王梁华 生物化学与分子生物学教研室 第二军医大学基础部

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1 王梁华 生物化学与分子生物学教研室 第二军医大学基础部
DNA重组技术 王梁华 生物化学与分子生物学教研室 第二军医大学基础部

2 概 述 DNA重组技术 DNA重组技术的可能性与限制
概 述 DNA重组技术 又名基因工程或遗传工程，是以分子生物学为基础的生物高科技，具体的说，通过对基因及其结构的操作，实现包括有价值的稀有蛋白的表达、基因诊断、基因治疗及转基因动物和植物等重要应用的实验技术。 DNA重组技术的可能性与限制 从基因克隆到人的克隆 技术的复杂程度和涉及多学科协同 安全问题及伦理学

3 生物技术的主要进展 基因操作技术 转基因动植物研究的重大突破 基因组计划 基因治疗技术 蛋白质工程技术 生物信息技术和生物芯片
基因克隆技术；基因表达技术；基因测序技术；基因合成技术；多肽合成与测序技术；基因扩增技术；基因转移技术；噬菌体呈现系统 转基因动植物研究的重大突破 基因组计划 基因治疗技术 蛋白质工程技术 生物信息技术和生物芯片

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6 基因工程与生物技术 基因工程属于生物技术范畴，生物技术（biotechnology）不是一个独立的学科而是一套技术或手段
广义的生物技术指任何利用活的生物体或其一部分生产产品或改良生物品质的技术；狭义的生物技术是专指以DNA重组技术和单克隆技术为标志发展起来的新技术 新的生物技术包括基因工程、细胞工程、酶工程和发酵工程几方面的内容 基因工程是生物技术的核心和关键，是主导技术 细胞技术是生物技术的基础 酶工程是生物技术的条件 发酵工程是生物技术获得最终产品的手段 生物技术是一个综合技术体系，其中基因工程和细胞融合技术最为突出 蛋白质工程（protein engineering）则是在基因工程基础上综合蛋白质化学、蛋白质晶体学、计算机学辅助设计等知识和技术发展起来的研究新领域，开创了按人类意愿设计和研制人类需要的蛋白质的新时期，被称为第二代基因工程

7 重组DNA技术 重组DNA技术的基本概念 重组DNA技术的基本步骤 重组DNA技术中应用的重要工具酶 重组DNA技术中应用的载体

8 重组DNA技术的基本概念 重组DNA技术(recombinant DNA technology)
再将重组分子导入受体细胞，使其在细胞中扩增 和繁殖，以获得该DNA分子的大量拷贝。 基因克隆（gene cloning），DNA克隆（DNA cloning），分子克隆（molecular cloning)， 基因工程（gene engineering），遗传工程（genetic engineering）等术语常与重组DNA技术通用。

9 重组DNA技术的建立和发展 1967-1970年R.Yuan和H.O.Smith等发现的限制性核酸内切酶为基因工程提供了有力的工具
1972年Berg等将SV-40病毒DNA与噬菌体P22DNA在体外重组成功，转化大肠杆菌，使本来在真核细胞中合成的蛋白质能在细菌中合成,打破了种属界限 1977年Boyer等首先将人工合成的生长激素释放抑制因子14肽的基因重组入质粒，成功地在大肠杆菌中合成得到这14肽 1978年Itakura（板仓）等使人生长激素191肽在大肠杆菌中表达成功 1979年美国基因技术公司用人工合成的人胰岛素基因重组转入大肠杆菌中合成人胰岛素

10 成 果（一） 转基因动植物和基因剔除动植物的成功 1982年Palmiter等将克隆的生长激素基因导入小鼠受精卵细胞核内
导入了凝血因子Ⅸ基因的转基因绵羊分泌的乳汁中含有丰富的凝血因子Ⅸ 1994年能比普通西红柿保鲜时间更长的转基因西红柿投放市场 1996年转基因玉米、转基因大豆相继投入商品生产 我国科学家将自己发现的蛋白酶抑制剂基因转入棉花获得抗棉铃虫的棉花株 到1996年全世界已有250万公顷土地种植转基因植物

11 成 果（二） 基因诊断与基因治疗是基因工程在医学领域发展的一个重要方面
1991年美国向一患先天性免疫缺陷病（遗传性腺苷脱氨酶ADA基因缺陷）的女孩体内导入重组的ADA基因，获得成功 我国也在1994年用导入人凝血因子Ⅸ基因的方法成功治疗了乙型血友病的患者 在我国用作基因诊断的试剂盒已有近百种之多。基因诊断和基因治疗正在发展之中

