临床PCR技术的发展历史及趋势 武春晓 山东省立医院.

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1 临床PCR技术的发展历史及趋势 武春晓 山东省立医院

2 前言 聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction ,PCR)
PCR技术是生物医学领域中的一项革命性创举和里程碑。 PCR技术的出现极大地推动了分子生物学的发展，旋即被迅速推广和应用到生命科学的其他领域。而且这种发展还在继续。

3 PCR的发展历史 PCR的起源 1 最初的设想 2 PCR的首次实现 3 PCR的首次 耐热DNA聚合酶的应用

4 Unusual origin by a non-stereotype scientist
PCR 的起源: Unusual origin by a non-stereotype scientist

5 0. PCR的最早设想 核酸研究已有100多年的历史，本世纪60年代末、70年代初人们致力于研究基因的体外分离技术。
Korana于1971年最早提出核酸体外扩增的设想：“经过DNA变性，与合适的引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆tRNA基因”。

6 最初的设想: 被遗忘了10年 DNA 聚合酶Ⅰ的发现 Kornberg 1955 最初的设想 Khorana 1971
最初的设想: 被遗忘了10年 DNA 聚合酶Ⅰ的发现 Kornberg 最初的设想 Khorana Klenow酶的发现 Klenow 核酸测序 Sanger 寡核苷酸引物合成 ’s DNA限制性内切酶 smith

7 1. PCR的首次实现 1985年美国PE-Cetus公司人类遗传研究室的Mullis等发明了具有划时代意义的聚合酶链反应。

8 Dr. Kary B Mullis: a non-stereotype scientist
1983年 1993 后来

9 Sequence Masters Fred Sanger, 1958 1980 dideoxy sequencing
Was originally a protein chemist Made his first mark in sequencing proteins Made his second mark in sequencing RNA 1980 dideoxy sequencing

10 Sanger Method Sequencing Gel

11

12 PCR的最初实现

13 2.PCR最早的应用报道 Saiki R K, Scharf S, Faloona F, et al. Enzymatic aniplification of β-globin genomic sequences and restriction site anylysis for diagnosis of sickle cell anemia. Science, 1985；230：1350～1354 β-珠蛋白基因扩增和镰刀状红细胞贫血的产前诊断

14 问题: 不耐热的DNA 聚合酶 1955年Kornberg等就从大肠杆菌提取液中发现了DNA聚合酶。DNA聚合酶Ⅰ是由分子量为109000的一条多肽链构成, DNA聚合酶具有3种功能： 一聚合作用: 以DNA为模板，将dNTP中的脱氧单核苷酸逐个加到3-OH末端。 二有3’→5’外切酶活力: 能识别和消除错配的引物末端，与复制过程中校正功能有关。 三5’→3’外切酶活力: 它能从5’端水解核苷酸，还能经过几个核苷酸起作用，切除错配的核苷酸。

15 Klenow酶 可被枯草杆菌蛋白酶分解为两个片段
Klenow片段（Klenow fragment）: 分子量为76000，有聚合酶活性，并有3’→5外切酶活力 另一个片段分子量为34000，具有5’→’3’外切酶活力

16 Klenow酶的缺陷 高温变性 94 ℃ 失活 特异性差 37 ℃ 碱基错配 操作繁琐 每一个循环后重新加酶 价格昂贵 易污染 开管操作
高温变性 ℃ 失活 特异性差 ℃ 碱基错配 扩增的产物并非全是目的序列，需用探针检测。 操作繁琐 每一个循环后重新加酶 价格昂贵 易污染 开管操作

17 3.PCR的改进与完善 耐热DNA聚合酶的应用

18 Taq polymerase

19 美国黄石国家公园温泉的水生嗜热菌 Thermus aquaticus 1976
Chen.A, Edgar EB,Treia JM. Deoxyribonucleic acid polymerase from the extreme thermophile thermos aquaticus. J Bacterial, 1976, 127,1550

