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第一章 蛋白质的分离与纯化
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SDS-PAGE技术（主要掌握）、IEF（一般了解） 蛋白质的浓缩（了解）
蛋白质分离纯化的一般原则（掌握） 分配层析的基本理论（重点掌握） 蛋白质的层析分离技术 离子交换层析、凝胶过滤层析、亲和层析等 主要掌握操作要点及操作过程的注意事项 蛋白质的电泳分离技术 不连续系统原理（重点掌握） SDS-PAGE技术（主要掌握）、IEF（一般了解） 蛋白质的浓缩（了解）
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第一节 蛋白质分离纯化的一般原则
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蛋白质纯化的一般设计原则 1. 材料的选择与破碎 2. 建立蛋白质的活性测定方法 3. 分离纯化应遵循分级分离、先粗后细的原则
4. 分离纯化条件
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材料的选择 根据实验目的选择合适的材料，应遵循： 材料来源方便、成本低、易操作 目的蛋白含量及生物活性尽可能高 可溶性及稳定性要尽可能好
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注意：不同的生物体、不同生理状态、不同组织细胞的蛋白质含量和分布有很大差异
预处理：将不必要的结缔组织、脂肪组织等在尽可能接近生命状态下剔除，处理后应立即使用或在冷库中保存
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细胞的破碎 先要将细胞和组织破碎，使蛋白质充分释放出来 机械法 匀浆：破碎机体软组织最常用方法之一 组织捣碎：注意维持低温环境 研磨：破碎单一细胞的有效方法，主要用于细菌、酵母等的破碎
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物理法 超声法：输入高能超声波可以破碎细胞，破碎效率取决于声频、声能、处理时间、细胞浓度及细胞类型等 在处理少量样品时操作简便、效率高，液量损失少，适于实验室使用 注意: 超声波产生的化学自由基团能使敏感的活性物质变性失活，另外噪声也比较大
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反复冻融法：由于在此过程中易使活性蛋白失活，故适用于提取非常稳定的蛋白质
冷热交替法：绝大多数细胞被破坏，一般适用于从细菌或病毒中提取蛋白质 低渗裂解：是指无胞壁细胞在低渗溶液中通过渗透张力作用裂解的方法，常用于红细胞的裂解
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化学法 有机溶剂法：有些有机溶剂(如苯、甲苯等)可以改变细胞壁或膜的通透性，使内含物有选择性的渗透出来 表面活性剂(surfactant)：常用的有十二烷基磺酸钠、TritonX-100、去氧胆酸钠等 酶解法：必须根据细胞的结构和化学组成选择适当的酶
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特异、快速、精确、可重复、经济 总蛋白含量 蛋白质比活性（specific activity） 得率
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利用溶解度的差异分离 盐析法：最经典的方法，常用来进行粗分离 常用中性盐，主要有硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、氯化钠等，其中应用最广的是硫酸铵 影响盐析的因素很多，如pH、温度、蛋白质浓度等都会影响各种蛋白质的盐析点
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盐析 疏水作用 (非极性残基不能与水形成氢键， 倾向于避开水)
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硫酸铵沉淀
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有机溶剂沉淀法：有机溶剂能降低溶液的介电常数，从而增加蛋白质分子之间不同电荷的引力，导致溶解度的降低；另外有机溶剂与水的作用，能破坏蛋白质的水化膜，使蛋白质在一定浓度的有机溶剂中沉淀析出
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等电点法：当蛋白质处于等电点pH时，蛋白质的净电荷为零，由于相邻蛋白质分子之间没有静电斥力而趋于凝集 (aggregation)和沉淀 (precipitation)，它的溶解度达到最低
温度：在一定温度范围内(0～40℃之间)，大部分球状蛋白质的溶解度随温度升高而增加
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等电点沉淀
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根据分子量的不同分离 透析(dialysis)和超滤(ultrafiltration)：是利用蛋白质分子不能通过半透膜的性质，使蛋白质和其它小分子物质如无机盐、单糖、水等分开 透析过程 平衡离心法：根据蛋白质分子大小、形状不同进行分离的技术 凝胶过滤 (gel filtration)：又称分子筛层析(molecular sieve chromatography)，这是根据分子大小分离蛋白质混合物的最有效方法之一
