第五章 基因扩增.

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1 第五章 基因扩增

2 基因扩增-PCR PCR技术简史 PCR的原理 PCR的反应体系和方法 PCR的类型和应用

3 PCR技术简史 基因扩增-PCR ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC
DNA的复制 核酸体外扩增的设想 聚合酶链反应的发明 PCR技术简史 DNA 解旋解链 合成引物 子链延长 ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC 5’ 3’ 解旋酶 解链酶 TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG 3’ 5’

4 PCR技术简史 基因扩增-PCR GGAUCG ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC AUCGCG
DNA的复制 核酸体外扩增的设想 聚合酶链反应的发明 PCR技术简史 ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC 5’ 3’ GGAUCG 5‘ DNA 解旋解链 合成引物 子链延长 引物酶 RNA引物 AUCGCG 5‘ 引物酶 TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG 3’ 5’

5 PCR技术简史 基因扩增-PCR ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC TAGCGCTATCGCATCGACGCT
DNA的复制 核酸体外扩增的设想 聚合酶链反应的发明 PCR技术简史 ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC 5’ 3’ DNA 解旋解链 合成引物 子链延长 TAGCGCTATCGCATCGACGCT 3’ GGAUCG 5‘ DNA 聚合酶 AUCGCG 5‘ ATAGCGTAGCTGCGAGGATCG 3’ DNA 聚合酶 TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG 3’ 5’

6 PCR技术简史 基因扩增-PCR DNA的复制 核酸体外扩增的设想 聚合酶链反应的发明
1971年，Khorana提出：经过DNA变性，与合适引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆tRNA基因。 但由于测序和引物合成的困难，以及70年代基因工程技术的发明使克隆基因成为可能，所以，Khorana的设想被人们遗忘了……

7 PCR技术简史 基因扩增-PCR DNA的复制 核酸体外扩增的设想 聚合酶链反应的发明
1985年，美国PE-Cetus公司的Mullis等人发明了聚合酶链反应（PCR） 基本原理是在试管中模拟细胞内的DNA复制 最初采用E-coli DNA聚合酶进行PCR，由于该酶不耐热，使这一过程耗时，费力，且易出错 耐热DNA聚合酶的应用使得PCR能高效率的进行，随后PE-Cetus公司推出了第一台PCR自动化热循环仪 1993年，Mullis等因此项技术获诺贝尔化学奖

8 基因扩增-PCR DNA聚合酶 引物 引物 M13噬菌体 Sanger的测序技术 引物 DNA聚合酶

9 基因扩增-PCR DNA聚合酶 引物 Mullis的构思 引物 DNA聚合酶 特定DNA片段

10 基因扩增-PCR 基因组DNA 获取特定DNA片段 扩增特定DNA片段

11 基因扩增-PCR Kary B. Mullis <<The Unusual Origin of the Polymerase Chain Reaction>> 1989年美国《Science》杂志列PCR 为十余项重大科学发明之首,比喻1989年为PCR爆炸年,Mullis荣获1993年度诺贝尔化学奖。

12 基因扩增-PCR 生物样品 DNA片段 基因诊断 基因治疗 基因工程产品 法医学检测 人类学研究 ……

13 PCR的基本原理 基因扩增-PCR 高温变性 低温退火 适温延伸 1 2 3 4 5 22 55 72 94 1 2 3 时间（min）
温度 （℃） 高温变性 1 低温退火 2 适温延伸 3 重复1~3步 25~30轮 形成2条单链 DNA变性 目的DNA片段 扩增100万倍以上 子链延伸 DNA加倍 DNA单链 与引物复性 DNA双螺旋

14 基因扩增-PCR 94℃变性 50-65℃退火 72℃延伸

15 基因扩增-PCR 94℃ 55℃ 72℃

16 Taq DNA聚合酶（Thermus aquaticus)
基因扩增-PCR Taq DNA聚合酶（Thermus aquaticus) 100 80 60 40 20 酶活性(%) 温度(℃)

17 基因扩增-PCR 94℃ 55℃ 72℃ PCR循环

18 PCR的基本原理 基因扩增-PCR 95℃ 模板DNA PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 1 2 3 4 5 22 55 72 94
时间（min） 温度 （℃） 适温延伸 高温变性 低温退火 重复1~3步 25~30轮 目的DNA片段 扩增100万倍以上 DNA双螺旋 DNA单链 与引物复性 子链延伸 DNA加倍 形成2条单链 DNA变性 模板DNA

19 基因扩增-PCR 50℃ PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 引物1 DNA引物 引物2

20 基因扩增-PCR PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 50℃ Taq酶 引物1 DNA引物 引物2 Taq酶

21 基因扩增-PCR PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 72℃ PCR的基本原理 第1轮结束 第2轮开始