20 Taq polymerase 的特性 耐高温 70 ℃ 2h, 90%活性 93 ℃ 2h, 60%活性 95 ℃ 2h, 40%活性
退火温度/延伸温度高: ℃, 150nt/sec 特异性: 严格性提高，减少错配引物的延伸 灵敏度高 扩增效率好 扩增长度 kb-10Kb 专一性高 酶活性高 比活性为20万 U/mg

21 Taq polymerase in PCR 1988 Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase. Saiki RK, Gelfand DH, Stoffel S, Scharf SJ, Higuchi R, Horn GT, Mullis KB, Erlich HA. Cetus Corporation, Department of Human Genetics, Emeryville, CA A thermostable DNA polymerase was used in an in vitro DNA amplification procedure, the polymerase chain reaction. The enzyme, isolated from Thermus aquaticus, greatly simplifies the procedure and, by enabling the amplification reaction to be performed at higher temperatures, significantly improves the specificity, yield, sensitivity, and length of products that can be amplified. Single-copy genomic sequences were amplified by a factor of more than 10 million with very high specificity, and DNA segments up to 2000 base pairs were readily amplified. In addition, the method was used to amplify and detect a target DNA molecule present only once in a sample of 10(5) cells Science Jan 29;239(4839):487-91

22 意义: 用热稳定Taq DNA聚合酶代替大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段,使PCR操作大为简化，并使PCR自动化成为可能,酶的转一性和活性更强,有关PCR应用的问题迎刃而解。

23 The molecular of the year 1989
Guyer RL, Koshland Jr. The molecular of the year. Science, 1989, 22:1543

24 4. PCR仪的发明 1987年Kary Mullis等完成了自动化操作装置，使PCR技术进行实用阶段。 专利: 价值 3亿美元

25 PCR技术的基本原理 　类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成.

26 PCR步骤 标准的PCR过程分为三步： 1.DNA变性（94℃）：双链DNA模板在热作用下， 氢键断裂，形成单链DNA
3.延伸（72℃）：在Taq酶的作用下，以dNTP为原料，从引物的5′端→3′端延伸，合成与模板互补的DNA链。又可成为下次循环的模板. 　　每一循环经过变性、退火和延伸，DNA含量既增加一倍 。一个PCR有25-40个循环,每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增 倍.

27 PCR步骤

28 PCR步骤

29 模板变性温度:90～95℃ 1．变性温度是决定PCR反应中双链DNA解链的温度，达不到变性温度就不会产生单链DNA模板，PCR也就不会启动。变性温度低则变性不完全，DNA双链会很快复性，因而减少产量。一般取90～95℃。样品一旦到达此温度宜迅速冷却到退火温度。DNA变性只需要几秒种，时间过久没有必要；反之，在高温时间应尽量缩短，以保持Taq DNA聚合酶的活力，加入Taq DNA聚合酶后最高变性温度不宜超过95℃。

30 退火温度:Ta = Tm - 5℃ 2．引物退火温度决定PCR特异性与产量；温度高特异性强，但过高则引物不能与模板牢固结合，DNA扩增效率下降；温度低产量高，但过低可造成引物与模板错配，非特异性产物增加。也可根据引物的（G+C）%含量进行推测，把握试验的起始点，一般试验中退火温度Ta(annealing temperature)比扩增引物的融解温度Tm(melting temperature)低5℃，可按公式进行计算： Ta = Tm - 5℃= 4(G+C)+ 2(A+T) -5℃ 　　其中A，T，G，C分别表示相应碱基的个数。例如，20个碱基的引物，如果（G+C）%含量为50%时，则Ta的起点可设在55℃。在典型的引物浓度时（如0.2μmol/L）,退火反应数秒即可完成，长时间退火没有必要。

