Protein Sample Preparation for Proteomic Research

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1 Protein Sample Preparation for Proteomic Research
蛋白質體學 Proteomics 2016 純化酵素是一件非常基本的工作，很多重要的研究，都脫不開酵素的純化工作。而大多數酵素的純化，基本上也脫不開一些最基本的原則。 首先，建立一個完善的酵素實驗室是很必要的；我們把許多實驗室內的運作細節一一交代，期望同學能認知這些經驗，確實接收並養成習慣，且期望應用到將來每個人的研究工作上。 最先遇到，但是最容易被忽視的步驟，就是材料處理及總蛋白質的抽取。將提醒你小心選擇採料的種類、時期、部位等，並選擇一個良好的粗抽取方式，以便有一個良好的開始。 Protein Sample Preparation for Proteomic Research 陳威戎

2 References 1. Enzyme Purification and Analysis (2005), Juang R. H. (台大生化科技系 莊榮輝老師) 2. Principles of Proteomics (2004), Twyman R. M. ed. 3. Ettan Sample Preparation Manual – Right from the start, Amersham Biosciences 4. Introduction to Protein Science (2010), Arthur M. Lesk ed. (Oxford U. Press) 5. Proteins- Structure and Function (2005), David Whitford ed. (John Wiley & Sons Ltd.) 純化酵素是一件非常基本的工作，很多重要的研究，都脫不開酵素的純化工作。而大多數酵素的純化，基本上也脫不開一些最基本的原則。 首先，建立一個完善的酵素實驗室是很必要的；我們把許多實驗室內的運作細節一一交代，期望同學能認知這些經驗，確實接收並養成習慣，且期望應用到將來每個人的研究工作上。 最先遇到，但是最容易被忽視的步驟，就是材料處理及總蛋白質的抽取。將提醒你小心選擇採料的種類、時期、部位等，並選擇一個良好的粗抽取方式，以便有一個良好的開始。

3 Proteome Analysis and Proteomics
純化酵素是一件非常基本的工作，很多重要的研究，都脫不開酵素的純化工作。而大多數酵素的純化，基本上也脫不開一些最基本的原則。 首先，建立一個完善的酵素實驗室是很必要的；我們把許多實驗室內的運作細節一一交代，期望同學能認知這些經驗，確實接收並養成習慣，且期望應用到將來每個人的研究工作上。 最先遇到，但是最容易被忽視的步驟，就是材料處理及總蛋白質的抽取。將提醒你小心選擇採料的種類、時期、部位等，並選擇一個良好的粗抽取方式，以便有一個良好的開始。

4 Proteomic Approaches 純化酵素是一件非常基本的工作，很多重要的研究，都脫不開酵素的純化工作。而大多數酵素的純化，基本上也脫不開一些最基本的原則。 首先，建立一個完善的酵素實驗室是很必要的；我們把許多實驗室內的運作細節一一交代，期望同學能認知這些經驗，確實接收並養成習慣，且期望應用到將來每個人的研究工作上。 最先遇到，但是最容易被忽視的步驟，就是材料處理及總蛋白質的抽取。將提醒你小心選擇採料的種類、時期、部位等，並選擇一個良好的粗抽取方式，以便有一個良好的開始。

5 With Proteomics to Quicker Results
純化酵素是一件非常基本的工作，很多重要的研究，都脫不開酵素的純化工作。而大多數酵素的純化，基本上也脫不開一些最基本的原則。 首先，建立一個完善的酵素實驗室是很必要的；我們把許多實驗室內的運作細節一一交代，期望同學能認知這些經驗，確實接收並養成習慣，且期望應用到將來每個人的研究工作上。 最先遇到，但是最容易被忽視的步驟，就是材料處理及總蛋白質的抽取。將提醒你小心選擇採料的種類、時期、部位等，並選擇一個良好的粗抽取方式，以便有一個良好的開始。

6 Genomics and proteomics: high throughput
純化酵素是一件非常基本的工作，很多重要的研究，都脫不開酵素的純化工作。而大多數酵素的純化，基本上也脫不開一些最基本的原則。 首先，建立一個完善的酵素實驗室是很必要的；我們把許多實驗室內的運作細節一一交代，期望同學能認知這些經驗，確實接收並養成習慣，且期望應用到將來每個人的研究工作上。 最先遇到，但是最容易被忽視的步驟，就是材料處理及總蛋白質的抽取。將提醒你小心選擇採料的種類、時期、部位等，並選擇一個良好的粗抽取方式，以便有一個良好的開始。

7 Workflow of proteomic research
純化酵素是一件非常基本的工作，很多重要的研究，都脫不開酵素的純化工作。而大多數酵素的純化，基本上也脫不開一些最基本的原則。 首先，建立一個完善的酵素實驗室是很必要的；我們把許多實驗室內的運作細節一一交代，期望同學能認知這些經驗，確實接收並養成習慣，且期望應用到將來每個人的研究工作上。 最先遇到，但是最容易被忽視的步驟，就是材料處理及總蛋白質的抽取。將提醒你小心選擇採料的種類、時期、部位等，並選擇一個良好的粗抽取方式，以便有一個良好的開始。