22 基因扩增-PCR 95℃ PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 Taq Taq Taq Taq

23 基因扩增-PCR 72℃ PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 第2轮结束

24 PCR的基本原理 基因扩增-PCR 模板DNA 第1轮扩增 第2轮扩增 第3轮扩增 第4轮扩增 第5轮扩增 第6轮扩增 PCR反应条件

25 PCR的基本原理 基因扩增-PCR 灵敏度高 简便、快速 对标本的纯度要求低 PCR的特点
皮克(pg=10-12)量级扩增到微克(ug=10-6)水平 能从100万个细胞中检出一个靶细胞 病毒检测的灵敏度可达3个PFU 细菌检测的最小检出率为3个细菌 简便、快速 一次性加好反应液，2～4 小时完成扩增 扩增产物一般用电泳分析 对标本的纯度要求低 血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等组织的粗提DNA

26 PCR的反应体系和方法 基因扩增-PCR 标准的PCR反应体系 PCR反应体系 PCR反应引物 4种dNTP混合物 各200umol/L
引物 　　　　 　 各10～100pmol 模板DNA 　　　 0.1～2ug Taq DNA聚合酶 u Mg2+ 　　　　　 1.5mmol/L

27 （1)序列应位于高度保守区，与非扩增区无同源序列。
基因扩增-PCR 引物设计： （1)序列应位于高度保守区，与非扩增区无同源序列。 （2）引物长度以15-40 bp为宜。 （3）碱基尽可能随机分布，G+C占50-60%。 （4）引物内部避免形成二级结构。 （5）两引物间避免有互补序列。 （6）引物3’端为关键碱基；5’端无严格限制。

28 基因扩增-PCR 3’ 5’ 5’ 3’ 限制性内切酶的识别序列 启动子序列 定点突变 探针标记

29 PCR反应条件 1）PCR反应成分 （1）模板 单、双链DNA均可。 不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、DNA结合蛋白类。 一般100ng DNA模板/100L。 模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。

30 基因扩增-PCR （2）引物浓度 mol/L 浓度过高易导致模板与引物错配,反应特异性下降。 （3）Taq DNA聚合酶（thermus aquaticus) U/50 l 酶量增加使反应特异性下降;酶量过少影响反应产量。

31 基因扩增-PCR （4）dNTP dNTP浓度取决于扩增片段的长度 四种dNTP浓度应相等 浓度过高易产生错误碱基的掺入，浓度过低则降低反应产量 dNTP可与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度下降，影响DNA聚合酶的活性。

32 基因扩增-PCR （5） Mg2+ Mg2+是DNA聚合酶的激活剂。 0.5mmol/L-2.5mmol/L反应体系。 Mg2+浓度过低会使Taq酶活性丧失、PCR产量下降； Mg2+过高影响反应特异性。 Mg2+可与负离子结合，所以反应体系中dNTP、EDTA等的浓度影响反应中游离的Mg2+浓度。

33 基因扩增-PCR 2）循环参数 变性 使双链DNA解链为单链 95oC 20-30秒 (2) 退火 温度由引物长度和GC含量决定。 增加温度能减少引物与模板的非特异性结合;降低温度可增加反应的灵敏性。

34 基因扩增-PCR （3）延伸 70-75oC， 延伸时间由扩增片段长度决定 （4）循环次数 主要取决于模版DNA的浓度 一般为25-35次 次数过多：扩增效率降低 错误掺入率增加

35 PCR的类型 Asymmatric PCR Reverse PCR Multiplex PCR Labelled primer PCR
Anchored PCR Solid phase PCR In stiu PCR ＲＴ－ＰＣＲ Real-time PCR

36 1）不对称PCR（asymmetric PCR ）
目的：扩增产生特异长度的单链DNA。 方法：采用两种不同浓度的引物。分别称为限制性引物和非限制性引物,其最佳比例一般是0.01∶0.5μM,关键是限制性引物的绝对量。 用途：制备核酸序列测定的模板 制备杂交探针 基因组DNA结构功能的研究

37 高浓度引物 低浓度引物

38 是用反向的互补引物来扩增两引物以外的DNA片段对某个已知DNA片段两侧的未知序列进行扩增。
2)反向PCR (reverse PCR) 是用反向的互补引物来扩增两引物以外的DNA片段对某个已知DNA片段两侧的未知序列进行扩增。 可对未知序列扩增后进行分析,如探索邻接已知DNA片段的序列；用于仅知部分序列的全长cDNA的克隆,扩增基因文库的插入DNA；建立基因组步移文库。 已知序列 未知序列 未知序列

