第三节 重组子的筛选与鉴定 　　　　 一、 遗传学检测法 　　　　　二、 物理检测法 三、 核酸分子杂交检测法 　　　　　四、免疫化学检测法 　　　　　五、 核酸序列分析及其他方法.

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1 第三节 重组子的筛选与鉴定 　　　　 一、 遗传学检测法 　　　　　二、 物理检测法 三、 核酸分子杂交检测法 　　　　　四、免疫化学检测法 　　　　　五、 核酸序列分析及其他方法

2 第三节 重组子的筛选与鉴定 转化子 导入外源基因DNA分子后能稳定存在的受体细胞； 重组子 含有重组DNA分子的转化子； 筛选和选择
　相关概念 　转化子 　　　导入外源基因DNA分子后能稳定存在的受体细胞； 　重组子 　　　含有重组DNA分子的转化子； 　筛选和选择 　　　经过各种方法将外源DNA分子导入受体细胞后，获得所需的阳性重组子的过程； 　筛选 　　　通过某种特定的方法，如核酸杂交及免疫测定等从受体细胞群体或基因文库中鉴定出阳性重组子的过程； 　选择 　　　通过某种外加因素的辨别作用，呈现具有重组DNA分子的特定克隆的方法

3 一、遗传学检测法 　　　该方法要求克隆基因能够表达，并利用相应的基因突变型作为受体细胞，当受体细胞由突变型变为野生型时或赋予受体细胞特定的表型时，我们基本可以确定所克隆的基因是否是目的基因。 　　　优点：简便、快速，结果较可靠。 　　　缺点：基因必须表达并具有合适的受体细胞。 　（一） 根据载体表型特征选择重组体分子的直接选择法 　　 1. 抗药性标记插入失活选择法 　　 2. β-半乳糖苷酶显色反应选择法 　（二）根据插入序列的表型特征选择重组体分子的直接选择法 　转化进来的外源DNA编码的基因，能够对大肠杆菌寄主菌株所具有的突变体发生体内抑制或互补效应，从而使被转化的寄主细胞表现出外源基因编码的表型特征。

4 一、遗传学检测法 (一)载体表型选择法 1.抗药性标记及其插入失活选择法 如：pBR322质粒上有两个抗菌素抗性基因: Tetr和Ampr。
　(一)载体表型选择法 　1.抗药性标记及其插入失活选择法 　 如：pBR322质粒上有两个抗菌素抗性基因: Tetr和Ampr。 　Tetr上有插入位点BamH I和Sal I; 　Ampr上有插入位点Pst I。

5 一、遗传学检测法 (一)载体表型选择法 1.抗药性标记及其插入失活选择法 pBR322抗菌素标记选择
　1.抗药性标记及其插入失活选择法 　　pBR322抗菌素标记选择 　　（1）四环素：抑制细菌生长，但不杀死细菌。 　　（2）氨苄青霉素抗性基因：产生-内酰胺酶，使氨苄青霉素转变为青霉酮酸，使碘-青霉素指示液（I2-KI-Aampicillin）（蓝灰色）褪色。 　　（3）环丝氨酸：杀死生长的细菌，但不杀死停止生长的细菌。

6 一、遗传学检测法 (一)载体表型选择法 1.抗药性标记及其插入失活选择法 pBR322 选择过程 （1）四环素抗性插入失活
　1.抗药性标记及其插入失活选择法 pBR322 选择过程 （1）四环素抗性插入失活 如果在Tetr上插入外源DNA，导致四环素抗性基因失活，可用四环素加环丝氨酸平板培养基选择重组克隆。 Tetr失活的菌生长被四环素抑制，不被环丝氨酸杀死，保留下来； Tetr不失活的菌抗四环素，能分裂生长，反而被环丝氨酸杀死。