8 Major equipment for proteomic research
純化酵素是一件非常基本的工作，很多重要的研究，都脫不開酵素的純化工作。而大多數酵素的純化，基本上也脫不開一些最基本的原則。 首先，建立一個完善的酵素實驗室是很必要的；我們把許多實驗室內的運作細節一一交代，期望同學能認知這些經驗，確實接收並養成習慣，且期望應用到將來每個人的研究工作上。 最先遇到，但是最容易被忽視的步驟，就是材料處理及總蛋白質的抽取。將提醒你小心選擇採料的種類、時期、部位等，並選擇一個良好的粗抽取方式，以便有一個良好的開始。

9 蛋白質體研究的挑戰 Challenges of proteomics
純化酵素是一件非常基本的工作，很多重要的研究，都脫不開酵素的純化工作。而大多數酵素的純化，基本上也脫不開一些最基本的原則。 首先，建立一個完善的酵素實驗室是很必要的；我們把許多實驗室內的運作細節一一交代，期望同學能認知這些經驗，確實接收並養成習慣，且期望應用到將來每個人的研究工作上。 最先遇到，但是最容易被忽視的步驟，就是材料處理及總蛋白質的抽取。將提醒你小心選擇採料的種類、時期、部位等，並選擇一個良好的粗抽取方式，以便有一個良好的開始。

10 Proteomics Technology
純化酵素是一件非常基本的工作，很多重要的研究，都脫不開酵素的純化工作。而大多數酵素的純化，基本上也脫不開一些最基本的原則。 首先，建立一個完善的酵素實驗室是很必要的；我們把許多實驗室內的運作細節一一交代，期望同學能認知這些經驗，確實接收並養成習慣，且期望應用到將來每個人的研究工作上。 最先遇到，但是最容易被忽視的步驟，就是材料處理及總蛋白質的抽取。將提醒你小心選擇採料的種類、時期、部位等，並選擇一個良好的粗抽取方式，以便有一個良好的開始。

11 蛋白質樣品製備 Sample preparation in proteomics
純化酵素是一件非常基本的工作，很多重要的研究，都脫不開酵素的純化工作。而大多數酵素的純化，基本上也脫不開一些最基本的原則。 首先，建立一個完善的酵素實驗室是很必要的；我們把許多實驗室內的運作細節一一交代，期望同學能認知這些經驗，確實接收並養成習慣，且期望應用到將來每個人的研究工作上。 最先遇到，但是最容易被忽視的步驟，就是材料處理及總蛋白質的抽取。將提醒你小心選擇採料的種類、時期、部位等，並選擇一個良好的粗抽取方式，以便有一個良好的開始。

12 Right from the start: Preparation is everything
The first step to generating reliable, accurate results is getting the first step right. Sample preparation is crucial to obtaining good data. Key proteins lost during initial sample preparation can never be restored. 純化酵素是一件非常基本的工作，很多重要的研究，都脫不開酵素的純化工作。而大多數酵素的純化，基本上也脫不開一些最基本的原則。 首先，建立一個完善的酵素實驗室是很必要的；我們把許多實驗室內的運作細節一一交代，期望同學能認知這些經驗，確實接收並養成習慣，且期望應用到將來每個人的研究工作上。 最先遇到，但是最容易被忽視的步驟，就是材料處理及總蛋白質的抽取。將提醒你小心選擇採料的種類、時期、部位等，並選擇一個良好的粗抽取方式，以便有一個良好的開始。

13 Sample preparation- right from the start
蛋白質樣品抽取 Sample extraction 蛋白質樣品溶解 Sample solubilization 蛋白質樣品分劃 Sample fractionation 蛋白質樣品清潔 Sample clean-up 細胞裂解與均質 Cell lysis and homogenization 其他污染物移除 Removal of other contaminants 防止蛋白酶水解 Prevention against proteolysis 純化酵素是一件非常基本的工作，很多重要的研究，都脫不開酵素的純化工作。而大多數酵素的純化，基本上也脫不開一些最基本的原則。 首先，建立一個完善的酵素實驗室是很必要的；我們把許多實驗室內的運作細節一一交代，期望同學能認知這些經驗，確實接收並養成習慣，且期望應用到將來每個人的研究工作上。 最先遇到，但是最容易被忽視的步驟，就是材料處理及總蛋白質的抽取。將提醒你小心選擇採料的種類、時期、部位等，並選擇一個良好的粗抽取方式，以便有一個良好的開始。

14 蛋白質樣品抽取 Sample extraction
如何開始？ How to start? 5W principles 基本原則 材料來源 Materials & sources 材料取得與保存 均質及抽取 Homogenization & extraction 確實做好第一步 進行純化的第一階段，是由取得材料至抽取出全體蛋白質： 開始純化蛋白質之前，要先考慮五項要點： What, Why, Where, When, How，全面檢討整體研究方向的正確性。當然，這五點所針對的目標就是實驗材料，也就是整個研究的主角。仔細考量這些因素之後，以最有效率的策略把材料均質，抽提細胞內外的可溶物質，並以鹽析法沈澱出全部蛋白質，達成第一階段分離。一定要小心檢討是否選對材料，是否均質完全，是否把所要的蛋白質都沈澱下來，否則以後的純化工作將會很辛苦。 Juang RH (2005) EPA