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根据电荷的不同分离 电泳 离子交换层析 区带电泳：如醋酸纤维薄膜电泳，PAGE等
Agilent 3D CE 毛细管电泳系统 等电聚焦 (isoelectric focusing, IEF) ：具有更高分辨率的电泳技术 电泳 毛细管电泳(capillary electrophoresis, CE) ：在细孔管或毛细管中进行电泳分离。柱效高、分析时间短，所用样品量及试剂消耗少，操作模式多，可以进行在线检测和自动化 离子交换层析
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亲和层析 亲和层析法可在温和条件下操作，纯化过程简单、快速、分辨率高，对分离含量少且性质不稳定的生物活性物质极为有效 注意：应该尽量减少纯化步骤，缩短操作时间
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目的：避免目的蛋白的变性，保证其生物活性
缓冲液 (buffer) 盐、金属离子和螯合剂 还原剂 去垢剂 (detergent) 蛋白酶抑制剂 蛋白质的环境因素
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第二节 分配层析的基本理论 Rate theory 1906年 M.Tswett Absorption Chromatography
第二节 分配层析的基本理论 1906年 M.Tswett Absorption Chromatography 1941年 Martin and Synge Partition Chromatography Plate theory Rate theory
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一、分配定律 定量的S溶剂中，再加入一定量的M溶剂 相的A物质的分子数完全相等)时，其分配系数为常数 CAS = K CAM
分配定律表明： 一定的条件下，一定的物质其K值不变 条件改变其K值随之改变 K值大于1，物质在S相中的浓度大于其在M相中浓度
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二、分配层析的机理 （1）层析柱可分成许多层，右面是流动相M，左面是固定相S，M和S是互不混溶
假设有两种物质，在一定的条件下，它们的分配系数K不同，则通过一根分配层析柱可以将它们分离。为了便于讨论，我们做如下几个假设： （1）层析柱可分成许多层，右面是流动相M，左面是固定相S，M和S是互不混溶 （2）分配层析柱中，每一层左右相通，层与层之间互不相通，也就是说在层析柱中只有横向扩散而无纵向扩散 分配层析柱理论塔板示意图
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（3）在分配层析柱中，溶质在两相中达到分配平衡的速度很快，并且A物质的存在不影响B物质的分配性质，反之亦然
CAS CBS KB = KA = = 1/3 = 1 CBM CAM
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如果在层析开始时，在第一层的S相中同时加入A和B两种物质，加入的量均为一。根据分配定律，A和B加入后，在两相中立刻进行分配，并且很快达到分配平衡。第一次分配前后A和B物质在S和M相中的量为：
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A和B物质在层析柱中 1. 分配10次；2. 分配20次；3.分配30次
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理论曲线和实际洗脱曲线是否相符？ 二者之间总是存在着一定的偏差，这是因为： 层析柱中总是或多或少地存在着纵向扩散
层析过程不可能在绝对分配平衡的情况下进行 因此，通常实际的洗脱曲线都比理论曲线低而宽
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一根分配层析柱上到底能进行多少次分配？ 求得一个理论塔板的高度为0.002厘米 Verzele计算为0.02厘米
Martin和Synge计算了硅胶柱的理论塔板数， 求得一个理论塔板的高度为0.002厘米 Verzele计算为0.02厘米 1厘米的层析柱最少有50个理论塔板，那么， 在一根20厘米的层析柱上最少可以进行1000 次分配。
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三、塔板理论 塔板理论的要点： 一理论塔板，其高度为理论塔板高度。在一定的 条件下，一根分配层析柱的理论塔板数是一定的
分配层析柱象分馏柱一样可以分成很多层，每层为 一理论塔板，其高度为理论塔板高度。在一定的 条件下，一根分配层析柱的理论塔板数是一定的 在分配层析柱中，物质只有横向扩散，没有纵向扩 散，而且在两相间达到分配平衡的速度很快 体系中其他物质的存在不影响待分离物质的分配。 待分离物质的存在也不影响其他物质的分配 在分配层析柱上，物质在各个理论塔板中的含量可 通过计算求得
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