39 限制酶 限制酶 已知序列 未知序列 未知序列 连接酶

40 3）多重PCR（multiplex PCR）
用于检测特定基因序列的存在或缺失。 引物 电泳

41 4）LP-PCR（Labelled primers)
利用同位素、荧光素等对ＰＣＲ引物进行标记，用以直观地检测目的基因。 特别适合大量临床标本的基因诊断 可同时检测多种基因成分 病毒1 病毒 病毒 病毒4

42 标记引物 ＰＣＲ PCR产物 观察

43 5）锚式PCR（anchored PCR） 5’ 5’ cDNA 末端核酸转移酶 3’GG…GG CC…CC 锚定引物 3’GG…GG

44 6）PCR固相分析法 亲和固相介质 模板 生物素化引物 探针 PCR扩增 检测探针信号

45 7）原位ＰＣＲ（In stiu PCR） 原位聚合酶链式反应（In stiu PCR，Is－PCR）是由Haase等于1990年首创。它是利用完整的细胞作为一个微小的反应体系来扩增细胞内的目的片段，在不破坏细胞的前提下，利用一些特定的检测手段来检测细胞内的扩增产物。 直接用细胞涂片或石蜡包埋组织切片在单个细胞中进行ＰＣＲ扩增。可进行细胞内定位。 适用于检测病理切片中含量较少的靶序列

46 原位PCR的作用 既往鉴定细胞内特异序列一般采用原位杂交（ISH），但在每个细胞中目的片段的拷贝数少于10的情况下，该方法的敏感度就明显下降。而标准的PCR则可扩增出细胞内单拷贝的序列，敏感度很高，但却未能与细胞形态学研究相结合。 ISPCR则可把这两者结合起来，成为细胞学诊断中一种崭新的检测技术。利用该法可检测细胞内病毒感染、细胞内基因重排、以及分析细胞内RNA表达产物等方面发挥一定作用。在检测细胞的潜在感染方面也具有重要意义。

47 基因扩增-PCR 操作步骤 细胞或组织的固定 PCR扩增细胞内目的片段 原位杂交检测扩增产物

48 基因扩增-PCR 人类染色体端粒DNA的荧光原位杂交照片

49 8）ＲＴ－ＰＣＲ mRNA 逆转录酶 杂化双链 ＤＮＡ聚合酶 cDNA PCR扩增

50 9）实时PCR技术（real-time PCR）

51 Real-time PCR

52 两种标记技术 染料染色 SYBR Green 探针标记 TaqMan

53 SYBR Green染料

54 染料法的优缺点 成本低 广谱性 适合初筛 无模板特异性 灵敏度低 条件优化

55 探针定量原理

56 阈值

57 CT值 荧光信号穿过阈值线时的循环次数

58 基线的调整 基线 阈值 CT值 CT值>15，自动分析 CT值<15，手动分析

59 PCR的应用 研究 诊断 人类基因组工程 法医 肿瘤 其他…… 基因克隆，DNA测序，分析突变 细菌、病毒、寄生虫检测，诊断
犯罪现场标本分析 肿瘤 各种肿瘤检测 其他……

60 PCR技术的应用 1) 基因克隆 质粒DNA 基因片段 重组DNA

61 基因扩增-PCR Bam H I 5’ 5’ Bam H I Bam H I Bam H I

62 基因克隆 质粒DNA 目的基因 Bam HI限制性内切酶 CTAG GATC GATC CTAG CTAG GATC

63 2)基因检测 内源性病变基因 正常人 A 病 人 A’ 病原微生物基因 正常人 (-) 病 人 (+)

64 遗传病的诊断 地中海贫血 基因缺失、插入或置换等 珠蛋白链合成不平衡

65 正常人 病 人 A 正常 病人

66 ASO探针法 正常 A 病人 C T ASO探针 G

67 基因扩增-PCR NC膜 探针 探针杂交 正常人 突变纯合子 突变杂合子

68 恶性肿瘤（癌基因或抑癌基因） PCR-RFLP法： ras 基因 限制性内切酶

69 基因扩增-PCR 突变 限制性内切酶

70 基因扩增-PCR 正常 突变 电泳

71 3)基因配型 HLA系统基因分型 PCR-RFLP法 PCR-SSO法 PCR-SSCP PCR-SSP

72 PCR-SSP 引物特异性 PCR

73 4）基因鉴定 女性 男性 Y引物 PCR 男性 女性

74 5）法医学分析 个体识别、亲缘鉴定 方法：PCR-RFLP DNA指纹 PCR-ASO PCR-VNTR多态性 PCR-SSCP

75 PCR-VNTR多态性检测 PCR；电泳检测

76 基因扩增-PCR 父’ 父 子 母

77 基因扩增-PCR 现 嫌1 嫌2 嫌3