31 引物延伸温度: 72℃ 3．引物延伸温度的选择取决于Taq DNA聚合酶的最适温度。一般取70～75℃，在72℃时酶催化核苷酸的标准速率可达35～100个核苷酸/秒。每分钟可延伸1kb的长度，其速度取决于缓冲溶液的组成、pH值、盐浓度与DNA模板的性质。 扩增片段如短于150bp，则可省略延伸这一步，而成为双温循环，因Taq DNA聚合酶在退火温度下足以完成短序列的合成。对于100～300bp之间的短序列片段，采用快速、简便的双温循环是行之有效的。此时，引物延伸温度与退火温度相同。 对于1kb以上的DNA片段，可根据片段长度将延伸时间控制在1～7min，与此同时，在PCR缓冲液中需加入明胶或BSA试剂，使Taq DNA聚合酶在长时间内保持良好的活性与稳定性；15%～20%的甘油有助于扩增2.5kb左右或较长DNA片段。

32 循环次数: 25～40 4．循环次数常规PCR一般为25～40个周期。一般的错误是循环次数过多，非特异性背景严重，复杂度增加。当然循环反应的次数太少，则产率偏低。所以，在保证产物得率前提下，应尽量减少循环次数。

33 PCR扩增产物 可分为长产物片段和短产物片段两部分。
短产物片段的长度严格地限定在两个引物链5’端之间，是需要扩增的特定片段。短产物片段和长产物片段是由于引物所结合的模板不一样而形成的， 以一个原始模板为例: 在第一个反应周期中，以两条互补的DNA为模板，引物是从3’端开始延伸，其5’端是固定的，3’端则没有固定的止点，长短不一，这就是“长产物片段”。 进入第二周期后，引物除与原始模板结合外，还要同新合成的链(即“长产物片段”)结合。引物在与新链结合时，由于新链模板的5’端序列是固定的，这就等于这次延伸的片段3’端被固定了止点，保证了新片段的起点和止点都限定于引物扩增序列以内、形成长短一致的“短产物片段”。 “短产物片段”是按指数倍数增加， “长产物片段”则以算术倍数增加，几乎可以忽略不计，这使得PCR的反应产物不需要再纯化，就能保证足够纯DNA片段供分析与检测用。

34 PCR反应动力学 PCR的三个反应步骤反复进行，使DNA扩增量呈指数上升。反应最终的DNA 扩增量可用 Y＝X (1＋Z)n 计算。
Y代表DNA片段扩增后的拷贝数，X代表原始模板的数量，Z表示平均每次的扩增效率，n代表循环次数。 平均扩增效率的理论值为100%，但在实际反应中平均效率达不到理论值。

35 PCR反应动力学 Cycles Copies 1 2 4 16 10 1,024 15 32,768 20 1,048,576 25
33,554,432 30 1,073,741,824

36 PCR反应五要素 引物（primer） 酶 （Taq DNA polymerase）
dNTP （dATP, dGTP, dCTP, dTTP） 模板 （template） Mg2+ （magnesium）

37 引物设计基本原则 设计引物应遵循以下原则：
①引物长度： 15-30bp，常用为20bp左右。引物过短,非特异性扩增,引物过长, 易引起引物内二级结构,如发夹状结构hairpin loop。 ②引物扩增跨度： 以 bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段。实时荧光定量PCR 50－150bp。 ③.引物Tm值,一般要求：55℃-65℃。 计算：对于低于20个碱基的引物，Tm值可根据Tm=4(G C) 2(A T)来粗略估算对于较长引物，Tm值则需要考虑热动力学参数，从“最近邻位”的计算方式得到，这也是现有的引物设计软件最常用的计算方式。Tm = △H/(△ S R * ln (C/4)) 16.6 log ([K ]/(1 0.7 [K ])) 　 ④引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶 核苷酸的重复基序。 ⑤避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3'端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。

38 引物设计基本原则 ⑤引物3‘端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。最好是G/C, GC夹子. ⑥引物中有或能加上合适的酶切位点， 被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点， 这对酶切分析或分子克隆很有好处。 ⑦引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。 ⑧引物量： 每条引物的浓度0.1～1umol或10～100pmol，以最低引物　量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。

