毛细管电泳技术及其在药学研究中的应用 上海市食品药品检验所 林梅

Presentation on theme: "毛细管电泳技术及其在药学研究中的应用 上海市食品药品检验所 林梅"— Presentation transcript:

1 毛细管电泳技术及其在药学研究中的应用 上海市食品药品检验所 林梅
毛细管电泳技术及其在药学研究中的应用 上海市食品药品检验所 林梅

2 1. 电泳发展简史 2. 电泳的概念与基本原理 3.毛细管电泳仪器 4.毛细管电泳分离模式 5. 毛细管电泳特点及应用
基本内容 1. 电泳发展简史 2. 电泳的概念与基本原理 3.毛细管电泳仪器 4.毛细管电泳分离模式 5. 毛细管电泳特点及应用

3 电泳发展简史 电泳现象 在电解质溶液中带电粒子在外加电场作用下向电荷相反的方向迁移。
电泳现象 在电解质溶液中带电粒子在外加电场作用下向电荷相反的方向迁移。 电泳技术 是依据带电粒子在电场的作用下迁移行为不同而进行分离的技术。 1809年，俄国物理学家Pence首次发现电泳现象。但是，电泳作为分离技术是瑞典科学家Tiselius在1937年首先提出的，他成功地创建了Tiselius电泳仪，用于分离人血清中5种成分，并为此获得诺贝尔化学奖。

4 电泳发展简史 1981年，Jorgenson和Lukacs用75μm内径、100cm 长的石英毛细管，30kV的高压，分离丹酰化氨基酸（DNS-AAS)，用灵敏的荧光检测，峰形对称，实现了正负离子的同时分离，理论塔板数超过每米40万，轰动了分离科学界，成为毛细管电泳划时代的里程碑。 至此，电泳技术发生了根本变革，迅速发展成为可与GC、HPLC相媲美的崭新的分离分析技术——毛细管电泳。

5 电泳发展简史 1983年，Hjerten将充聚丙烯酰胺凝胶毛细管用于电泳分离，发展了毛细管凝胶电泳(capillary gel electrophoresis，CGE)。 1984年，Terabe等在毛细管电泳电解质溶液中加入表面活性剂，实现了中性分子的分离，这个模式称为胶束电动色谱(micellar electrokinetic chromatography，MECC)，拓展了毛细管电泳的应用范围。 1987年，Hjerten提出了毛细管等电聚焦电泳（CIEF），使CIEF 技术在蛋白质分离中成为一个强有力的微分离分析工具，达到能分辨等电点仅相差0.01pH的高分辨率水平。 1989年，出现商品化仪器。

6 电泳的概念与基本原理 一、双电层和Zeta电位 二、电泳（Electrophoresis） 三、电渗（Electroosmosis）
四、焦耳热（Joule heating） 五、迁移时间与有效淌度 六、分离效能与分离度

7 电泳的概念与基本原理 一、双电层和Zeta电位 “固定”离子有一个切平面，该处电位与溶液内部的电位之差称为Zeta电位。
双电层是指固液两相之间的分离表面由相对固定和游离的两部分离子组成的与表面电荷异号的离子层。 “固定”离子有一个切平面，该处电位与溶液内部的电位之差称为Zeta电位。

8 电泳的概念与基本原理 双电层和Zeta电位示意图

9 电泳的概念与基本原理 二、电泳流（Electrophoresis Flow） 电泳为带电粒子在电场作用下在缓冲溶液中的定向移动。
Vep=ep E 式中，E为电场强度，ep表示溶质的电泳淌度。

10 电泳的概念与基本原理 二、电泳流（Electrophoresis Flow）
溶质的电泳淌度与荷电粒子的电荷密度成正比，即对于给定摩尔质量的粒子，表面电荷越大，电泳淌度也就越大；反之，如果电荷给定，则摩尔质量越大，电泳淌度越小。 荷电粒子在电场作用下，依据表面电荷密度的差别，进行差速移动而实现电泳分离，这就是在自由溶液区带电泳中不同荷电粒子的分离基础。