7 一、遗传学检测法 无环丝氨酸培养基

8 一、遗传学检测法 (一)载体表型选择法 1.抗药性标记及其插入失活选择法 pBR322 选择过程
　1.抗药性标记及其插入失活选择法 pBR322 选择过程 　　（2）氨苄青霉素抗性插入失活选择过程 　　　如果Ampr上插入外源DNA，导致氨苄青霉素抗性基因失活，可用碘-青霉素指示液选择。

9 一、遗传学检测法 (一)载体表型选择法 2. -半乳糖苷酶显色反应选择法 （1）原理
　2. -半乳糖苷酶显色反应选择法 乳糖 半乳糖 葡萄糖 + -半乳糖苷酶 半乳糖 5-溴-4-氯靛蓝 X-gal + 深蓝色 （1）原理 　　载体上有一段-半乳糖苷酶基因（Lac Z）的片段（氨基端），其上有外源DNA的插入位点。 受体菌基因组中有突变的-半乳糖苷酶基因（ 片段缺失）, 可以被IPTG诱导表达。 载体和受体菌基因组可以互补形成完整有功能的-半乳糖苷酶。

10 一、遗传学检测法 (一)载体表型选择法 2. -半乳糖苷酶显色反应选择法 （2） 选择过程 假阳性：
　2. -半乳糖苷酶显色反应选择法 　（2） 选择过程 假阳性： 　如果插入的外源DNA正好是3的倍数并且没有终止密码子；（不破坏肽）。

11 一、遗传学检测法 (一)载体表型选择法 　2. -半乳糖苷酶显色反应选择法 -半乳糖苷酶使Xgal分解成兰色产物。

12 一、遗传学检测法 利用插入的外源基因的表达产物特性进行直接选择。（只在特定条件下）。 1.原理 （1）弥补缺陷
　(二)根据插入基因的遗传性状的选择 　　　利用插入的外源基因的表达产物特性进行直接选择。（只在特定条件下）。 　　1.原理 　　（1）弥补缺陷 　　　转化进来的外源基因产物能够弥补受体菌株的突变型缺陷。 受体菌： his- 阳性克隆才能在不含组氨酸的培养基中生长 外源基因： his+

13 一、遗传学检测法 (二)根据插入基因的遗传性状的选择 1.原理 （2）增加新性状 使被转化的受体菌表现出外源基因的表型。
　(二)根据插入基因的遗传性状的选择 　　1.原理 　（2）增加新性状 　　　使被转化的受体菌表现出外源基因的表型。 　　 例：小鼠的二轻叶酸还原酶（DHFR）对三甲氧苄二氨嘧啶有抗性。 三甲氧苄二氨嘧啶培养基平板 DHFR 转化受体菌 连接 载体 含DHFR的克隆才能生长

14 二、物理检测法 利用有插入片段的重组载体的分子量比野生型载体分子量大。 (一)凝胶电泳检测法
　　　利用有插入片段的重组载体的分子量比野生型载体分子量大。 　(一)凝胶电泳检测法 　　从转化后的菌体克隆中分离质粒，电泳、比较其分子量。 重组克隆 载体 分子量 Marker

15 二、物理检测法 　(二)酶切电泳筛选法 　　1. 原理 　　　根据已知的外源DNA序列的限制性酶切图谱，选择一两种内切酶切割质粒，电泳后比较电泳结果（DNA带数和长度）。 　　　或用合适的内切酶切下插入片断，再用其它酶切这个片断，电泳后比较结果是否符合预计的结果。

16 二、物理检测法 (二)酶切电泳筛选法 A或B

17 二、物理检测法

18 三、核酸分子杂交检测法 (一)原理 1. 核酸杂交 重组克隆与探针杂交。 2. 检测用的探针 与外源DNA插入片断互补的序列。
3. 识别标记 （1）放射性同位素 32P 或 125I 。 （2）非放射性标记 荧光素

19 三、核酸分子杂交检测法 (二)核酸杂交检测方法 1. Southern blotting
　(二)核酸杂交检测方法 　1. Southern blotting 　　　用DNA（或RNA）探针检测DNA样品。从宿主细胞中提取DNA（或质粒载体），再用探针杂交。 　　　只有带有插入片断的重组载体才能与探针杂交，在底片上曝光显示。