15 ■ 如何開始？ How to start? 先考慮以下諸點： 5W a. 要純化那一個蛋白質？ What ?
b. 為何要純化此蛋白質？ Why ? c. 由何種材料純化？ Where, from ? d. 由那一個生長期？ When ? e. 如何純化此蛋白質？ How ? 別輸在起跑點上： 若一開始所採樣的樣本種類、時間、方法、貯藏等步驟有問題，那麼下游各階段的分離與純化將不具任何意義。 我曾經審查一篇抽取微生物酵素的碩士論文，發現其總回收率超乎尋常的低，一路追蹤回去，發現從一開始的酵素量就很低，但這株微生物好像又的確能生產這種酵素。幾番推敲，才確定這位研究生可能一開始就沒有打破細胞，只利用少數 (不小心) 被打破的細胞所釋放出來的酵素在做實驗，真是辛苦 (要怪誰呢？)。 Juang RH (2005) EPA

16 ■ 酵素蛋白質純化過程的三個階段 Three stages
(1) 粗蛋白 (crude protein)︰ 採樣 → 均質打破細胞 → 抽出全部蛋白， 多用鹽析沉澱法。 (2) 部分純化 (partially purified)︰ 初步的純化，使用各種管柱層析法。 酵素純化的過程大致分成三個階段： 這是武斷的分野，只為方便說明而已。 三個階段都各有其特色與重點，你可能花最多時間在第二階段，但最可能栽在第一階段，而能夠到達第三階段的酵素量將是極微。 近幾年來的生物科技發展，使得分析工具的靈敏度提高極多，像質譜儀的靈敏度可達 pmole 以下。因此，不見得要一步一步純化出目標酵素，可用二次元電泳把蛋白質二維排開，挖出所要的色點，直接送去質譜分析，其結果以電腦在資料庫中分析比對，馬上可得知該蛋白質的身分。這樣的快速分離檢定，打破了以往傳統一步一步純化的觀念與做法。更有甚者，由於基因選殖技術的方便與風行，很多酵素的基因非常容易就可取得，因此以基因表現的方式來製備酵素或蛋白質，再以親和層析管柱進行快速純化，就變成目前獲得酵素或蛋白質的標準流程。 然而，傳統的純化就再也不需要了嗎？ 非也。 因為這些純化方法都是根基於蛋白質的基本構造與性質來設計的，因此是瞭解蛋白質基礎背景的極佳工具。若一個研究工作者沒有傳統蛋白質純化的經驗，就很難說他真的對蛋白質的性質有深刻瞭解。 (3) 均質酵素 (homogeneous)︰ 目標酵素的進一步精製純化，可用製備式電 泳或 HPLC 等。 Juang RH (2005) EPA

17 ■ 酵 素 純 化 階 段 及 分 析 方 法 A B (1) 粗蛋白 (2) 部分純化 (3) 均質酵素 Crude protein
Purification B Analysis Material Background knowledge about Material Protein / Activity assay Extraction (1) 粗蛋白 Crude protein (1) Crude Protein (1% pure) Electrophoresis Naive-PAGE SDS-PAGE Gradient PAGE Protein fractionation Ammonium sulfate Organic solvent Kinetic study Molecular weight Sedimentation coefficient determination Quaternary structure Isoelectric focusing Peptide mapping Chromatography (2) 部分純化 Partially purified Gel filtration Ion exchange Affinity chromatography FPLC (2) Partially Purified (50~90% pure) 圖 2.1  酵素純化階段與各種分析方法： 純化三階段所用到的一些純化與分析方法，將一一在本課程講述，但我們只能焦聚在前面兩個階段，尤其是色層分析法以及電泳法；第三個階段的各種分析方法，都是可以獨立成一門課的高階技術工具，請去修習相關的課程。 Electrophoresis Preparative electrophoresis Isoelectric focusing Amino acid analysis Protein sequencing Extinction coefficient Pure Enzyme (3) 均質酵素 Homogeneous Antibody production Immunoassays Immunoblotting ELISA Double diffusion Immunoelectrophoresis (3) Homogeneous (>99%) Monoclonal or conventional X-Ray crystallography Crystal Spectrometric methods CD, ORD, NMR & ESR Juang RH (2005) EPA