11 电泳的概念与基本原理 三、电渗流（Electroosmosis Flow）
电渗流是指在电场作用下，毛细管内液体沿固体表面移动的现象。电渗的产生与固液界面的双电层有着密切的关系 双电层中处于扩散层中的阳离子在毛细管内壁负离子表面形成一个圆筒形的阳离子塞流，而阳离子又是溶剂化的，在外加电场作用下，水化阳离子沿毛细管内壁剪切面作相对运动时，携带溶剂一齐向阴极迁移，形成电渗流。 一般地，电渗流速度是电泳流速度的5-7倍。对于石英毛细管，电渗流流向阴极。

12 三、电渗流（Electroosmosis Flow）
电泳的概念与基本原理 三、电渗流（Electroosmosis Flow）

13 电渗的特点： 1.电渗流的一个重要特点是具平面流型 2.电渗流使几乎所有的样品组分以同一方向移动
电泳的概念与基本原理 电渗的特点： 1.电渗流的一个重要特点是具平面流型 2.电渗流使几乎所有的样品组分以同一方向移动

14 电泳的概念与基本原理 Veo=eo E 电渗流速度的实验计算：Veo =l/teo 电渗的淌度eo可用下式表示，即：
三、电渗流（Electroosmosis Flow） Veo=eo E 电渗流速度的实验计算：Veo =l/teo 电渗的淌度eo可用下式表示，即：

15 电泳的概念与基本原理 值得注意的是，EOF对柱的内表面变化非常敏感，EOF的细微变化将严重影响CE分离的重现性(迁移时间和峰面积)。所以，EOF的控制是CE中的一项重要任务。

16 影响EOF的因素： 电场强度 缓冲液pH 离子强度或缓冲液浓度 温度 有机改变剂 表面活性剂 共价涂渍
电泳的概念与基本原理 影响EOF的因素： 电场强度 缓冲液pH 离子强度或缓冲液浓度 温度 有机改变剂 表面活性剂 共价涂渍

17 电泳的概念与基本原理 四、焦耳热（Joule heating）
焦耳热是由于电流通过电泳分离介质而产生，其大小取决于操作功率的大小，与毛细管尺寸、缓冲液电导及电场强度有关。

18 四、焦耳热（Joule heating） 焦耳热会引起电泳分离介质的 温度梯度 黏度梯度 速度梯度 从而引起区带展宽。
电泳的概念与基本原理 四、焦耳热（Joule heating） 焦耳热会引起电泳分离介质的 温度梯度 黏度梯度 速度梯度 从而引起区带展宽。

19 电泳的概念与基本原理 四、焦耳热（Joule heating） 降低电场强度 减小毛细管内径 降低缓冲液的离子强度或浓度
控制焦耳热和温度梯度的方法： 降低电场强度 减小毛细管内径 降低缓冲液的离子强度或浓度 用物理方法直接降温或恒温

20 电泳的概念与基本原理 ap = l/（tmE） = lL/（tmV） eo = l/（teoE） = lL/（teoV）
五、迁移时间与表观淌度 迁移时间：样品组分从进样口迁移到检测窗所需要的时间。 表观淌度ap ： ap = l/（tmE） = lL/（tmV） eo = l/（teoE） = lL/（teoV） ep = ap - eo = lL/V（1/tm - 1/teo）

21 电泳的概念与基本原理 毛细管总长度与有效长度

22 电泳的概念与基本原理 迁移时间与有效淌度

23 六、分离效能与分离度 分离效能N： 根据塔板理论 其中，t为流出曲线最高点所对应的时间，称为迁移时间；W为峰高一半时的宽度即半峰宽。
电泳的概念与基本原理 六、分离效能与分离度 分离效能N： 根据塔板理论 其中，t为流出曲线最高点所对应的时间，称为迁移时间；W为峰高一半时的宽度即半峰宽。

24 电泳的概念与基本原理 六、分离效能与分离度 分离效能N： 根据速率理论: H = A + B/u + Cu
毛细管电泳 H = B/u ＝2D/u n = lu/2D = apEl/2D = apVl/2DL

25 六、分离效能与分离度 分离度R： R = 2（tm2 - tm1）/（W1 + W2）
电泳的概念与基本原理 六、分离效能与分离度 分离度R： R = 2（tm2 - tm1）/（W1 + W2）

