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第七章 克隆基因的表达
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克隆基因的表达： 外源基因在宿主细胞中表达 导入宿主细胞 外源基因 重组载体 表达载体 在宿主细胞中 表达出蛋白质 提取蛋白 宿主细胞： 原核细胞或真核细胞。
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常见表达系统的类型 大肠杆菌表达系统 芽孢杆菌表达系统 原核生物基因表达系统 链霉菌表达系统 酵母表达系统 丝状真菌表达系统 昆虫表达系统
哺乳动物细胞表达系统 植物生物反应器 真核生物基因表达系统
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第一节 外源基因在原核细胞中的表达 用原核生物作宿主 原核或噬菌体启动子 SD序列 MCS 终止子 A dividing E. coli
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识别原核细胞的启动子，催化所有的RNA合成。
一、原核生物基因表达的特点 1. 只有一种RNA聚合酶 识别原核细胞的启动子，催化所有的RNA合成。 2. 以操纵子为单位 细菌只有一种RNA聚合酶，它完成细胞中所有RNA的合成。真核细胞的转录机构更加复杂。真核细胞核内产生三种RNA聚合酶，位于不同的部位，且均有复杂的亚基结构。每种酶负责不同种类基因的转录。 操纵子：转录的功能单位。很多功能上相关的基因前后相连成串，由一个共同的控制区进行转录的控制，包括结构基因以及调节基因的整个DNA序列。如乳糖操纵子、阿拉伯糖操纵子、组氨酸操纵子、色氨酸操纵子等 很多功能上相关的基因前后相连成串，由一个共同的控制区进行转录的控制。
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3. 转录和翻译偶联、连续进行。 由于原核生物无核膜，所以转录与翻译是偶联的，也是连续进行的。
细菌的mRNA，转录和翻译发生在唯一的细胞区室内，两个过程紧密偶联以至于它们同时发生。细菌mRNA 通常不稳定，因此只能在几分钟内翻译成蛋白质。 在真核细胞中，mRNA 的合成与成熟是完全在核内发生的。只有这些事件完成之后，mRNA 才运输到胞质，在胞质被核糖体翻译。真核mRNA相对稳定，能连续翻译几小时。 细菌中转录和翻译是紧密偶联的。转录开始时，核糖体便与mRNAs 5′端结合并开始翻译，在其余信息尚未被合成之前翻译就开始了，一串核糖体会在mRNA 合成时沿着mRNA移动。核糖体在mRNA尚未降解之前持续翻译，但是mRNA 通常沿5′→3′方向快速降解。mRNA 合成、被核糖体翻译以及降解是快速连续进行的。单独的mRNA 分子只能存在几分钟甚至更短时间。 原核生物染色体 DNA是裸露的环形 DNA，转录成 mRNA 后，可直接在胞浆中与核糖体结合翻译形成蛋白质。在翻译过程中，mRNA可与一定数目的核糖体结合形成多核糖体(Polyribosome)。两个核糖体之间有一定长度的间隔，为裸露的 mRNA。每个核糖体可独立完成一条肽链的合成，即这种多核糖体可以同时在一条 mRNA 链上合成多条肽链，大大提高了翻译效率。
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6. mRNA的核糖体结合位点上，含有SD序列
4. 不含内含子，缺乏转录后的加工系统 5. 调控主要在转录水平上 6. mRNA的核糖体结合位点上，含有SD序列 Shine-Dalgarno（SD）sequence: 位于mRNA的起始密码AUG的上游5～10个碱基处，同核糖体16S rRNA3’末端序列互补，帮助从起始AUG处开始翻译 。 4.原核基因一般不含有内含子(intron)，在原核细胞中缺乏真核细胞的转录后加工系统。因此当克隆的含有内含子的真核基因在原核细胞中转录成 mRNA 前体后，其中内含子部分不能被切除。 5.原核生物基因的控制主要在转录水平，这种控制要比对基因产物的直接控制要慢。对RNA 合成的控制有两种方式，一是起始控制(启动子控制)，二是终止控制(衰减子控制)。 6.在大肠杆菌mRNA的核糖体结合位点上，含有一个转译起始密码子及同16S核糖体RNA 3‘末端碱基互补的序列，即 SD 序列，帮助从起始AUG处开始翻译，而真核基因则缺乏此序列。
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为何？ 二、原核表达系统的注意事项 1. 外源基因不能带有内含子 2. 一般用cDNA，不能直接用真核基因组DNA
1. 外源基因不能带有内含子 为何？ 2. 一般用cDNA，不能直接用真核基因组DNA 3. 必须利用原核细胞的强启动子和 SD序列等调控元件控制外源基因的表达 4. 利用宿主细胞的调控系统，调节外源基因的表达，防止外源基因的表达对宿主菌的毒害
