霍山石斛细胞悬浮培养及条件优化 目的要求 方法

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1 霍山石斛细胞悬浮培养及条件优化 目的要求 方法
利用细胞悬浮培养技术生产霍山石斛单细胞，解决石斛药用植物资源短缺问题。 方法 以霍山石斛叶片等外植体为实验材料，通过不同的制备方法获得霍山石斛单细胞，研究霍山石斛细胞培养的多种影响因素，应用正交设计优化霍山石斛细胞悬浮培养的条件。

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4 近年来，国内外对药用植物石斛进行了大量深层次的开发，对石斛的需求量也越来越大，而多年来石斛主要靠采收野生资源供药用和出口，由于野生石斛繁殖很慢，自然更新能力很差，加之生态环境的制约，人为过度采掘，致使野生资源日渐枯竭。 其中霍山石斛Dendrobium huoshanense C. Z. Tanget S. J Che 等名贵品种已成为日益稀少的濒危植物，被国家列为重点保护的药材品种。

5 应用种子离体萌发诱导原球茎或原球茎悬浮培养方式 培养霍山石斛
本实验应用霍山石斛为起始培养材料，以其茎尖和茎段为外植体，通过酶法和机械法获取单细胞，并进行大量培养。该培养方法可明显缩短霍山石斛生长繁殖周期，更宜于后期的有效成分提取等工业生产步骤，对解决石斛资源短缺问题具有重大意义。

6 1、材料与方法 1.1 材料与试剂 1.2 实验方法

7 1.1 材料与试剂 液体培养基为改良的MS； 碳源：蔗糖、葡萄糖； 氮源：NaNO3、NH4NO3、NH4Cl、脲；
材料与试剂 液体培养基为改良的MS； 碳源：蔗糖、葡萄糖； 氮源：NaNO3、NH4NO3、NH4Cl、脲； 植物生长调节剂：IAA、6-BA

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9 实验方法 1.2.1 外植体灭菌 1.2.2 霍山石斛单细胞的制备 1.2.3 培养基的选择 1.2.4 接种与培养

10 外植体灭菌 取霍山石斛幼茎段冲洗干净，70%酒精浸1 min 后无菌水冲洗5 次，转入0.1%HgCl2 加1 滴聚山梨酯80 消毒10min 后，无菌水冲洗5 次，用无菌纱布或无菌滤纸吸干水后待用。

11 霍山石斛单细胞的制备 取霍山石斛灭菌后的外植体，采用组织匀浆机匀浆（或酶解法或玻璃珠捣碎法），滤过，离心，获得霍山石斛单细胞悬浮液。

12 1.2.3 培养基的选择 以 MS 为基本培养基，pH5.0～6.0；
培养基的选择 以 MS 为基本培养基，pH5.0～6.0； 6-BA/IAA 的配比分别为：2.0︰0.4、1.0︰0.4、0.5︰0.4、1.0︰0.2 和1.0︰0.（mg/L）；添加物为香蕉泥。

13 接种与培养 用移液器移取3 mL 霍山石斛单细胞悬浮液注入各个培养瓶内，同时用超滤器向每瓶内各滴入不同质量浓度的IAA 和6-BA 组合，将已接种的三角瓶置于（25±2）℃，180 r/min 的恒温摇床中进行黑暗培养

14 2、 结果 2.1 不同提取方法对获取霍山石斛单细胞的影响 2.2 碳源对霍山石斛细胞悬浮培养的影响
2、 结果 2.1 不同提取方法对获取霍山石斛单细胞的影响 2.2 碳源对霍山石斛细胞悬浮培养的影响 2.3 氮源对霍山石斛细胞悬浮培养的影响 2.4 pH 对霍山石斛细胞培养的影响 2.5 培养时间对霍山石斛细胞悬浮培养的影响 2.6 不同激素配比对霍山石斛细胞悬浮培养的影响 2.7 培养温度对石斛细胞悬浮培养的影响 2.8 正交试验的设计与结果 2.9 石斛细胞传代培养

15 2.1 不同提取方法对获取霍山石斛单细胞的影响 本实验获取霍山石斛单细胞主要用了3 种方法：机械匀浆组织破碎提取法、酶解法、玻璃珠捣碎法。
3 种方法得到的细胞数分别为：7.73×105、1.19×106、1.54×106 个/mL，说明玻璃珠捣碎法效果最好，本实验的操作均采用玻璃珠捣碎法。

16 2.2 碳源对霍山石斛细胞悬浮培养的影响 分别选用蔗糖和葡萄糖作为碳源对霍山石斛细胞进行悬浮培养，实验结果表明，蔗糖培养的石斛细胞数目为1.13×106 个/mL，葡萄糖培养的石斛细胞数目为6.93×105 个/mL。蔗糖比葡萄糖更适宜石斛细胞的培养，故用蔗糖作为碳源；同时又用不同质量浓度蔗糖对霍山石斛细胞培养，结果如图1 所示。

17 图1 蔗糖浓度对石斛细胞悬浮培养的影响 10 8 6 4 2 10 20 30 40 50 蔗糖质量浓度/(g·L−1)
细胞数目/（×105个·mL−1） 8 6 4 2 蔗糖质量浓度/(g·L−1)