39 引物设计软件 Oligo7 PremierPrimer 5.6.0 Primer3 Dnasis Omiga Dnastar

40 酶 酶及其浓度　 目前有两种Taq DNA聚合酶供应， 一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶，另一种为大肠菌合成的基因工程酶。催化一典型的PCR反应约需酶量1.25U(指总反应体积为100ul时)，浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。

41 耐热DNA聚合酶的选择： 合理选择耐热DNA聚合酶是PCR成败与否的一个关键因素，如何选择最合适的耐热聚合酶，是进行PCR实验首先要考虑的问题。目前市面上有许多耐热DNA聚合酶，主要区别在于特异性、保真性、耐热性、扩增速率、扩增片段长度等几个指标。

42 各种耐热DNA聚合酶的特性

43 不同实验对酶的选择 1.克隆普通长度的目的DNA片段（可选产品：Taq、Taq Plus）
2.保真度要求较高，片段比较短，如点突变、基因筛选等（可选产品：Pfu、Taq Platinum） 3.高保真长片段扩增，如构建基因图谱及分子遗传学研究等（可选产品：Long Taq、Taq Plus） 4.扩增基因组模板，需要降低背景（可选产品：Hotstart Taq、Taq Platinum） 5.扩增GC含量较高或二级结构较复杂的模板（可选产品：Taq Plus、Long Taq、Taq Platinum） 6.实时荧光定量PCR反应（可选产品：Taq、Hotstart Taq、Taq Platinum） 7.从菌株或质粒模板，筛选鉴定目的克隆，扩增6kb以下的片段（可选产品：Taq、Taq Plus、2×Taq PCR MasterMix） 8.模板比较复杂或目的片段丰度低，用普通Taq酶扩增不出条带（可选产品：2×Taq PCR MasterMix、2×Pfu PCR MasterMix）

44 dNTP dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系，dNTP粉呈颗粒状，如保存不当易变性失去生物学活性。
dNTP溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后，以1M NaOH或1M Tris-HCL的缓冲液将其调节到pH 7.0～7.5； 小量分装， -20℃冰冻保存。多次冻融会使dNTP降解； 在PCR反应中，dNTP应为50～200umol/L，尤其是注意4种dNTP的浓度要相等( 等摩尔配制)，如其中任何一种浓度不同于其它几种时(偏高或偏低)，就会引起错配。浓度过低又会降低PCR产物的产量。dNTP能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降低

45 模板 单、双链DNA或RNA都可以作为PCR的样品。若起始材料是RNA，须先通过逆转录得到第一条cDNA。
虽然PCR可以仅用极微量的样品，甚至是来自单一细胞的DNA，但为了保证反应的特异性，还应用ng级的克隆DNA，μg水平的单拷贝染色体DNA或104拷贝的待扩增片段作为起始材料. 模板可以是粗品，但不能混有任何蛋白酶、核酸酶、Taq DNA聚合酶抑制剂以及能结合DNA的蛋白。

46 模板 模板(靶基因)核酸　模板核酸的量与纯化程度，是PCR成败与否的关键环节之一，传统的DNA纯化方法通常采用SDS和蛋白酶K来消化处理标本。 SDS的主要功能是： 溶解细胞膜上的脂类与蛋白质，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜，并解离细胞中的核蛋白，SDS 还能与蛋白质结合而沉淀； 蛋白酶K能水解消化蛋白质，特别是与DNA结合的组蛋白，再用有机溶剂酚与氯仿抽提掉蛋白质和其它细胞组份，用乙醇或异丙醇沉淀核酸。提取的核酸即可作为模板用于PCR反应。 一般临床检测标本，可采用快速简便的方法溶解细胞，裂解病原体，消化除去染色体的蛋白质使靶基因游离，直接用于PCR扩增。 RNA模板提取一般采用异硫氰酸胍或蛋白酶K法， 要防止RNase降解RNA。