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三、原核生物基因表达的调控 大肠杆菌基因表达载体基本结构特征
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-35 Box 和 -10 Box 1. 启动子 是DNA上的能与RNA聚合酶结合并能起始mRNA合成的序列。
1. 启动子 是DNA上的能与RNA聚合酶结合并能起始mRNA合成的序列。 大肠杆菌的所有启动子中都有两段一致顺序（consensus sequence）。 -35 Box 和 -10 Box TTGACA TATAAT 转录起始位点 17bp 5’ 核糖体结合位点
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Shine-Dalgarno（SD） sequence
2. 核糖体结合位点（ RBS） Shine-Dalgarno（SD） sequence 翻译起始阶段，与核糖体16sRNA的3’端相互作用，正确定位起始密码子 SD 5’—AGGAGGU——AUG—— UCCUCCA 16S rRNA3’ SD序列距离AUG的距离影响翻译
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3. 转录终止子 在表达载体克隆位点的下游一般设计一段转录终止子，mRNA转录终止信号。
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1. 细胞质中表达 包涵体（inclusion body） 四、外源蛋白在大肠杆菌中的表达部位
是存在于细胞质中的一种不溶性蛋白质聚集折叠而成的晶体结构物。 包含体（inclusion bodies）是无定形的蛋白质的聚集，不被任何膜所包围。细胞破碎后，包含体呈颗粒状，致密，低速离心就可以沉淀。包含体难溶于水中，在变性剂溶液（如盐酸胍、脲）中才能溶解。在这些溶液中，溶解的蛋白质呈变性状态，即所有的氢键、疏水键全被破坏，疏水侧链完全暴露，但一级结构和共价键不被破坏。因此当除去变性剂时，一部分蛋白质可以自动折叠成具有活性的正确构型，这一折叠过程称为蛋白质的复性。 包含体主要由蛋白质构成，其中大多是基因表达产物。这些基因表达产物没有生物活性。为此，欲获得天然活性态的目标产物，必需分离包含体后，溶解包含体并使其中的目标蛋白恢复应有的天然活性。 信号肽位于分泌蛋白的N端。一般由15～30个氨基酸组成。新合成多肽链中用于指导蛋白质的跨膜转移（定位）的N-末端的氨基酸序列（有时不一定在N端）
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① 优点 使重组蛋白易于分离、免受蛋白酶降解、不损害寄主细胞 ②缺点 回收的蛋白生物活性差。 在大肠杆菌细胞内表达人生长激素（human growth hormone, hGH）。 例：
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2. 周质中表达 周质（periplasm） 革兰氏阴性菌位于内膜和外膜之间的细胞结构部分。 优点：
容易被浓缩和纯化、有利于正确折叠、被降解的少。
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3. 胞外表达 由于需要穿过两层膜，大肠杆菌只能分泌极少的蛋白质到培养基中，效果都不太理想。
使在大肠杆菌细胞中表达的外源蛋白分泌到细胞外的培养基中。 用溶血素基因构建分泌性融合蛋白 或与细菌素释放蛋白共表达 由于需要穿过两层膜，大肠杆菌只能分泌极少的蛋白质到培养基中，效果都不太理想。
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-35 Box 和 -10 Box 五、影响外源基因表达效率的因素 1. 启动子的结构对表达效率的影响 （1）一致顺序 5’ 核糖体结合位点
TTGACA TATAAT 转录起始位点 17bp 5’ 核糖体结合位点
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（2）-35区与-10区之间的距离 （3）-35区和-10区的碱基顺序
间隔为17bp时，启动子最强。 （3）-35区和-10区的碱基顺序 越接近一致顺序，启动子越强。 -35box -10box 一致顺序 5’-TTGACA TATAAT lac 5’-TTTACA TATGTT trp 5’-TTGACA TTAACT PL 5’-TTGACA GATACT recA 5’-TTGATA TATAAT tac I 5’-TTGACA TATAAT tac II 5’-TTGACA TTTAAT