18 Amino acid, monosaccharide, nucleotide, fatty acid
■ 各種純化或分析方法的原理 Cell Organelle separation? Cell homogenization Macro molecules 細胞 碎片 Cell debris Small molecules Amino acid, monosaccharide, nucleotide, fatty acid Protein Nucleic acid Polysaccharides 各種純化方法所依據的蛋白質特性不同： 酵素研究大多要先把該酵素純化出來，才能夠做進一步的分析與鑑定。酵素來源通常由細胞取得，在打破細胞後離心除去細胞碎片。所得到的巨分子中，有核酸、蛋白質、多糖類與脂質的聚合物 (脂質不是巨分子)，再來可以用硫酸銨把所有蛋白質沈澱下來，酵素即包含在其中。接著，我們可以利用各種酵素分子間的性質差異，來做進一步的純化；例如，分子量不同的酵素，可以利用膠體過濾法 (gel filtration) 來分離。以上各種蛋白質的性質差異，可以用不同的組合方式，來分離純化蛋白質，一直到接近純質為止。請注意，一般都是以水溶性蛋白質為對象，若是脂溶性的疏水蛋白質，則整個系統就要加入界面活性劑助溶，各種操作方法都會稍有改變。 Ammonium sulfate precipitation Molecular size Molecular charge Molecular polarity Affinity Ion exchange, Chromatofocusing, Disc-PAGE, Isoelectric focusing Reverse phase chromatography, HIC, Salting-out Gel filtration, SDS-PAGE, Ultrafiltration Affinity chromatography, Hydroxyapatite Basic protein properties useful for planning separation steps Juang RH (2005) EPA

19 ■ 目標材料之選擇 What’s your starting material?
Which organism? 動物、植物、微生物 Which tissue? 根莖葉花果或組織培養 Which organelle? 細胞核、液泡、葉綠体 Secreted enzyme? 有關酵素的穩定性 Membrane protein? 影響抽取策略的設計 你的目標酵素在哪裡？ 最好能預先得知所要純化酵素在細胞內外的分布情形，將有助於材料選擇、採集，以及純化方法的擬定。通常，分泌到細胞外面的酵素，都會比較穩定，因為它必須在嚴苛的胞外環境下運作，也比較耐得住蛋白質水解脢攻擊。而且，胞外酵素因為已經分泌在細胞外，不見得要打破細胞才能抽出，也是很大的方便。 有部份酵素或蛋白質附在細胞膜上，或者直接鑲嵌在細胞膜內。這種脂溶性的蛋白質，就比較不易處理，整個純化系統都要加入界面活性劑；更有些酵素在脫開細胞膜後，活性就會下降。 Juang RH (2005) EPA

20 Buchanan et al (2000) Biochemistry and Molecular Biology of Plants p.8
■ 細胞膜蛋白質抽取較困難 Membrane proteins ● Detergent (Triton X) is used to solubilize membrane proteins 細胞膜蛋白質較不具極性： 細胞膜蛋白質的表面，有相當的非極性區域，因此必須以界面活性劑 (Triton, Tween 等) 溶入水溶液中，以利抽取及分離。 細胞膜蛋白質有很重要的生理活性，例如荷爾蒙受體、細胞幫浦、信息傳導分子等，絕對不可因為難以處理而敬遠之。 Polar Non-polar Buchanan et al (2000) Biochemistry and Molecular Biology of Plants p.8

21 Sample Preparation 純化酵素是一件非常基本的工作，很多重要的研究，都脫不開酵素的純化工作。而大多數酵素的純化，基本上也脫不開一些最基本的原則。 首先，建立一個完善的酵素實驗室是很必要的；我們把許多實驗室內的運作細節一一交代，期望同學能認知這些經驗，確實接收並養成習慣，且期望應用到將來每個人的研究工作上。 最先遇到，但是最容易被忽視的步驟，就是材料處理及總蛋白質的抽取。將提醒你小心選擇採料的種類、時期、部位等，並選擇一個良好的粗抽取方式，以便有一個良好的開始。

22 Cell disruption methods
純化酵素是一件非常基本的工作，很多重要的研究，都脫不開酵素的純化工作。而大多數酵素的純化，基本上也脫不開一些最基本的原則。 首先，建立一個完善的酵素實驗室是很必要的；我們把許多實驗室內的運作細節一一交代，期望同學能認知這些經驗，確實接收並養成習慣，且期望應用到將來每個人的研究工作上。 最先遇到，但是最容易被忽視的步驟，就是材料處理及總蛋白質的抽取。將提醒你小心選擇採料的種類、時期、部位等，並選擇一個良好的粗抽取方式，以便有一個良好的開始。

23 Cell lysis and homogenization
The first step in protein analysis is the disruption of cells or tissues, and homogenization. The method used to isolate proteins from intact cells and tissues should - minimize loss of proteins, especially membrane- bound proteins - maximize recovery - retain the structural integrity of the protein - avoid introducing new contaminants - concentrate the sample to optimal detection range 純化酵素是一件非常基本的工作，很多重要的研究，都脫不開酵素的純化工作。而大多數酵素的純化，基本上也脫不開一些最基本的原則。 首先，建立一個完善的酵素實驗室是很必要的；我們把許多實驗室內的運作細節一一交代，期望同學能認知這些經驗，確實接收並養成習慣，且期望應用到將來每個人的研究工作上。 最先遇到，但是最容易被忽視的步驟，就是材料處理及總蛋白質的抽取。將提醒你小心選擇採料的種類、時期、部位等，並選擇一個良好的粗抽取方式，以便有一個良好的開始。