47 Mg2+ Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响，
在一般的PCR反应中，各种dNTP浓度为200umol/L时，Mg2+浓度为 mmol/L为宜。 Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增， 浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的活性，使反应产物减少。

48 标准的PCR反应体系 10×扩增缓冲液 5ul 4种dNTP混合物 各200umol/L 引物 10～100pmol
模板DNA ～2ug Taq DNA聚合酶 u Mg mmol/L 双或三蒸水至 ul

49 扩增平台 扩增反应并不是可以无穷地进行下去的，经过一定的循环周期后需扩增的片段不再按指数增多而逐渐进入平台；
进入平台的循环次数，取决于起始时存在的模板拷贝数以及合成的DNA总量。 所谓平台就是批PCR循环的后期，合成产物达0.3～1pmol时，由于产物的堆积等原因，使原来以指数增加的速率变成平坦的曲线。

50 扩增平台 造成PCR进入平坡的原因有：引物和dNTP等消耗完毕、Taq酶失活，这几中因素在标准反应中均不会出现。 此外，还有几种可能：
1．底物过剩　　因DNA合成量多于反应液中存在的Taq酶，在100μl反应液中含2.5Utaq酶而DNA合成量达1μg（3nmol脱氧核苷酸）时，开始变为底物过剩。延长延伸时间或添加Taq酶，可以克服之。但不实用，因每进行下一循环就要延长延伸时间一倍及多加一倍Taq酶，才能继续保持指数增长。 2．非特异性扩增产物的竞争　此时不需要的DNA片段与需要的片段同时竞争聚合酶，要克服这一情况是要提高反应特异性，使不需要片段不能大量积聚。 3．退火时产物的单链自己缔合　　两条单链的DNA片段在退火时除了与引物缔合外，也可以自行缔合，这也会阻止产品增多。当产物浓度到达10pmol/100μl时即可发生此现象，除稀释外无法克服。 4．变性在高浓度产物条件下，产物解链不完全，以及最终产物的阻化作用（焦磷酸化，双链DNA）。

51 PCR反应特点 1 特异性强  PCR反应的特异性决定因素为： 　　　①引物与模板DNA特异正确的结合； 　　　②碱基配对原则； 　　　③Taq DNA聚合酶合成反应的忠实性； 　　　④靶基因的特异性与保守性。 　　其中引物与模板的正确结合是关键。引物与模板的结合及引物链的延伸是遵循碱基配对原则的。聚合酶合成反应的忠实性及Taq DNA聚合酶耐高温性，使反应中模板与引物的结合(复性)可以在较高的温度下进行，结合的特异性大大增加，被扩增的靶基因片段也就能保持很高的正确度。再通过选择特异性和保守性高的靶基因区，其特异性程度就更高。

52 PCR反应特点 2 灵敏度高  PCR产物的生成量是以指数方式增加的，能将皮克(pg=10-12g)量级的起始待测模板扩增到微克(ug=10-6g)水平。能从100万个细胞中检出一个靶细胞；在病毒的检测中，PCR的灵敏度可达3个RFU(空斑形成单位)；在细菌学中最小检出率为3个细菌。

53 PCR反应特点3  操作简便: 目前PCR技术采用耐高温Taq DNA聚合酶，并且在有电脑控制的DNA扩增仪中进行，使操作大为简化，一次加入的酶即可满足反应全过程。DNA扩增仪能自动迅速升降温度，只需把反应所需的全部材料混匀，置入仪器内，反应便依所输入的程序进行。2-3h完成.

