入细菌细胞。

9 2) 氨苄青霉素抗性基因（Apr） Ampicillin可抑制细菌细胞膜上参与细胞壁合成酶类的活性。Apr抗性基因编码一种分泌到细菌细胞周间质的酶，催化β—内酰胺环的水解，使氨苄青霉素失活。 3) 氯霉素抗性基因（Cmr） Chlorophenicol可结合在核糖体50 S亚基上，阻止蛋白质合成。Cmr基因编码氯霉素乙酰转移酶，使氯霉素乙酰化，导致乙酰化的氯霉素不能结合在核糖体上。 4) 卡那霉素(Kanr), 新霉素(Neor)和G418抗性(G418r)基因 Kanamycin，Neomycin和G418均属脱氧链霉胺氨基葡萄糖苷类抗生素，可结合在核糖体上阻止蛋白质的合成。来自转座子Tn5和Tn903的Kanr抗性基因均可使这类抗生素磷酸化，使之不能进入细胞内。

10 5）β—半乳糖苷酶基因（lacZ 和lacZα）
β—半乳糖苷酶基因有1021 AAs，基因产物不具酶活性，装配为四聚体后才有酶活。该蛋白质可分为两部分：α链和β链。前者负责四聚体装配，后者具β—半乳糖苷酶活性；只有当两者都存在时，才会表现出酶活性，该作用称之为α-互补作用。这两个部分可独立存在， 分别由两个基因编码。为α链编码的基因称之为lacZα(编码145 AAs)。这两个基因（LacZ和LacZα）均可作为标记基因。 β—半乳糖苷酶基因的优点: a. 酶催化X-Gal水解为兰色产物，检测直观 b. lacZα编码5'-端可容许很大的变化而不影响酶活性 c. lacZα和β链基因的分别表达可使载体小而容量大

11 LacZ基因的结构与产物 利用LacZ基因筛选重组子 P LacZα LacZβ 转录 翻译 α β pUC18 BamHI片段
α β pUC BamHI片段 重组DNA分子 转化E.coli 外源DNA BamHI片段 涂布在含X-Gal 和Ap的平板上, 白色菌落为重组 子，兰色菌落为 原载体 利用LacZ基因筛选重组子

12 6）葡萄糖苷酸酶基因（GUS） 7）荧光素酶基因
该基因编码一种可分解各种β-葡萄糖苷酸酶基因衍生物的水解酶。该标记基因除具有上述lacZ基因的优点外，它的适用范围十分广泛，因为许多生物中没有这种基因。 7）荧光素酶基因 荧光素酶或由萤火虫产生的可催化蜜蜂荧光素氧化的酶，并产生荧光，若在反应中加入CoA，可使灵敏度提高10倍；或由发光细菌（Photobacterium fischeri）产生的荧光素酶，它与FMN-氧化还原酶联用，通过NAD(P)H的变化测定酶活。 8）发光蛋白质基因 发光蛋白是由水母产生的一种可发光的蛋白质，该蛋白质可使大肠杆菌菌落呈蓝色。

13 四、分子克隆载体的复制起点与种类 b. 染色体外复制起点 i. 质粒—DNA,RNA,线状,环状,单链,双链 原核与真核生物
   1. 复制起点的种类 1) 核内复制起点           a. 染色体复制起点—原核生物(环状)和真核生物(线状)染色体         b. 染色体外复制起点 i. 质粒—DNA,RNA,线状,环状,单链,双链 原核与真核生物 ii. 病毒—同上, 细胞内和病毒颗粒内      2) 核外复制起点 a. 线粒体—所有真核细胞 两种质体中亦可能含有质粒 b. 叶绿体—所有绿色植物细胞

14 2) ARS复制型—ARS（autonomus replicative sequence)，或称染色体复制型
3. 按复制起点划分克隆载体 1) 质粒复制型—复制起点来自质粒或线粒体和叶绿体     2) ARS复制型—ARS（autonomus replicative sequence)，或称染色体复制型     3) 病毒复制型—复制起点来自病毒，若为RNA病毒，必须反转录为cDNA。 4) 混合复制型 a.  同种生物复制起点混合—质粒形式存在；质粒或病毒形式存在

15 又如：酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的某些载体既含有质粒（2μ）复制起点，又含有ARS片段
例：大肠杆菌（E.coli）的噬粒（phagemid）载体既含有来自质粒的复制起点，又含有来自噬菌体（如M13）的复制起点。在不同条件下，它可以质粒或噬菌体的复制起点进行复制，从而获得质粒ds- DNA或噬菌体ss –DNA 又如：酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的某些载体既含有质粒（2μ）复制起点，又含有ARS片段 b.  不同生物复制起点混合—穿梭载体（shuttle vector）两种生物中均以质粒形式存在；在一种生物中以质粒形式存在，在另一种生物中以质粒或病毒形式存在 * 穿梭载体范围：细菌—细菌（放线菌），细菌—酵母菌， 细菌—真菌，细菌—动物