12 分子生物学新技术 核酸的化学合成从手工发展到全自动合成
年Sanger、Maxam和Gilbert先后发明了三种DNA序列的快速测定法 90年代全自动核酸序列测定仪的问世；1985年Cetus公司Mullis等发明的聚合酶链式反应（PCR）的特定核酸序列扩增技术，更以其高灵敏度和特异性被广泛应用，对分子生物学的发展起到了重大的推动作用

13 基因工程的基本程序 分—载体和目的基因的分离 切—限制性内切酶 接—载体与目的基因连接成重组体 转—基因序列转入细胞
筛—目的基因序列克隆的筛选和鉴定

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15 分—载体和目的基因的分离 目的基因的来源和分离 基因文库 cDNA文库 人工化学合成 聚合酶链(PCR)反应

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17 DNA聚合酶（DNA polymerase）
大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ及其大片断（Klenow片段） Taq DNA聚合酶 反（逆）转录酶 末端脱氧核糖核酶转移酶（末端转移酶）

18 大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ 该酶是MW=109KD的单条多肽链组成的多功能酶， 具有3种酶的活性：
5′→3′DNA聚合酶活性：催化单核苷酸结合到DNA的3′-OH末端，使DNA链从5′→3′延伸 3′→5′外切酶活性：能从游离的3′ -OH端降解双链或单链DNA成为单核苷酸，但对双链DNA的3′→5′外切酶活性可被5′→3′聚合酶活性所抑制 5′→3′外切酶活性：能从游离的5′-末端降解双链DNA成为单核苷酸

19 大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ Klenow片断 应用枯草杆菌蛋白酶裂解完整的大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ，以去除其5′→3′外切酶的活性所得到的片段称为Klenow片段。分子量76kD。主要应用于DNA测序、合成cDNA第二链，及双链DNA3′端标记

20 Taq DNA聚合酶 耐热的依赖于DNA的DNA聚合酶，MW=65kD，主要应用于聚合酶链反应（PCR）中对DNA分子的特定序列进行体外扩增

21 切—限制性内切酶的应用

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23 限制性内切酶 （restriction endonuclease）
该酶有三类，即限制性内切酶Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ。实际工作应用的为限制性内切酶Ⅱ，它能 识别和切割双链DNA的特异顺序，产生特 异的DNA片段。 Ⅱ型具有严格的识别、切割顺序。它以核酸内切方式水解DNA链中的磷酸二酯键，产生的DNA片段5′端为P，3′端为OH。识别顺序一般为4-6个碱基对。

24 限制性核酸内切酶的命名 按酶的来源的属、种名而定，取属名的第一个字母与种名的头两个字母组成的三个斜体字母作略语表示；如有株名，再加上一个字母，其后再按发现的先后写上罗马数字。例如：从流感嗜血杆菌d株（Haemophilus influenzae d）中先后分离到3种限制酶，则分别命名为HindⅠ、HindⅡ和HindⅢ。

25 Ⅱ型内切酶切割双链DNA产生3种不同的切口
平末端（blunt end） 5′端突出的粘性末端（5′-sticky end） 3′端突出的粘性末端（3′-sticky end）

26 不同限制性核酸内切酶 切割的三种情况 产生3′突出粘性末端（cohesive end):以EcoR I为例：
5′---G AATTC---3′ ′---GP OHAATTC---3′ 3′---CATAAA G---5′EcoR I ′---CTTAAOH PG---5′ 产生5′突出粘性末端:以Pst I为例： 5′---CTGCA G---3′ ′---CTGCAp OHG---3′ 3′---G ACCTC---5′ Pst I ′---GOH p ACGTC---5′ 产生平末端（blunt end): 以Nru I为例： 5′---TCG CGA---3′ ′---TCGp OHCGA---3′ 3′---AGC GCT---5′ Nru I ′---AGCOH pGCT---5′

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29 限制性内切酶的主要用途 DNA重组克隆及亚克隆 DNA杂交及序列分析 改建质粒 构建基因组DNA物理图谱和文库

30 接—载体与目的基因 连接成重组体 粘性末端连接 平端连接

31 DNA连接酶 T4噬菌体DNA连接酶和大肠杆菌DNA连接酶：MW=68kD，催化两个独立DNA片段5′磷酸基与3′羟基之间形成磷酸二酯键

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33 末端脱氧核糖核酸转移酶 （末端转移酶） 该酶的分子量为60kD，在二价阳离子存在下，它催化dNTP加到DNA分子的3′羟基端。常用于给载体或cDNA加上互补的多聚体尾巴，造成便于重组的人工粘性末端，也可应用于DNA片断3′-末端标记