54 PCR反应特点4  对标本的纯度要求低  不需要分离病毒或细菌及培养细胞，DNA 粗制品及总RNA均可作为扩增模板。可直接用临床标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等粗制的DNA扩增检测

55 PCR扩增产物分析   PCR产物是否为特异性扩增 ，其结果是否准确可靠，必须对其进行严格的分析与鉴定，才能得出正确的结论。PCR产物的分析，可依据研究对象和目的不同而采用不同的分析方法。

56 凝胶电泳分析：PCR产物电泳，EB溴乙锭染色紫外仪下观察，初步判断产物的特异性。PCR产物片段的大小应与预计的一致，特别是多重PCR，应用多对引物，其产物片断都应符合预讦的大小，这是起码条件。
琼脂糖凝胶电泳： 通常应用1～2%的琼脂糖凝胶，供检测用。 聚丙烯酰胺凝胶电泳：6～10%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离效果比琼脂糖好，条带比较集中，可用于科研及检测分析。 酶切分析：根据PCR产物中限制性内切酶的位点，用相应的酶切、电泳分离后，获得符合理论的片段，此法既能进行产物的鉴定，又能对靶基因分型，还能进行变异性研究。 分子杂交：分子杂交是检测PCR产物特异性的有力证据，也是检测PCR 产物碱基突变的有效方法。 Southern印迹杂交： 在两引物之间另合成一条寡核苷酸链(内部寡核苷酸)标记后做探针，与PCR产物杂交。此法既可作特异性鉴定，又可以提高检测PCR产物的灵敏度，还可知其分子量及条带形状，主要用于科研。 核酸序列分析：是检测PCR产物特异性的最可靠方法。

57 PCR技术的发展 定量PCR 荧光PCR Touch-down PCR RT-PCR 兼并引物PCR 巢式PCR 反向PCR 不对称PCR
连接酶链反应 RACE-PCR CHIP AFLP MSP-甲基化特异性PCR 多重PCR DD-PCR PCR-SSCP LA-PCR

58 PCR仪器的发展 　 PCR温度循环至关重要，PCR扩增仪各参数必须准确。自Perkin –Elmer Cetus公司第一台PCR扩增仪问世以来，现已有几十家不同的厂家在国内外生产和销售PCR扩增仪。在短短的20年间，扩增仪经过几代的发展，不断采用新技术，并且进一步朝方便、实用、高智能化和自动化的方向发展。

59 PCR应用领域1 1．遗传病的产前诊断　用胎儿羊膜细胞，羊水或甚至母血可以检查胎儿的性别，这在与性染色体关联遗传病诊断中是必要的。对于高发的遗传病，如地中海贫血、镰刀状细胞贫血、凝血因子缺乏、DMD等已在临床应用多年，为优生优育作了贡献。 2．致病病原体的检测　这些外源入侵的基因，一旦阐明其部分核酸序列，就可以设计引物或探针，用PCR、PT-PCR或杂交方法来检测，其范围包括细菌、病毒、原虫及寄生虫、霉菌、立克次体、衣原体和支原体等一切微生物，PCR诊断的特点是可以选择其基因中的保守区作通用检测，也可以选定差异较大的基因部位作分型检测。既可以做一病原体的专用检测，也可以将有关病毒、细菌中不同的品种作一次多元检测。而且检测的灵敏度和特异性都远高于当前的免疫学方法，所需时间也已达到临床要求，这对于难于培养的病毒（乙肝），细菌（如结核、厌氧菌）和原虫（如梅毒螺旋体）等来说尤为适用。

60 PCR应用领域2 3．癌基因的检测和诊断　 临床上已可应用的例子有白血病残留细胞的定量（包括慢粒和急粒），肺癌中P53及Rb等抗癌基因的失活，神经质瘤N-myc基因的激活和表达。

61 乳腺癌相关新基因融合的预测和验证 生物信息学和RT-PCR
Genome Biology (accepted)

62 PCR应用领域3 4．DNA指纹、个体识别、亲子关系鉴别及法医物证　肌红蛋白小卫星基因，β-珠蛋白基因、ApoB基因等的多肽性和重复次数的差异都被应用于鉴定，其灵敏度已达到一根头发、一个细胞、一个精子取得个体特征图谱. 骨髓或脏器移植配型及动物种系的研究中。

63 1998年8月17日

64 PCR应用领域4 5．高科技生物医学领域中的应用人类基因组计划　769 全基因组测序已报道,3666进行中,

65 谢 谢!