24 打破細胞的方法 101 ways to break the cell
Dry way: 液態氮研磨 (grinding in liquid nitrogen), 磨粉機 (coffee grinder), 球磨機 (ball mill) Wet way: 均質器 (homogenizer), 果汁機 (Waring blender), Polytron, 研砵 (mortar), 玻璃球 (glass bead mill), 超音波震盪 (ultrasonication), French press 打破細胞可用乾式或溼式： 乾式研磨後得到粉末狀之樣本，再加抽提緩衝液溶出所要的物質，而溼式則直接在緩衝液中研磨。注意打破細胞後就必須降溫，因此這些研磨動作通常都在低溫下進行，除非你的目標物質並不怕溫度、氧化、或其他外來因素的影響。以上各種方法的介紹，請看講義文字。 打破細胞最重要的考量是，能否有效把目標蛋白質抽取出來？ 因此研磨抽提之後，一定要先以各種方法檢定抽取效果，才能進行下一步純化動作。以蛋白質而言，大概以電泳檢視所抽出的蛋白質含量與大小，並且以適當的蛋白質定量法測定所收得的量，請注意有些抽取緩衝液含有干擾蛋白質定量的物質 (如 Triton 或尿素)。 Is your target protein released from the cell? Juang RH (2005) EPA

25 研磨樣本常用方法 Two popular methods
● Use Polytron 兩種相當流行而有效的全面均質方法： 用液態氮把樣本急速冷凍，變脆的樣本在研缽內便很容易搗碎，可直接地得到粉末狀樣本，等到回復室溫後，再倒入緩衝液抽提。 使用 Polytron 則在懸濁態的樣本中進行均質，其研磨棒為雙層管狀構造 (上圖左半)，外層前端的研磨棒頭部有一圈垂直細孔 (圓圈所指)，樣本從研磨棒底部吸入 (粗箭頭)，立刻由細孔四向噴出 (細虛線箭頭)，在噴出之同時，內層有一圈刀片快速轉動 (外層管不動)，在樣本通過細孔時有效切割。研磨棒有各種大小，以應付各種樣本容量，可低至 0.5 mL 在微量離心管中操作。 Various size of probe ● Use liquid nitrogen Juang RH (2005) EPA

26 細胞打破之後 After breaking the cell…..
(1) 降低溫度 Keep temperature low (2) 儘速純化 Purify as soon as possible (3) 避免氧化 Avoid oxidation 一旦打破細胞，你的生活就進入讀秒階段： 進行生化實驗通常都要與時間賽跑。因為一旦細胞被打破，細胞內的蛋白質暴露在空氣中，開始受到氧化作用；另外，細胞裡面許多原本被隔開來的物質，全部混在一起，互相間會有許多想不到的作用關係。因此，細胞均質之後最重要的事情，就是要保持在低溫下，降低各成份分子之間的相互作用速率，有時候甚至在充氮氣下進行操作，以便降低氧化作用。 另外，空氣中的微生物也會趁機侵入樣本中，開始生長並利用均質液中的養分，排出雜質或者代謝物質，都會影響實驗結果。 如何因應這些問題？ 首先，預備做好所有的準備工作，包括規劃好整個實驗流程，並且熟悉所有操作步驟。事前準備工作還包括把所要使用的儀器學會正確而流暢地操作，找到所有的道具、零件、配件等。另外，個人的操作習慣是否整齊、清潔、簡單、樸素、迅速、確實，這些看似小學生的生活週訓，卻也是高等研究工作成敗之所繫 (絕不誇張)。 (4) 避免吸著 Avoid adsorption by flask (5) 避免污染 Avoid contamination Juang RH (2005) EPA

27 蛋白質樣品溶解 Sample solubilization
Neutral chaotropes Urea (8~9 M) Urea (7 M) + thiourea (2 M) Neutral or zwitterionic detergent Triton X-100 Nonidet P-40 (NP-40) CHAPS (2~4%) SBS-10 (SDS ?) Reducing agents for disulfide bonds 2-mercaptoethanol Dithiothreitol (DTT) Dithioerythritol (DTE) Tributylphosphine (TBP) Ampholytes and buffer Ampholyte: 2% (v/v) Buffer: 10~100 mM 純化酵素是一件非常基本的工作，很多重要的研究，都脫不開酵素的純化工作。而大多數酵素的純化，基本上也脫不開一些最基本的原則。 首先，建立一個完善的酵素實驗室是很必要的；我們把許多實驗室內的運作細節一一交代，期望同學能認知這些經驗，確實接收並養成習慣，且期望應用到將來每個人的研究工作上。 最先遇到，但是最容易被忽視的步驟，就是材料處理及總蛋白質的抽取。將提醒你小心選擇採料的種類、時期、部位等，並選擇一個良好的粗抽取方式，以便有一個良好的開始。