16 pBS载体的结构

17 大肠杆菌-酿酒酵母穿梭载体

18 五、分子克隆载体的复制起点种类、标记基因与拷贝数的关系
1. 复制起点种类与拷贝数间的关系       1) 质粒复制起点类型：低拷贝（严紧型，1-2 copies，受宿主染色体基因控制）；高拷贝（松弛型，>20 copies，受宿主染色体控制较弱）      2) ARS型载体：拷贝数较高（约20 copies）      3) 病毒型复制起点：高拷贝 2.  标记基因与拷贝数的关系 若标记基因表达效率高，宿主细胞可能不大量产生标记基因以满足选择压力要求，因而载体拷贝数会降低。对于不同标记基因，可采取相应方法提高其拷贝数。 如：对于药物抗性标记基因，可提高药物浓度。 对于营养标记基因，可降低该基因的表达效率或更换其他低效率的标记基因

19 六、分子克隆载体的转化频率和稳定性 1. 影响转化频率的因素 2) 标记基因：尽可能选择高效表达的标记基因
        1) 复制起点类型：尽可能选择高拷贝复制起点        2) 标记基因：尽可能选择高效表达的标记基因 2. 影响稳定性的因素 1) 复制起点类型—低拷贝载体稳定，高拷贝载体稳定性差 2) 选择压力 3) 载体在宿主细胞中的状态—自主复制型和整合型 宿主细胞的遗传特性和生理特性

20 第二节 分子克隆载体的种类

21 一、根据载体的分子生物学特性划分 2. 病毒型载体—环状、线状、ss-和ds-DNA分子，形成病毒颗粒
 一、根据载体的分子生物学特性划分 1. 质粒型载体—环状dsDNA分子，自主复制 2. 病毒型载体—环状、线状、ss-和ds-DNA分子，形成病毒颗粒 3.混合型载体—具质粒和病毒特性，特性的转换依赖于宿主细胞生物学特性

22 噬菌体 M13 衍生的 载体

23 二、根据载体功能划分 1. 普通型载体 1) 特点: 至少有一个以上的克隆位点和两个标记基因，其中一 个用于转化体选择，另一个用于重组子检测。 2) 用途: 基因组或cDNA文库的构建;次克隆(subcloning)或限制酶谱分析；外源DNA扩增。 例子: pBR322和pUC载体。 上述两例中的非重组子来源有两个： a.  酶切反应时仍未被作用的pBR322或pUC18分子 b. 酶切后的载体分子经自我连接又形成载体分子

24 普通型载体pBR322的结构图

25 利用抗生素抗性基因筛选重组子的过程 BamHI片段(Tcr) pBR322 PstI片段 外源DNA PstI(Apr)片段 重组分子I
重组分子Ⅱ(Aps Tcr) (Apr Tcs） PstI片段 外源DNA BamHI片段 利用抗生素抗性基因筛选重组子的过程 重组分子I 涂布Ap平板 Apr转化子 分别转化E.coli (ApS TcS) 重组分子Ⅱ 涂布Tc平板 Tcr转化子 影印到Tc平板上 Apr TcS为重组子 Apr Tcr为原载体 影印到Ap平板上 ApS Tcr为重组子 即为非重组子

26 筛选重组子的示意图

27 pUC18和pUC19载体

28 利用菌落颜色筛选重组子

29 利用噬菌斑颜色筛选重组子

30 2. 表达型载体（expression vector）
1) 特点: a. 基因的启动子序列和终止子序列； b. 一般无检测标记基因； c.  克隆位点是确定的（即位于启动子序列后）； d. 重组分子用凝胶电泳检出（依赖于分子量差异）。 2) 结构: a. 转化单元--宿主细胞转化 b. 表达单元--外源基因表达 3) 类型: Ⅰ型：转录起始区（调控序列+启动子）+ 终止子 Ⅱ型: 转录起始区终止子 + 翻译起始区（核糖体结合序列和起始密码子）+ 终止子 Ⅲ型: 转录起始区 + 翻译起始区 + 信号肽链编码区 + 终止子（常称之为表达分泌型载体）

31 三种表达型载体结构图

32 显然, 不同类型载体中所缺少的部分必须由外源基因提供。换言之,被表达的外源基因一旦确定, 表达载体的类型也就确定了。
例子：pTrcHis2和pPIC9K 4) 用途: a. 表达外源基因以产生大量外源基因产物 b. 用于构建cDNA文库 5)  注意事项: a. 启动子来源 b. 终止子来源 c. 启动子的启动效率 d.信号肽来源与结构 e. 调控类型

33 大肠杆菌表达型载体

34 巴斯德毕赤酵母分泌表达型载体

35 3.失控型质粒载体(Run-away plasmid vector)
1) 温控型 2) 药物控制型 温控型载体 pBEU1，pBEU2(Uhlin et al.1979) ℃受控温度 中等拷贝数 升温至35℃ 小时后，细胞死亡，质粒DNA可占总DNA的75%。 抗生素控制型 新生霉素亚致死剂量（受控条件） 除去抗生素（失控条件） 大量质粒DNA

