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酶分离纯化的一般原则 酶纯化的基本步骤 酶纯化的常用方法
酶的分离与纯化分析 酶分离纯化的一般原则 酶纯化的基本步骤 酶纯化的常用方法
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酶的纯化过程 1、建立一个适当的测活方法 2、酶源选材要以含酶丰富、取材方便、经济为原则 3、酶的提取 4、酶的提纯 5、酶的纯度检验
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一、酶的提取 1、生物组织的破碎 （1）机械（匀浆）法 （2）超声波法 （3）冻融法 （4）渗透压法 （5）酶消化法
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2、抽提 典型的抽提液由以下几部分组成： 抽提液 = 离子强度调节剂 + pH缓冲剂 + 温度效应剂
(KCl、NaCl、蔗糖) (各种缓冲液) （甘油、二甲基亚砜） + 蛋白酶抑制剂 + 防氧化剂 + 重金属络合剂 +增溶剂 （PMSF、DIFP） (DTT、巯基乙醇) EDTA、柠檬酸 (TritonX-100) 通常都用0.3mol/L的蔗糖溶液或0.15mol/LKCl溶液抽提。
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3 蛋白質抽取 如何開始？ 5W 基本原則 材料來源： 材料取得與保存 均質及抽取： 確實做好第一步 鹽析及沉澱法： 最經濟方便方法
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二、酶的提纯 酶的提纯手段一般都是依据酶的分子大小、形状、电荷性质、溶解度、专一结合位点等性质而建立的。要得到纯酶，往往需要将各种方法联合使用。
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常用的提纯方法
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酵素的純化過程 可分為三個階段： (1) 粗蛋白質 (crude protein)︰ 採樣 → 均質打破細胞 → 抽出全蛋白，多使用 鹽析沉澱法；可以粗略去除蛋白質以外的物質。 (2) 部分純化 (partially purified)︰ 初步的純化，使用各種 管柱層析法。 (3) 均質酵素 (homogeneous)︰ 目標酵素的進一步精製純化，可用 製備式電泳 或 HPLC。
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酶的纯化及分析方法
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鹽析沉澱法可分離出樣本中的蛋白質。 蛋白質在水溶液中的 溶解度，會因溶液中其它鹽類濃度的改變而增減，可利用來沉澱蛋白質。 其原理是因於蛋白質分子表面電荷的改變，或者分子上 極性 或 非極性 區域與水分子間作用結果。
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■ 盐浓度對蛋白質溶解度的影響： ● 鹽溶 Salting-in: ● 鹽析 Salting-out: 加鹽使蛋白質溶入水溶液中
加鹽使蛋白質由水溶液中沉澱出來
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設計純化步驟時，需考慮下列各項要求 a. 高活性 b. 高回收率 c. 高純度 d. 方便與快速
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組合純化步驟 a. 組合標準 (1) 已知的酵素，可依照已發表的步驟進行，有問題再作改進。 通常都是以 硫酸銨分劃 - 膠体過濾 - 離子交換 為骨幹，再加上其它方法，組成全部流程。 (2) 對完全未知的酵素，可循此骨幹先試行純化，看其結果如何再加改進。 (3) 不要忘記利用該酵素的特殊性質來純化，如在其 pI 沉澱性、特別的疏水性、有專一的抑制劑或熱穩定性等。
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近朱者赤、近墨者黑，物以類聚，不論人類或是分子皆同
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色谱的类型
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. 常用的層析方法
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膠體過濾法 膠体過濾 属 partition 層析法，流動相為溶離緩衝液，固定相為膠体孔隙內的緩衝液。 溶質 (樣本蛋白質) 根據其 分子量 的大小，決定分佈在這兩相的比例。 分子量大的不易進入膠球，隨流動相溶離；分子量小的，則易竄入膠球內的固定相，而被延滯流出膠柱 。 分子的 形狀、大小 均為影響因素，即與其 分子半徑 (Stokes radius) 有關，與分子量不完全成正比關係；但一般均視蛋白質為球形，故其形狀較無影響力。
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膠体過濾法在操作時，有些內在的問題，會影響結果的好壞：
(1) 擴散及亂流： 由於是在液相中進行，樣本在膠柱中的 擴散現象 相當顯著；又因液体在膠球間流動時，受 重力 及 對流 的影響，會造成 亂流。 擴散及亂流都會使膠体過濾的解析力降低甚多。 (2) 管柱設計不良： 經常是致命的傷害，例如 無效空間 (dead volume) 過大、緩衝液進入膠体時流動不均、溶離液出口端的管路太長或太粗等。
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管柱操作 单击显示 管柱操作的详细步骤
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離子交換法 離子交換法 乃利用分子的帶電性質進行分離，解析力好且具多樣性，是重要而應用極廣的純化方法。 原理概述 a. 離子交換法
離子交換法 乃利用分子的帶電性質進行分離，解析力好且具多樣性，是重要而應用極廣的純化方法。 原理概述 a. 離子交換法 是一種 adsorption 層析法，流動相為溶離緩衝液，固定相為介質擔体表面的帶電基團。 樣本中各種離子，與介質表面帶電基團間的親和力強弱不同，吸附上去之後，可使用不同離子濃度的緩衝液，分別溶離出這些成分
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■ 環境影響分子的帶電性質
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b. 兩大類離子交換介質 由介質帶電基團的不同，可分為兩大類： 介質-帶電基團 (counter ion)
(1) 陽離子交換介質 (cation exchanger)： 擔体-陰離子基團 陽離子 (2) 陰離子交換介質 (anion exchanger)： 擔体-陽離子基團 陰離子
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色層焦集法 樣本蛋白質進入色層焦集管柱後，先遇到較高 pH 環境 (介質)，通常高於其 pI 而帶負電，因此會結合到介質上。 當 Polybuffer 開始注入管柱，降低環境 pH，使樣本分子失去負電荷而溶離下來；蛋白質便依 pI 大小順序，pI 高的先溶離出來；同時會集中在其 pI 的地方，成為一條極細色帶，故稱為焦集法。
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■ 專一性結合力量的構成因素： II. Interaction Forces: I. Conformational Match:
(1) Hydrogen bond (2) Hydrophobic interaction (3) Electrostatic interaction (4) Van der waals interaction I. Conformational Match: Van der waals interaction
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■ 典型的親和層析操作：
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■ 以親和層析法純化 Trypsin：
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HPLC 與 FPLC HPLC 為 高效能液相層析法 (high performance liquid chromatography) 之意；也有說是 high pressure，因為要使用高壓推動溶離液，以加速層析過程。 FPLC 則不用高壓，但流洗速度也很快 (fast performance)，是因為所用的介質通透性極高之故。用於 adsorption 型式的層析法，例如以離子交換分離各種胺基酸等小分子。 近來由於介質材料的發展，各種應用在大分子的液相層析法，均可 HPLC 的方式來進行；不但加快分析速度，也使解析度提高很多。 除了上述的離子交換法外，還可用在膠体過濾法、逆相層析法或親和層析法； HPLC 及 FPLC 系統，將來有可能取代傳統的低壓慢速液相層析法。
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三 总结 单击显示 酶分离、纯化及分析实验分步指导
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