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2. 翻译起始序列对表达效率的影响 （1）SD序列
翻译起始阶段，与核糖体16sRNA的3’端相互作用，正确定位起始密码子 SD 5’—AGGAGGU——AUG—— UCCUCCA 16S rRNA3’ ① SD序列距离AUG的距离影响翻译
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② mRNA-rRNA互补区域长短影响基因的翻译
5’-UAAGGAGG-3’ > 5’-AAGGA-3’ ③ SD序列后面的4个碱基 5’-AGGAGGU-3’ ？？？？ 如果是A（T），翻译效率最高； 如果是G（C），效率只有50%或25%。
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（2）起始密码AUG AUG左侧的三个碱基也有影响 -半乳糖苷酶的mRNA中： AUG左侧如果是UAU或CUU时，最为有效； 是UUC、UCA或AGG时下降20倍。 AUG右侧的三个碱基也有影响。
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3. 启动子与外源基因之间的距离
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4. 转录终止区对表达效率的影响 5. 载体拷贝数及稳定性对表达效率的影响
4. 转录终止区对表达效率的影响 转录终止区的存在保证载体不会转录非必须基因，不必浪费资源和能量、不会干扰正常表达。 5. 载体拷贝数及稳定性对表达效率的影响 增加载体的拷贝数会增加转录出的mRNA数目，增加表达效率。 但过度的外源基因的表达会影响宿主的正常生长 6. 外源蛋白在菌体中的稳定性对表达效率的影响
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六、提高表达水平常用的方法 转录水平的优化 （1）使用强启动子或诱导型启动子 （2）强终止子，或将两个终止子串联 （3）提高mRNA的稳定性
如：在外源基因的下游插入“重复性基因外回文序列 在外源基因的下游插入“重复性基因外回文序列”能防止mRNA受到3’5’外切酶的攻击
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2. 翻译水平的优化 （1）优化翻译起始区 ① 起始密码子ATG ② mRNA-rRNA互补区域长短， SD序列距离AUG的距离，及碱基种类 ③ 翻译增强子
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（2）翻译的终止 ① 三个终止密码子，防止核糖体跳跃 ② 终止密码子后的核苷酸类型，如UAAU为大肠杆菌最有效的翻译终止序列。 （3）密码子的选择 ① 受体菌中共表达稀有密码子tRNA基因 ② 将稀有密码子改为偏爱密码子
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3. 提高目的产物稳定性 防止被宿主的酶降解。 （1）表达分泌蛋白 外膜 内膜 细胞质 周间质 染色体 质粒
3. 提高目的产物稳定性 防止被宿主的酶降解。 （1）表达分泌蛋白 外膜 内膜 细胞质 周间质 染色体 质粒 “外排”：蛋白质从细胞质跨过内外膜到培养液中。 “分泌”：蛋白质从细胞质跨过内膜到周间质中。
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（2） 使用突变菌株，保护外源蛋白不被降解 减少宿主菌本身的蛋白酶的表达。
① 使用次黄嘌呤核苷（lon）缺陷型菌株，减少宿主菌的蛋白酶合成。 ② 大肠杆菌的htp R基因突变也减少蛋白酶的降解作用。 ③ T4噬菌体的pin基因产物能抑制细菌的蛋白酶。可把pin增加到载体上。
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4. 质粒的拷贝数 增加mRNA数量， 提高核糖体与mRNA的结合速度 可调控的诱导型复制子 （1）强启动子提高转录效率；
4. 质粒的拷贝数 增加mRNA数量， 提高核糖体与mRNA的结合速度 （1）强启动子提高转录效率； （2）使用高拷贝表达载体。 宿主大量生长后，诱导载体质粒复制，增加拷贝数 宿主大量生长时，抑制载体质粒的复制 可调控的诱导型复制子
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5. 宿主菌的选择 表达载体与宿主相互匹配 6. 培养条件优化 （1）培养基 （2）环境因素 （3）诱导时间和剂量
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七、原核细胞表达的缺陷 1、缺乏翻译后蛋白质的加工修饰系统，如糖基化、氨基酸修饰等。