20 三、核酸分子杂交检测法 Southern blotting

21 三、核酸分子杂交检测法 (二)核酸杂交检测方法 　1. Southern blotting Southern blot 筛选结果

22 三、核酸分子杂交检测法 (二)核酸杂交检测方法 2.Northern blotting 用DNA（或RNA）探针检测RNA样品。
　(二)核酸杂交检测方法 　　2.Northern blotting 　　用DNA（或RNA）探针检测RNA样品。 主要检测插入片断是否被转录。 从宿主细胞中提取RNA，再用探针杂交。

23 三、核酸分子杂交检测法 (二)核酸杂交检测方法 3. Western blotting
在蛋白质凝胶电泳以后，用转膜和免疫的方法检测胶上的蛋白质泳带。 ①（SDS-PAGE） 　　① SDS:是蛋白质的变性剂，使煮沸变性的蛋白质维持线性状态，并与蛋白质结合，使蛋白质带上负电荷。 ② 聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）：在电场的作用下线性蛋白质链在聚丙烯酰胺凝胶介质中向正极移动，移动的速率主要取决于其分子量大小（链的长短），从而把不同分子量的肽链分开。

24 (二)核酸杂交检测方法 3. Western blotting 电泳buffer 电泳buffer

25 (二)核酸杂交检测方法 膜 胶 蛋白 ② 转膜 3. Western blotting ③ 杂交 待测蛋白 硝酸纤 维素膜 一抗 二抗
② 转膜 (二)核酸杂交检测方法 3. Western blotting ③ 杂交 待测蛋白 硝酸纤 维素膜 一抗 二抗 ④ 检测

26 三、核酸分子杂交检测法 　(二)核酸杂交检测方法 　　4.原位杂交 　 特点：对应的菌斑或噬菌斑位置不变，可以直接找出阳性菌落。

27 四、免疫化学检测法 利用抗体作为“探针”来检测转入受体菌并且表达出相应的蛋白质的外源基因。 (一)放射性抗体检测法
　　 利用免疫学的原理，检测克隆基因的表达产物。蛋白——蛋白“杂交” 　　　利用抗体作为“探针”来检测转入受体菌并且表达出相应的蛋白质的外源基因。 (一)放射性抗体检测法 　1. 抗体与产物的结合方式 　　 根据第一抗体（一抗）和第二抗体（二抗）的性质可分为以下几种作用方式：

28 四、免疫化学检测法 (一)放射性抗体检测法 1. 抗体与产物的结合方式 固相支持滤膜 待测基因 产物蛋白 一抗 125I标记的二抗
　1. 抗体与产物的结合方式 固相支持滤膜 待测基因 产物蛋白 一抗 125I标记的二抗 125I 标记的二 抗结合蛋白 待测基因 产物蛋白 固相支持滤膜 一抗 二抗 固相支持滤膜 待测基因 产物蛋白 一抗 125I标记的二抗 125I 标记的二抗 结合蛋白 固相支持滤膜 待测基因 产物蛋白 二抗 一抗

29 四、免疫化学检测法 　(一)放射性抗体检测法 　 2. 放射性抗体检测法过程

30 四、免疫化学检测法 (一)放射性抗体检测法 3. Broome-Gilbert双位点检测法 检测融合蛋白。
　(一)放射性抗体检测法 　3. Broome-Gilbert双位点检测法 　　检测融合蛋白。 　　既检测外源基因产物又检测载体基因产物。　 质粒基因A 插入基因B 表达 融合蛋白 质粒蛋白A 外源蛋白B

31 四、免疫化学检测法 (一)放射性抗体检测法 3. Broome-Gilbert双位点检测法 固相支 持滤膜 抗A抗体 质粒蛋白A 外源蛋白B
发光，底片曝光