36 4. 探针型载体（probing vector）
该类载体主要特点是含有一些特殊的DNA序列，用于特定的研究目的，如分离基因启动子、终止子、DNA复制起点和染色体端粒的分离与鉴定，或是用于制备标记探针等。 1）启动子探针型载体 特点：具有一个无启动子的易检测的基因。这种基因必须满足一个重要条件：基因编码区5‘端可以作较大的修改而不影响其产物的活性。LacZ,GUS,Kanr基因可以满足该要求。在大多数载体中，检测基因不仅被除去了启动子序列，其翻译起始区也被除去（II型），有的则仅仅除去了转录起始区 （I型）。 用途：i. 分离未知基因的启动子—Ⅱ型启动子探针型载体 ii.鉴定已知基因的启动子和比较其强弱—Ⅰ型启动子探针型载体 例子: a. pSUPV b. pFR109

37 启动子探针型载体结构

38 pSUPV4载体结构与 克隆基因启动子流程图
涂布在Ap平板上 Apr转化子 转化E.coli pSUPV 涂布在Kan平板上 无菌落 BamHI片段 Kan平板 重组DNA分子 转化E.coli Kanr 外源DNA Sau3AI片段 Ap平板 Kanr 影印Kan平板 Apr

39 pFR109载体结构与 克隆基因启动子流程图 BamHI片段 重组DNA分子 转化E.coli 兰色Apr转化子 Apr + X-Gal平板
pFR 转化E.coli Ap + X-Gal平板 无色Apr BamHI片段 重组DNA分子 转化E.coli 外源DNA Sau3AI片段 兰色Apr转化子 Apr + X-Gal平板

40 2）终止子探针型载体 用途：用于终止子序列的分离与鉴定。 例：pBU10
特点：两个标记基因融合在一起，融合基因的5'-端标记基因无终止子序列和无终止密码子，3'-端标记基因无转录和翻译起始区，两个基因的阅读框架相同，两个基因相连处有一个克隆位点。 用途：用于终止子序列的分离与鉴定。 例：pBU10 外源DNA片段插入克隆位点后，若3'-端基因不表达，该DNA可能是: 终止子序列-转录终止; 翻译终止--终止密码子; 外源DNA不是3n序列，后一个基因相位发生变化。

41 终止子探针型载体与 基因终止子的分离流程图 pBU10 转化 E.coli Tc+X-Gal平板 无色Tcr转化子 HindⅢ片段
重组DNA分子 转化E.coli 涂布在Cm + X-Gal平板 外源DNA HindⅢ片段 兰色Cmr 影印在Tc平板 Tcs+ Tcr菌落

42 3）复制起点探针型载体 用途：复制起点的分离与鉴定(即ARS片段)。 例： YIp5 = pBR322 + URA3
特点：不能在某种生物自主复制，但含有适合该种生物的遗传标记，转化频率低，转化子染色体中含有该载体，但从转化子中提取的总DNA不能转化E.coli. 用途：复制起点的分离与鉴定(即ARS片段)。 例： YIp5 = pBR322 + URA3 4) 标记探针型载体 特点：含有噬菌体(如Sp6,T3,T7)基因启动子片段。 用途：制备高比活的RNA探针; 制备RNA分子用于其它基础研究，如RNA拼接。

43 复制子探针型载体结构 与克隆复制起点流程图 转化S.cerevisiae(ura3) Ura+ 提取总DNA 转化E.coli
YIp (低频转化) 酶切片段 重组DNA分子 nnn 转化S.serevisiae(ura3) 供试DNA片段 Ura 分离DNA 转化E.coli Apr转化子 分离质粒DNA (低频转化) Ura+转化子(高频转化) 再转化酵母 无Apr 和Tcr转化子

44 5. 定序型载体 6. 整合型载体 主要用于核苷酸的序列测定 1) M13mp系列 ss-DNA定序系统。如M13mp18，M13mp19。
5.  定序型载体 主要用于核苷酸的序列测定 1) M13mp系列 ss-DNA定序系统。如M13mp18，M13mp19。 2)  噬粒（Phagemid）系列ss-DNA和ds-DNA定序系统。pBS+，pUC118, pUC119 3) 各种质粒d s-DNA定序系统。如pBR322, pUC18, pUC19 6. 整合型载体 结构与复制起点探针型载体相同，仅是用于不同目的，该类载体转化频率低，但转化体十分稳定。 用途：稳定表达外源基因；基因治疗（野生型基因取代突变型基因）；基因突变（突变基因取代野生型基因）

45 三、辅助质粒（helper plasmid）和辅助病毒 (helper virus)
1. 辅助质粒—帮助质粒载体形成的重组DNA分子从一种生物转移到另一种生物。 2.辅助病毒—帮助混合型载体构成的重组DNA分子由质粒型转换成病毒型，因而必须提供DNA聚合酶，病毒颗粒形成所需的全部蛋白质。