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分子生物学在检验医学中的应用
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一、分子生物学在检验医学中的常用技术 1、 PCR技术 2、 RT-PCR技术 3、 RFLP 4、 SSCP 5、 MSP 6、 测序
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二、外源性疾病的检验与诊断： 1、 细菌、支原体、衣原体、寄生虫、 病毒等 2、 SARS冠状病毒的分子生物学检测
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BNIoutS/BNoutAs: sense ATGAAT TAC CAA GTC AAT GGT TAC antisense CAT AAC CAG TCG GTA CAG CTA C FraGment lenGth 195 bp BNIinS/BNIAs: sense GAA GCT ATT CGT CAC GTT CG antisense CTGTAGAAA ATC CTA GCT GGA G Fragment length 110 bp SAR1s/SAR1as: sense CCT CTC TTG TTC TTG CTC GCA antisense TAT AGT GAG CCG CCA CAC ATG Fragment length 150 bp
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Amplicon sequence (BNI-1, Bernhard-Nocht Institute, Hamburg, Germany)
TACCGTAGACTCATCTCTATGATGGGTTTCAAAATGAATTACCAAGTCAATGGTTACCCTAATATGTTTATCACCCGCGAAGAAGCTATTCGTCACGTTCGTGCGTGGATTGGCTTTGATGTAGAGGGCTGTCATGCAACTAGAGATGCTGTGGGTACTAACCTACCTCTCCAGCTAGGATTTTCTACAGGTGTTAACTTAGTAGCTGTACCGACTGGTTATGTTGACACTGAAAATAACACAGAATTCACCAGAGTTAATGCAAAACCTCCACCAGGTGACCAGTTTAAACATCTTATACC
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SARS-specific primers: Cor-p-F2 (+)
5'CTAACATGCTTAGGATAATGG 3', Cor-p-F3 (+) 5'GCCTCTCTTGTTCTTGCTCGC 3', Cor-p-R1 (-) 5'CAGGTAAGCGTAAAACTCATC 3', Product size: Cor-p-F2/Cor-p-R1 :368 bp Cor-p-F3/Cor-p-R1 :348 bp
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Government Virus Unit 9/F Public Health Laboratory Centre 382 NAm Cheong Street Shek Kip Mei Kowloon, Hong Kong SAR Hong Kong - SAR China COR-1,COR-2: sense 5' CAC CGT TTC TAC AGG TTA GCT AAC GA 3' antisense 5' AAA TGT TTA CGC AGG TAA GCG TAA AA 3' Product size: 310 bp
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Queen Mary Hospital The University of Hong Kong University Pathology Building Hong Kong - SAR China
HKU: sense 5' TACACACCTCAGCGTTG 3' antisense 5' CACGAACGTGACGAAT 3' Product size 182 bps
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二、内源性疾病的检验与诊断： 1、 临床基因变异酶的分子性质研究 1） 用PCR-SSCP技术发现我国第一例 LDH遗传变异病例
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病 例 21岁男性： LDH：75 U/L (参考范围： U/L) 其余指标均正常 在三年的调查期间，LDH活力始终处于较低水平，在 U/L之间
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经排除其它原因，如血中的抑制剂的存在、药物的影响等可能因素外，我们怀疑可能有遗传性的LDH变异。根据计算红细胞中H、M亚基的比值，初步断定为H亚基变异，采用合成的7对引物，分别扩增LDH基因中的7个外显子，然后用SSCP电泳法与正常人对照，发现变异发生在外显子4上，由此证明该病人的长期低酶活力是有基因变异引起的。
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2n n n n n 6
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2）LDH-A和LDH-B亚基遗传变异及 对检验结果的影响
基因变异可导致酶分子组成结构发生变化，对酶活力和酶的物理化学性质造成影响，可给临床医生造成诊断陷阱(pitfall)，因为在不同疾病状态下，从相关联的组织器官中释放出的酶与预期的不同，病人血清酶活力不能完全反映各种疾病的状态，容易造成误诊。
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A-171 CGA-TGA Arg-Ter 无义突变 A-328 GAG-TAG Glu-Ter 无义突变