26 毛细管电泳仪器： 进样系统 分离系统 检测系统 数据处理系统

27 毛细管电泳装置示意图

28 毛细管电泳分离模式 毛细管区带电泳（Capillary Zone Electrophoresis）
胶束电动毛细管色谱（Micellar Electrokinetic Chromatography） 毛细管等电聚焦电泳（Capillary Isoelectric Focusing） 毛细管等速电泳（Capillary Isotachrophoresis） 毛细管凝胶电泳（Capillary Gel Electrophoresis） 毛细管无胶筛分（Capillary non-gel sieving） 毛细管电色谱（Capillary electric chromatography） 毛细管亲和电泳（Capillary affinity electrophoresis）

29 毛细管区带电泳 毛细管区带电泳（CZE）是毛细管电泳中使用最为广泛的一种技术。它是通过在充满电解质溶液的毛细管中，不同质荷比大小的组分在电场的作用下迁移速度的不同而进行分离的。

30 毛细管区带电泳 毛细管区带电泳操作条件的选择 （一）操作电压 （二）缓冲液种类选择 （三）缓冲液的pH值 （四）缓冲液的浓度
（五）添加剂的影响 （六）毛细管柱温对电泳分离的影响

31 毛细管电动色谱 毛细管电动色谱主要指的是胶束电动毛细管色谱，它是电泳技术与色谱技术的交叉，由日本学者Terabe于1984年提出，是毛细管电泳技术中应用最广泛的操作模式之一。 胶束电动毛细管色谱分离中性分子需要在运行缓冲液体系中添加表面活性剂，其浓度要求在临界胶束浓度以上，使单个表面活性剂分子之间聚集而形成胶束。 胶束电动毛细管色谱的分离机理是基于样品组分间电泳淌度的不同和分配系数的差异而实现。

32 SDS胶束示意图

33 毛细管电动色谱 MECC的两相 在MECC系统中，存在着两相：流动的缓冲液相；相当于固定相作用的胶束相。
对于SDS胶束来说，固定相朝阳极迁移。电渗流的速度大于胶束的迁移速度，胶束最终向阴极移动，但移动非常慢。因此，MECC中的“固定相”是移动的,又被称为“准固定相”。 溶质在这两相之间分配而分离。

34 毛细管电动色谱 在SDS-MECC中，中性粒子根据本身疏水性的不同而达到分离。疏水性强的作用力就大，其留在胶束中的时间就长。因胶束的绝对速度很小，故组分的迁移时间就长，反之组分较多地停留在缓冲液这按电渗的速度移动，因此，迁移时间较短。 如果使用阳离子表面活性剂，则情况相反。

35 毛细管电色谱 毛细管电色谱（CEC）是指用电场驱动的微柱液相色谱，它克服了CE分离中性物质相对困难的不足，同时也大大地提高了液相色谱的分离效率，形成了自己独特的高效、微量、快捷的特点。

36 毛细管电色谱 CEC采用熔融的石英毛细管柱，柱内一般填充高效液相色谱（HPLC）用的固定相，用高压直流电源代替高压泵，即用电渗流代替压力推动流动相。溶质根据它们在流动相与固定相中的分配系数的不同和自身电泳淌度的差异得以分离。

37 毛细管电色谱 溶质在毛细管电色谱中的保留是与它在两相中的分配有关，决定了CEC实质是一种色谱行为。但当溶质为离子状态时，其保留机制又类似于毛细管电泳，即根据其电泳淌度的不同而分离。因此，CEC在选择性和使用范围上兼顾了CE和高效液相色谱的特点。

38 一、毛细管电泳的技术特点 多——分离模式多 快——分析速度快 好——分离效能好 省——分析费用省
毛细管电泳特点及应用 一、毛细管电泳的技术特点 多——分离模式多 快——分析速度快 好——分离效能好 省——分析费用省

39 七种青霉素的分离 CZE : 20mM Pi-Borate, pH 8.5
(B) MEKC : 0.1 M SDS in (A) soln.