28 Reducing agents 純化酵素是一件非常基本的工作，很多重要的研究，都脫不開酵素的純化工作。而大多數酵素的純化，基本上也脫不開一些最基本的原則。 首先，建立一個完善的酵素實驗室是很必要的；我們把許多實驗室內的運作細節一一交代，期望同學能認知這些經驗，確實接收並養成習慣，且期望應用到將來每個人的研究工作上。 最先遇到，但是最容易被忽視的步驟，就是材料處理及總蛋白質的抽取。將提醒你小心選擇採料的種類、時期、部位等，並選擇一個良好的粗抽取方式，以便有一個良好的開始。

29 Protein Precipitation
純化酵素是一件非常基本的工作，很多重要的研究，都脫不開酵素的純化工作。而大多數酵素的純化，基本上也脫不開一些最基本的原則。 首先，建立一個完善的酵素實驗室是很必要的；我們把許多實驗室內的運作細節一一交代，期望同學能認知這些經驗，確實接收並養成習慣，且期望應用到將來每個人的研究工作上。 最先遇到，但是最容易被忽視的步驟，就是材料處理及總蛋白質的抽取。將提醒你小心選擇採料的種類、時期、部位等，並選擇一個良好的粗抽取方式，以便有一個良好的開始。

30 Protease Inhibitors 純化酵素是一件非常基本的工作，很多重要的研究，都脫不開酵素的純化工作。而大多數酵素的純化，基本上也脫不開一些最基本的原則。 首先，建立一個完善的酵素實驗室是很必要的；我們把許多實驗室內的運作細節一一交代，期望同學能認知這些經驗，確實接收並養成習慣，且期望應用到將來每個人的研究工作上。 最先遇到，但是最容易被忽視的步驟，就是材料處理及總蛋白質的抽取。將提醒你小心選擇採料的種類、時期、部位等，並選擇一個良好的粗抽取方式，以便有一個良好的開始。

31 Desalting techniques 純化酵素是一件非常基本的工作，很多重要的研究，都脫不開酵素的純化工作。而大多數酵素的純化，基本上也脫不開一些最基本的原則。 首先，建立一個完善的酵素實驗室是很必要的；我們把許多實驗室內的運作細節一一交代，期望同學能認知這些經驗，確實接收並養成習慣，且期望應用到將來每個人的研究工作上。 最先遇到，但是最容易被忽視的步驟，就是材料處理及總蛋白質的抽取。將提醒你小心選擇採料的種類、時期、部位等，並選擇一個良好的粗抽取方式，以便有一個良好的開始。

32 Nucleic acids removal 純化酵素是一件非常基本的工作，很多重要的研究，都脫不開酵素的純化工作。而大多數酵素的純化，基本上也脫不開一些最基本的原則。 首先，建立一個完善的酵素實驗室是很必要的；我們把許多實驗室內的運作細節一一交代，期望同學能認知這些經驗，確實接收並養成習慣，且期望應用到將來每個人的研究工作上。 最先遇到，但是最容易被忽視的步驟，就是材料處理及總蛋白質的抽取。將提醒你小心選擇採料的種類、時期、部位等，並選擇一個良好的粗抽取方式，以便有一個良好的開始。

33 Ettan Sample Preparation Kits
純化酵素是一件非常基本的工作，很多重要的研究，都脫不開酵素的純化工作。而大多數酵素的純化，基本上也脫不開一些最基本的原則。 首先，建立一個完善的酵素實驗室是很必要的；我們把許多實驗室內的運作細節一一交代，期望同學能認知這些經驗，確實接收並養成習慣，且期望應用到將來每個人的研究工作上。 最先遇到，但是最容易被忽視的步驟，就是材料處理及總蛋白質的抽取。將提醒你小心選擇採料的種類、時期、部位等，並選擇一個良好的粗抽取方式，以便有一個良好的開始。

34 蛋白質樣品清潔 Sample clean-up
Protein precipitation is often applied prior to 2-DE to: 1. selectively separate proteins from contaminating substances. 2. concentrate proteins from samples that are too dilute for effective analysis. Incomplete protein precipitation results in significant loss of total protein from the sample, introducing a bias to the result. 純化酵素是一件非常基本的工作，很多重要的研究，都脫不開酵素的純化工作。而大多數酵素的純化，基本上也脫不開一些最基本的原則。 首先，建立一個完善的酵素實驗室是很必要的；我們把許多實驗室內的運作細節一一交代，期望同學能認知這些經驗，確實接收並養成習慣，且期望應用到將來每個人的研究工作上。 最先遇到，但是最容易被忽視的步驟，就是材料處理及總蛋白質的抽取。將提醒你小心選擇採料的種類、時期、部位等，並選擇一個良好的粗抽取方式，以便有一個良好的開始。

35 Sample clean-up~ How it works?
Uses precipitant and coprecipitant in combination to quantitatively precipitate the sample proteins. These proteins are pelleted by centrifugation and the precipitate is further washed to remove non-protein contaminants. After a second centrifugation, the resultant pellet is resuspended into denaturing sample solution for first-dimension IEF. 純化酵素是一件非常基本的工作，很多重要的研究，都脫不開酵素的純化工作。而大多數酵素的純化，基本上也脫不開一些最基本的原則。 首先，建立一個完善的酵素實驗室是很必要的；我們把許多實驗室內的運作細節一一交代，期望同學能認知這些經驗，確實接收並養成習慣，且期望應用到將來每個人的研究工作上。 最先遇到，但是最容易被忽視的步驟，就是材料處理及總蛋白質的抽取。將提醒你小心選擇採料的種類、時期、部位等，並選擇一個良好的粗抽取方式，以便有一個良好的開始。