LDH-A基因变异类型 _________________________________________________ 变异位置 DNA 氨基酸置换 影 响 ————————————————————————— A CGA-TGA Arg-Ter 无义突变 A GAG-TAG Glu-Ter 无义突变 A GAC-AAC Asp-Asn 外显子2丢失 A AAA-GAA Lys-Glu 电荷变化 A CGT-TGT Arg-Cys 电荷变化 A 插入C 移码突变 A TGTTGT-TGT ValVal-Val 辅酶结合 A 丢失2 bp (CT) 移码突变 A 丢失20 bp 移码突变
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LDH-B基因变异类型 B-6 AAA-GAA Lys-Gly 电荷变化 B-35 GCC-GAG Ala-Glu 辅酶结合
变异位置 DNA 氨基酸置换 影 响 B AAA-GAA Lys-Gly 电荷变化 B GCC-GAG Ala-Glu 辅酶结合 B bp重复 移码突变 B AGT-CGT Ser-Arg 辅酶结合 B 丢失2 bp (TC) 移码突变 B bp重复 移码突变 B TAT-TAG Tyr-Ter 无义突变 B CGC-CCC Arg-Pro 基质结合 B TTT-GTT Phe-Val 基质结合 B CGC-CAC Arg-His P轴的安定性 B ATG-TTG Met-Leu 分子稳定性 B 丢失1bp(C) 移码突变 B GAT-GTT Asp-Val 电荷变化
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3) CK变异的分子性质及对酶活力 的影响 病例 56岁妇女，胸痛一天后被送入急诊科 心电图和临床症状提示AMI 实验室检查：
LDH U/L ( U/L) LDH-1/LDH CK U/L ( U/L) CK-MB U/L
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RT-PCR结果
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外显子2 残基54处 A – G GAC – GGC 天冬氨酸 – 甘氨酸 位于酶结构的第4个α-螺旋
外显子2 残基54处 A – G GAC – GGC 天冬氨酸 – 甘氨酸 位于酶结构的第4个α-螺旋
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4）变异酶人群的检验结果不同于常 规人群的检验结果
4）变异酶人群的检验结果不同于常 规人群的检验结果 结合临床研究发现变异酶的检验结果与常人存在着显著的差异，即这类人群发病前酶活力常低于正常人的参考范围，发病时则上升至正常人的参考范围之内，这个现象可能给临床医生正确诊断造成困难；
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1） 2、 、电泳异常带的分子性质研究
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1） LDH异常电泳酶谱 M4 H1M3 H2M2 H3M1 H4 (+) LD-5 LD-4 LD-3 LD-2 LD-1
︱ ︱ ︱ ︱ ︱ 正常 ︱ H 缺失 ︱ M 缺失 ︱ ︱︳ ︱︳ ︱︳ ︱︳ H 变异 (slow) ︱ ︱︳ ︱︳ ︱︳ ︱︳ H 变异 (fast)
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H 发生变异时，产生H 和h M H1M H2M2 H3M H4 LD-5 LD-4 LD-3 LD-2 LD-1 ︱ H1M3 h1M3 H2M H4 h2M h1 H3 hHM h2 H2 h3 H1 h4
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2） 异常电泳酶谱的分子性质 1）核苷酸的变异引起氨基酸的改变， 2）变异后的氨基酸的酸碱性与变异前的氨基酸的酸碱性不同，
2） 异常电泳酶谱的分子性质 1）核苷酸的变异引起氨基酸的改变， 2）变异后的氨基酸的酸碱性与变异前的氨基酸的酸碱性不同， 3）变异的氨基酸位于分子的表面。 结果：产生异常的电泳结果
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3） 异常谱形的分析方法
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免疫对流、固定、混合法鉴定 遗传变异（H或M亚基变异）
LDH遗传变异和非遗传变异的分析流程图 血清（浆）同工酶分析 （异常形式） 红细胞、白细胞同工酶分析 正常谱型 异常谱型 免疫对流、固定、混合法鉴定 遗传变异（H或M亚基变异） （+） （-） LDH-Ig复合物 肿瘤产生LDH 基因分析
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LDH H/M 比值的计算 LDH LDH LDH LDH LDH-5 H亚基数 M亚基数 % A B C D E 计算方法： H = A+ 3/4 B + 2/4 C + ¼ D M = H H/M = H / ( 100 – H )
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2、 后生性调控标志物
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DNA甲基化是不改变基因序列，而是通过在DNA的CG二核苷酸胞嘧啶的第5位碳原子上加上甲基，从而调节基因的表达。
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2） 启动子甲基化作为新的分子诊断 标志物的研究
2） 启动子甲基化作为新的分子诊断 标志物的研究
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3） 启动子甲基化在分析LDH异常带 分子性质中的首例应用
病例 4岁儿童 遗传性Rb 转移到颈淋巴结 血清LDH 升高 异常同工酶带LD2ex 位于 LD1和LD2之间
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a mRNA1 □□□□□□□□ DNA a □□□□□□□□ mRNA2
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