18 2.3 氮源对霍山石斛细胞悬浮培养的影响 实验选用了 4 种不同氮源对霍山石斛细胞进行悬浮培养，结果见图2。

19 图 2 氮源对石斛细胞悬浮培养的影响

20 2.4 pH 对霍山石斛细胞培养的影响 培养基的 pH 值与细胞的生长繁殖关系密切，在培养过程中过酸或过碱可导致细胞死亡，这主要与蛋白质的变性和细胞膜的结构受损有关。植物细胞培养的pH 一般控制在微酸性的范围内，即pH为5.0～6.0本实验考察不同pH 对霍山石斛细胞数目的影响，结果如图3 所示。

21 图 3 pH 值对石斛单细胞培养的影响

22 2.5 培养时间对霍山石斛细胞悬浮培养的影响 霍山石斛细胞在营养充足的情况下，开始快速地有丝分裂，细胞的数目随着时间的变化而变化。
通过培养、观察、计数，得到其数目变化的结果见图4。由图可知，在前12 d，石斛细胞进行迅速的有丝分裂；到第14 天有丝分裂开始缓慢，并趋于稳定达到最大值1.673×106 个/mL；18 d 以后逐渐呈下降趋势。因此最佳培养时间为14～18 d。

23 图 4 培养时间对石斛细胞培养的影响

24 2.6 不同激素配比对霍山石斛细胞悬浮培养的影响
在植物细胞培养的过程中激素的种类及其比例都对植物细胞的生长、繁殖、分化、发育和新陈代谢起重要调节控制作用。取6-BA/IAA 分别为2.0︰0.4、1.0︰0.4、 0.5︰0.4、1.0︰0.2 和1.0︰0.1 不同配比（mg/L），进行培养，结果如图5 所示。

25 图 5 激素配比对霍山石斛细胞悬浮培养的影响

26 2.7 培养温度对石斛细胞悬浮培养的影响 培养温度与细胞的生长繁殖关系密切。不同培养温度下获得的石斛细胞数目结果如图6 所示。在其他条件均相同的情况下，当培养温度调控在（25±2）℃时，石斛细胞数目为1.019×106当培养温度调控在（35±2）℃时，培养的石斛细胞数目为6.15×105 个/mL。故培养的最适温度是（25±2）℃。

27 图 6 培养温度对石斛细胞培养的影响

28 2.8 正交试验的设计与结果 根据以上单因素优化的结果，选取影响霍山石斛细胞培养的4 个主要因素，采用L9（34）正交试验，考察pH （A）、碳源（B）、氮源（C）和激素配比（D），结果见表1。
表 1 正交试验因素水平表 个/mL。按正交试验设计，配制不同的培养基，接种后在温度（25±2）℃，转速120 r/min 条件下培养，结果见表2。

29 表2 正交分析试验结果及极差分析

30 对霍山石斛细胞培养条件进行L9（34）试验，结果表明：4 个因素对石斛细胞的生长影响顺序依次是B＞D＞A＞C，即碳源＞激素配比＞pH＞氮源。蔗糖35 g/L，NH4NO3 为1.3 g/L，pH 为5.6，激素配比6-BA/IAA 为1.0︰0.4 组合的培养细胞数最多，为9.42×105 个/mL。

31 2.9 石斛细胞传代培养 本实验在原代悬浮培养霍山石斛细胞 14 d 后，对石斛细胞进行了第1 次传代培养，即将原代细胞从培养箱中取出，静置10 min，然后在超净工作台上取5 mL 原代培养上清液注入到含有香蕉泥的完全培养基中，继续培养。随后每隔10 d 传代1 次，共传代4 次，以此来建立细胞系。传代后的细胞长势较原代不同，最大特点就是细胞较圆，可见细胞壁，如图7 所示。

32 图 7 霍山石斛细胞培养前（A）及培养后（B）的细胞形态

33 根据显微摄影图片可以看出，霍山石斛细胞在培养前后形态发生了很大变化。培养前的霍山石斛细胞悬浮液较分散均匀，单细胞较少，且多为游离状，可明显观察到细胞碎片，霍山石斛细胞多呈大小不一，不规则的多边菱形。培养后的霍山石斛细胞有的紧挨在一起，形成细胞团，经过4 次继代培养后霍山石斛细胞多为圆状或椭圆状，细胞数目明显增多。

34 3 结论与讨论 3.1 单细胞的制备 3.2 激素配比 3.3 添加物

35 3.1 单细胞的制备 植物细胞可以从外植体中直接分离获得，从外植体中直接分离植物细胞的方法通常有机械法、玻璃珠捣碎法和酶解法。
本实验主要采用玻璃珠捣碎法制备单细胞。

36 3.2 激素配比 植物激素是植物细胞培养中不可缺少的成分，其种类及比例都对植物细胞的生长、繁殖、分化、发育和新陈代谢起调节控制作用。
经过实验得出当6-BA/IAA 为1.0︰0.4 时是石斛细胞悬浮培养的最适激素配比，即6-BA 为1.0 mg/L和IAA 为0.4 mg/L。

37 3.3 添加物 香蕉泥：香蕉提取物除了提供植物细胞生长发育所需的养分外，还对维持培养基的pH 值在5.0～5.5 有缓冲作用
实验结果显示，石斛细胞培养的最适香蕉泥质量分数是15%