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36 反转录酶 亦称依赖于RNA的DNA聚合酶（RDDP)，催化以RNA为模板的DNA聚合反应，以mRNA为模板，催化合成出互补的DNA，称为cDNA(complementary DNA)。主 要用于cDNA文库的构建。

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38 转—基因序列转入细胞 转化 感染 转染

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40 筛—目的基因序列克隆的筛选和鉴定 按重组载体的标志进行筛选 核酸杂交法 核苷酸序列测定 PCR 免疫学方法 DNA限制性内切酶图谱分析

41 制备工艺 工程菌活化 发酵 分离纯化 质量分析 按制剂要求组方 过滤除菌 分装 冻干 成品 抽检

42 酶 主要用途 限制性核酸内切酶 识别DNA特定序列，切断DNA链 DNA聚合酶Ⅰ 或其大片段（Klenow） ①缺口平移制作标记DNA探针 ②合成cDNA的第二链 ③填补双链DNA3’凹端 ④DNA序列分析 耐热DNA聚合酶（Taq DNA聚合酶等） 聚合酶链反应（PCR） DNA连接酶 连接两个DNA分子或片段 多核苷酸激酶 催化多核苷酸5’羟基末端磷酸化，制备末端标记探针 末端转移酶 在3’末端加入同质多聚物尾 SI核酸酶，绿豆核酸酶 降解单链DNA或RNA，使双链DNA突出端变为平端 DNA端酶Ⅰ 降解DNA，在双链DNA上产生随机切口 RNA酶A 降解除RNA 磷酸酶 切除核酸末端磷酸基

43 基因克隆的载体 载体（vector）是携带靶DNA片断进入宿主细胞进行扩增和表达的工具。载体的本质是DNA，具备以下特征：
自主复制； 有筛选标记； 适当大小的分子量 适当的限制性内切酶酶切位点； 在细胞中拷贝数高。 质粒载体（plasmid） 载体 噬菌体载体（bacteriophage）

44 质粒载体 质粒是细菌染色体外小型双链环状DNA。质粒DNA在细菌中的复制有两种类型，即严紧型和松驰型，后者为高拷贝质粒，常用于基因克隆实验。常用的质粒载体有pBR322，pUC18和pUC19。

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49 噬菌体载体 -噬菌体载体：gt10、 gt11、 EMBL4、粘粒载体 M-13噬菌体载体

50 噬菌体载体 插入载体(Subsitution vector) : gt10和gt11，只有单一 的EcoRⅠ酶切位点，只容许几个kB的外源DNA插入。此类载体主要同于cDNA文库的构建。 替代载体（replace vector)：EMBL4，含有EcoRⅠ(E) 、 SalⅠ(S) 和BamHⅠ(B)三个限制性内切酶位点。酶切后可用外源性DNA取代。指入片段长度为9-22kb。主要用于构建基因组文库。

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53 粘粒载体（cosmid） 粘粒由质粒和噬菌体的cos粘性末端构建而成（联合载体）,载体大小4-6kb，可插入大片段（29-45 kb）外源DNA。该载体主要用于基因组文库构建。 粘粒基因组：质粒复制起始位点、一个或多个限制性内切酶位点、抗药性基因、噬菌体两端的cos位点。

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56 M13噬菌体载体 M13噬菌体含约64kb的单链闭环DNA分子。在菌细胞内形成过度阶段的双链环状复制型DNA（RF）。双链外源DNA可插入到M13噬菌体，双链复制型DNA中并进行高拷贝复制。亦很容易地从感染细胞中纯化得到并重新导入宿主细胞，进入宿主细胞后，这种双链DNA很快又重新进入复制周期，产生子代噬菌体颗粒。子代噬菌体DNA是单链的，只含有外源DNA的一条链。 主要用于DNA测序和制备单链放射性探针

57 思考题 1、什么是DNA重组技术？它包含那些内容？ 2、列举常用的基因工程工具酶的特性和用途。
3、叙述常用的基因工程载体的种类、特点和用途。 4、怎样获得目的基因或核酸序列的克隆？有那些方法？要经过那些基本步骤？ 5、怎样能在大肠杆菌中获得真核基因的表达产物？