36 Sample clean-up eliminates horizontal streaking caused by residual SDS
純化酵素是一件非常基本的工作，很多重要的研究，都脫不開酵素的純化工作。而大多數酵素的純化，基本上也脫不開一些最基本的原則。 首先，建立一個完善的酵素實驗室是很必要的；我們把許多實驗室內的運作細節一一交代，期望同學能認知這些經驗，確實接收並養成習慣，且期望應用到將來每個人的研究工作上。 最先遇到，但是最容易被忽視的步驟，就是材料處理及總蛋白質的抽取。將提醒你小心選擇採料的種類、時期、部位等，並選擇一個良好的粗抽取方式，以便有一個良好的開始。

37 Outer membrane protein F-precursor was successfully identified after sample clean-up
純化酵素是一件非常基本的工作，很多重要的研究，都脫不開酵素的純化工作。而大多數酵素的純化，基本上也脫不開一些最基本的原則。 首先，建立一個完善的酵素實驗室是很必要的；我們把許多實驗室內的運作細節一一交代，期望同學能認知這些經驗，確實接收並養成習慣，且期望應用到將來每個人的研究工作上。 最先遇到，但是最容易被忽視的步驟，就是材料處理及總蛋白質的抽取。將提醒你小心選擇採料的種類、時期、部位等，並選擇一個良好的粗抽取方式，以便有一個良好的開始。

38 Efficient dialysis with Mini-Dialysis
Easy-to-use compared to dialysis bags Designed for efficient dialysis of small sample volumes Conical tube bottom maximizes sample recovery Various choices for efficient dialysis based on MW cut-off and volume Improves resolution in 2-D gels 純化酵素是一件非常基本的工作，很多重要的研究，都脫不開酵素的純化工作。而大多數酵素的純化，基本上也脫不開一些最基本的原則。 首先，建立一個完善的酵素實驗室是很必要的；我們把許多實驗室內的運作細節一一交代，期望同學能認知這些經驗，確實接收並養成習慣，且期望應用到將來每個人的研究工作上。 最先遇到，但是最容易被忽視的步驟，就是材料處理及總蛋白質的抽取。將提醒你小心選擇採料的種類、時期、部位等，並選擇一個良好的粗抽取方式，以便有一個良好的開始。

39 Sample dialysis using Mini-Dialysis
純化酵素是一件非常基本的工作，很多重要的研究，都脫不開酵素的純化工作。而大多數酵素的純化，基本上也脫不開一些最基本的原則。 首先，建立一個完善的酵素實驗室是很必要的；我們把許多實驗室內的運作細節一一交代，期望同學能認知這些經驗，確實接收並養成習慣，且期望應用到將來每個人的研究工作上。 最先遇到，但是最容易被忽視的步驟，就是材料處理及總蛋白質的抽取。將提醒你小心選擇採料的種類、時期、部位等，並選擇一個良好的粗抽取方式，以便有一個良好的開始。

40 Effect of dialysis on 2-D resolution sample
純化酵素是一件非常基本的工作，很多重要的研究，都脫不開酵素的純化工作。而大多數酵素的純化，基本上也脫不開一些最基本的原則。 首先，建立一個完善的酵素實驗室是很必要的；我們把許多實驗室內的運作細節一一交代，期望同學能認知這些經驗，確實接收並養成習慣，且期望應用到將來每個人的研究工作上。 最先遇到，但是最容易被忽視的步驟，就是材料處理及總蛋白質的抽取。將提醒你小心選擇採料的種類、時期、部位等，並選擇一個良好的粗抽取方式，以便有一個良好的開始。

41 Albumin and IgG removal
Proteins in serum and other biological fluids are difficult to resolve by 2-DE, largely due to the abundance of serum albumin and IgG. Serum albumin: 50-70% ; IgG: 10-25% Obscure other proteins in the gel, and limit the amounts of proteins in the serum that can be resolved by 2-DE. Have wide pI and MW ranges that further reduce resolution and mask other low-abundance proteins. 純化酵素是一件非常基本的工作，很多重要的研究，都脫不開酵素的純化工作。而大多數酵素的純化，基本上也脫不開一些最基本的原則。 首先，建立一個完善的酵素實驗室是很必要的；我們把許多實驗室內的運作細節一一交代，期望同學能認知這些經驗，確實接收並養成習慣，且期望應用到將來每個人的研究工作上。 最先遇到，但是最容易被忽視的步驟，就是材料處理及總蛋白質的抽取。將提醒你小心選擇採料的種類、時期、部位等，並選擇一個良好的粗抽取方式，以便有一個良好的開始。

42 The difficulty of handling blood samples
97 kD 14 kD 66 kD 45 kD 30 kD 21 kD Anderson et al. Molecular and Cellular Proteomics, 2002