40 CZE分离RP-HPLC收集的多肽组分

41 二、毛细管电泳的应用特点 生物大分子 有机小分子 无机离子 中西药物 生化样品 手性分子
毛细管电泳特点及应用 二、毛细管电泳的应用特点 生物大分子 有机小分子 无机离子 中西药物 生化样品 手性分子

42 蛋白质混合物的毛细管等电聚焦分离

43 阳离子分离毛细管电泳图

44 违禁药物毛细管胶束电动色谱分离

45 三、毛细管电泳在药学研究中的应用热点 复杂样品指纹图谱 手性分离分析 药物代谢研究 药品质量研究及标准制订
毛细管电泳特点及应用 三、毛细管电泳在药学研究中的应用热点 复杂样品指纹图谱 手性分离分析 药物代谢研究 药品质量研究及标准制订

46 中药指纹图谱研究 CE虽然用于中药指纹图谱研究尚处于起步阶段，用CE分析中药具有较大的优势。一是它具有柱效高、快速、进样体积小等特点；二是抗污染能力强，前处理简单，甚至于不需前处理（适用于“脏”样品分析）；三是分析运行成本低；四是水溶性样品的“指纹”特征性强，如中药汤剂、注射剂的分析等；五是应用面广。CE除可分析小分子酸、碱、盐及中性分子外，还可分析生物大分子（核酸、多肽和蛋白质等）及手性分子等。因此，CE可以完成中药指纹图谱研究的诸多课题。

47 冬虫夏草的毛细管电泳指纹图谱

48 手性分离分析 手性对映体分离有巨大的应用价值，用CE直接分离手性对映体是发展方向。 目前在机理上已提出手性对映体分离的数学模型，可用多种模式进行分离。 常用的手性选择剂有环糊精、冠醚、手性选择性金属络合物、胆酸盐、手性混合胶束、蛋白和糖等。

49 山莨菪碱合成品的毛细管电泳手性拆分 未涂层石英毛细管柱( 5 0 μ m ×4 5 cm)，运行缓冲液 7 5mmo l /L磷酸盐缓冲液
(pH2.5，含25 mmol /L CM- γ -CD)，运行电压20kV，毛细管柱温 25℃，电迁移进样 8kV×6s，检测波长 200 nm

50 生物体液药物分析及代谢物研究是临床药代动力学的重要内容，而代谢物的结构一般与原药很相似，需要很高的分辨率才能达到分离测定的目的。
药物代谢研究 生物体液药物分析及代谢物研究是临床药代动力学的重要内容，而代谢物的结构一般与原药很相似，需要很高的分辨率才能达到分离测定的目的。 CE具有分离效能高、所需样品量少等优点，且通过电迁移进样、清洗毛细管柱等方式使得CE特别适于分析生物体液“脏”样品，因此CE广泛应用于研究药物的代谢过程、测定代谢产物、分析各种体液中的药物成分及其分布等领域。此外，结合CE灵活的手性分离模式，近几年CE在生物体液中手性药物代谢研究方面的应用进展迅速。

51 延胡索乙素硫酸盐的CE手性分离及其 家兔体内立体选择性代谢研究

52 药品质量研究与标准制订 “化学药物杂质研究的技术指导原则”：新药的CE杂质谱
BP2012：10个品种：7个生化生物药（1. 注射用阿替普酶：肽谱，CE；2. 还原型谷胱甘肽：有关物质，CZE；3. 重组DNA技术产品：氨基酸组成和分子量测定：CE；4. 生长激素及其制剂：鉴别和Charged variants：CZE；5. Dried Factor VIII (rDNA)：蛋白组成，CE；6. 人a-1-蛋白酶抑制剂：生产工艺一致性，CE；7. 人用单克隆抗体：纯度，CE），3个化学药（氢溴酸加兰他敏：对映体杂质检查，手性CZE；盐酸罗哌卡因：R-对映体杂质检查，手性CZE；盐酸左卡巴司汀：有关物质检查，手性MEKC）

53 USP36/NF31：4个品种：1个生化药（抑肽酶：杂质检查，CZE），2个化学药（盐酸罗哌卡因和盐酸左卡巴司汀：均同BP2012），一个药用辅料：（磺丁基-β-环糊精：平均取代度，CZE-间接UV检测） ChP2010：2个品种：1个生化药（抑肽酶：同USP）， 1个抗生素（盐酸头孢吡肟及注射用盐酸头孢吡肟：N-甲基吡咯烷检查，CZE-间接UV检测） 《中华人民共和国药典》2015年版编制大纲：扩大CE的应用

54 谢 谢