32 四、免疫化学检测法 (二)免疫沉淀检测法 检测分泌型产物。 1. 原理：抗原——抗体凝集反应。 2. 方法
　(二)免疫沉淀检测法 　　　检测分泌型产物。 　　1. 原理：抗原——抗体凝集反应。 　　2. 方法 　把非放射性抗体加到平板培养基中，当插入基因的表达产物被细菌分泌到菌落周围时，就会与抗体反应形成“沉淀圈”。 对于不能被分泌到菌体外的蛋白质可先进行原位溶菌处理（溶菌酶、原噬菌体诱发）。

33 四、免疫化学检测法 (三)酶联免疫吸附测定（ELISA） Enzyme-linked immunosorbant assay 1. 原理：
　1. 原理： 　　一抗（primary antibody）: 与目标分子特异结合。 　　二抗（secondary antibody）： 与一抗特异性结合。 　　酶连（enzyme-linke）： 二抗上携带一种酶能催化一种反应将无色的底物转变为有色的物质（或发光），再通过比色测定有色物质的含量（或光强度），从而推测目标分子的含量。

34 四、免疫化学检测法 一抗 待测基因 产物蛋白 二抗 酶 待测基因 产物蛋白 一抗 二抗 酶 有色的产物 无色的底物 比色观察

35 四、免疫化学检测法 (三)酶联免疫吸附测定（ELISA） 2. ELISA检测的一般步骤 （1）固定样品
　　（1）固定样品 　　　将待测样品加入96孔微量滴定板（microtiter plate）的孔中，干燥后就被固定在孔底。 孔底

36 四、免疫化学检测法 (三)酶联免疫吸附测定（ELISA） 2. ELISA检测的一般步骤 （2）一抗结合
　（2）一抗结合 加入一抗，反应后冲洗掉未结合的抗体。 一抗

37 四、免疫化学检测法 (三)酶联免疫吸附测定（ELISA） 2. ELISA检测的一般步骤 （3）二抗结合
　　（3）二抗结合 　　　加入二抗，与一抗结合后再将未结合的二抗冲洗掉。二抗只识别一抗。 二抗 二抗上联着一种酶（碱性磷酸酶、过氧化物酶、脲酶等）。

38 四、免疫化学检测法 (三)酶联免疫吸附测定（ELISA） 2. ELISA检测的一般步骤
　　（4）显色反应 　　　加入无色的底物，被二抗上所带的酶催化反应转变成有色物质（或发光）。

39 四、免疫化学检测法

40 四、免疫化学检测法 (三)酶联免疫吸附测定（ELISA） 2. ELISA检测的一般步骤 （5）比色
　　（5）比色 　　在特殊的分光光度仪（酶标仪）上比色，打印出结果。

41 四、免疫化学检测法 (三)酶联免疫吸附测定（ELISA） 3. ELISA的局限性
　　　有效，但准确性稍差（主要取决于一抗的特异性）。 必须与其他方法一起综合考虑。 最好用单克隆抗体（monoclonal antibody）

42 四、免疫化学检测法 临床检验常用的单抗

43 五、核酸序列分析及其他方法 (一)PCR扩增检测法 1. 原理：PCR能在模板序列上扩增出预期DNA片断。 2. 过程
　　2. 过程 　　（1）从重组克隆中提取质粒（或DNA）。 　　（2）用外源DNA插入片断引物作PCR。 　　（3）电泳PCR产物。 　　（4）检查是否有PCR产物。 　　（5）PCR产物的长度是否与外源基因一致。

44 五、核酸序列分析及其他方法 (二)DNA序列测定法

45 五、核酸序列分析及其他方法 (二)DNA序列测定法

46 五、核酸序列分析及其他方法 (二) DNA序列测定法

47 小　结 一般克隆与筛选策略

48 本章重点掌握内容 掌握转化、转导、转染的概念与区别 掌握外源基因与载体的连接方式 了解基因转移的方法与区别
掌握转化子、重组子、选择和筛选的含义 -半乳糖苷酶显色反应选择法的原理 核酸杂交法的原理与方法