43 The distribution of proteins in blood
Radhakrishna S.et al. Molecular and Cellular Proteomics, 2003

44 The dynamic range of proteins in blood
Pg/mL

45 Removal of albumin and IgG from blood samples
Before depletion After depletion 2003, Proteomics, 3,

46 Schematic of the removal process
純化酵素是一件非常基本的工作，很多重要的研究，都脫不開酵素的純化工作。而大多數酵素的純化，基本上也脫不開一些最基本的原則。 首先，建立一個完善的酵素實驗室是很必要的；我們把許多實驗室內的運作細節一一交代，期望同學能認知這些經驗，確實接收並養成習慣，且期望應用到將來每個人的研究工作上。 最先遇到，但是最容易被忽視的步驟，就是材料處理及總蛋白質的抽取。將提醒你小心選擇採料的種類、時期、部位等，並選擇一個良好的粗抽取方式，以便有一個良好的開始。

47 Removal of albumin and IgG from human serum
純化酵素是一件非常基本的工作，很多重要的研究，都脫不開酵素的純化工作。而大多數酵素的純化，基本上也脫不開一些最基本的原則。 首先，建立一個完善的酵素實驗室是很必要的；我們把許多實驗室內的運作細節一一交代，期望同學能認知這些經驗，確實接收並養成習慣，且期望應用到將來每個人的研究工作上。 最先遇到，但是最容易被忽視的步驟，就是材料處理及總蛋白質的抽取。將提醒你小心選擇採料的種類、時期、部位等，並選擇一個良好的粗抽取方式，以便有一個良好的開始。

48 Removal of albumin from human serum
純化酵素是一件非常基本的工作，很多重要的研究，都脫不開酵素的純化工作。而大多數酵素的純化，基本上也脫不開一些最基本的原則。 首先，建立一個完善的酵素實驗室是很必要的；我們把許多實驗室內的運作細節一一交代，期望同學能認知這些經驗，確實接收並養成習慣，且期望應用到將來每個人的研究工作上。 最先遇到，但是最容易被忽視的步驟，就是材料處理及總蛋白質的抽取。將提醒你小心選擇採料的種類、時期、部位等，並選擇一個良好的粗抽取方式，以便有一個良好的開始。

49 Removal of other contaminants
Organic/Inorganic molecules - TCA/Acetone precipitation - Organic solvent precipitation - Wash away PBS Nucleic acids - Nuclease treatment Lipids - Organic solvent precipitation - Excess detergents Phenolic compounds - Reducing agents (DTT, DTE) 純化酵素是一件非常基本的工作，很多重要的研究，都脫不開酵素的純化工作。而大多數酵素的純化，基本上也脫不開一些最基本的原則。 首先，建立一個完善的酵素實驗室是很必要的；我們把許多實驗室內的運作細節一一交代，期望同學能認知這些經驗，確實接收並養成習慣，且期望應用到將來每個人的研究工作上。 最先遇到，但是最容易被忽視的步驟，就是材料處理及總蛋白質的抽取。將提醒你小心選擇採料的種類、時期、部位等，並選擇一個良好的粗抽取方式，以便有一個良好的開始。

50 Prevention against proteolysis
Chaotropes of high concentration - 8 M Urea Protease Inhibitor - PMSF and AEBSF - EDTA or EGTA (< 1 mM) - protease peptide inhibitor - protease inhibitor mix (cocktail) 純化酵素是一件非常基本的工作，很多重要的研究，都脫不開酵素的純化工作。而大多數酵素的純化，基本上也脫不開一些最基本的原則。 首先，建立一個完善的酵素實驗室是很必要的；我們把許多實驗室內的運作細節一一交代，期望同學能認知這些經驗，確實接收並養成習慣，且期望應用到將來每個人的研究工作上。 最先遇到，但是最容易被忽視的步驟，就是材料處理及總蛋白質的抽取。將提醒你小心選擇採料的種類、時期、部位等，並選擇一個良好的粗抽取方式，以便有一個良好的開始。

51 Typical sample preparation for 2DE
A urea-based solution + nonionic detergents + reducing agents + a protease inhibitor (O’Farrell’s lysis buffer: 9M urea, 4% NP-40, mM DTT) (modified lysis buffer: 9M urea, 2-4% CHAPS, 1% DTT, 2% carrier ampholytes) Solubility improvement: thiourea, tributylphosphine, zwittergents TCA/Acetone precipitation  solubilization by lysis buffer SDS boiling  diluted by lysis buffer 純化酵素是一件非常基本的工作，很多重要的研究，都脫不開酵素的純化工作。而大多數酵素的純化，基本上也脫不開一些最基本的原則。 首先，建立一個完善的酵素實驗室是很必要的；我們把許多實驗室內的運作細節一一交代，期望同學能認知這些經驗，確實接收並養成習慣，且期望應用到將來每個人的研究工作上。 最先遇到，但是最容易被忽視的步驟，就是材料處理及總蛋白質的抽取。將提醒你小心選擇採料的種類、時期、部位等，並選擇一個良好的粗抽取方式，以便有一個良好的開始。