2、原核表达外源蛋白常以包涵体形式存在，必须经过变性、复性处理才能获得有生物活性的蛋白，并且其表达量非常低。
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七、原核细胞表达的缺陷 3、原核细胞中表达的真核蛋白不稳定，容易被细菌蛋白酶降解。
4、原核细胞没有转录后加工系统，无法识别内含子，故原核细胞无法表达没有加工过的真核基因组。 1. 缺乏对真核生物蛋白质的复性功能 2. 缺乏对真核生物蛋白质的修饰加工系统 3. 内源性蛋白酶降解空间构象不正确的异源蛋白 4. 细胞周质内含有种类繁多的内毒素 5、重组原核细胞在培养过程中产生的毒素难以排除，污染表达产物，影响产品纯度。
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七、利用重组大肠杆菌生产人胰岛素 1. 胰岛素的结构及其生物合成 2. 人胰岛素的生产方法 3. 重组人胰岛素的大肠杆菌工程菌的构建
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1. 胰岛素的结构及其生物合成 信号肽 B 肽 C 肽 A 肽 信号肽酶 C 肽（31） A 肽（21） B 肽（30）
1. 胰岛素的结构及其生物合成 N C 信号肽 B 肽 C 肽 A 肽 信号肽酶 C 肽（31） R K R S S R C A 肽（21） S S S S B 肽（30） N 胰岛素最初是以一条单链分子的前体形式合成的，即胰岛素原（Proinsulin）。它可认为是由ABC三条肽链连接而成。具体是C肽的一端通过两个碱性氨基酸残基62、63与胰岛素A链的N末端相连，另一端通过另外两个碱性氨基酸残基31、32与胰岛素B链的C末端相连。在细胞高尔基体中，胰岛素原被贮存在储存颗粒内，并在肽酶的催化下，切去C肽而形成活性胰岛素。 高尔基体内的特异性肽酶 S S N C S S S S N C
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2. 人胰岛素的生产方法 （1）直接提取法制人胰岛素
2. 人胰岛素的生产方法 迄今为止，有四种大规模生产人胰岛素的方法： （1）直接提取法制人胰岛素 早期人的胰岛素是从人的胰脏中直接分离纯化的，由于原料供应的限制，其产量远远不能满足日益增多的糖尿病人的临床需求。
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2. 人胰岛素的生产方法 （2）化学合成法制人胰岛素
2. 人胰岛素的生产方法 迄今为止，有四种大规模生产人胰岛素的方法： （2）化学合成法制人胰岛素 根据人胰岛素A链和B链的序列，由单个氨基酸从头合成。这条化学全合成的路线从技术上来说是能够做到的，但其生产成本奇高，从而也限制了产品的广泛应用。
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2. 人胰岛素的生产方法 （3）化学转型法制人胰岛素
2. 人胰岛素的生产方法 迄今为止，有四种大规模生产人胰岛素的方法： （3）化学转型法制人胰岛素 猪的胰岛素可从原料丰富的猪胰脏中提取获得，而且猪胰岛素与人胰岛素只在B链的C末端有一个氨基酸的差异，猪的为Ala，人的为Thr，因此将猪胰岛素在体外酶促转化为人胰岛素不失为一种选择。
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2. 人胰岛素的生产方法 （3）化学转型法制人胰岛素
2. 人胰岛素的生产方法 迄今为止，有四种大规模生产人胰岛素的方法： （3）化学转型法制人胰岛素 上述思路的技术路线是：在pH为6-7的有机相中使胰蛋白酶催化其逆反应，该酶在过量的苏氨酸叔丁酯的存在下，将猪胰岛素B链C末端的丙氨酸交换下来，所形成的人胰岛素叔丁酯再用三氯乙酸脱去叔丁酯基团，最终获得人胰岛素。该过程的总转化率为60%，但工艺路线耗时，分离纯化操作复杂，产品的价格不菲。
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2. 人胰岛素的生产方法 （4）基因工程法制人胰岛素
2. 人胰岛素的生产方法 迄今为止，有四种大规模生产人胰岛素的方法： （4）基因工程法制人胰岛素 1982年，美国Ely LiLi公司首先使用重组大肠杆菌生产人胰岛素，成为世界上第一个上市的基因工程药物。1987年，Novo公司又推出了利用重组酵母菌生产人胰岛素的新工艺。
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2. 人胰岛素的生产方法 （4）基因工程法制人胰岛素
2. 人胰岛素的生产方法 迄今为止，有四种大规模生产人胰岛素的方法： （4）基因工程法制人胰岛素 上述由基因工程菌合成的重组人胰岛素在体外 胰岛素受体结合性能、淋巴细胞和成纤维细胞的应答能力、降血糖作用、血浆药代动力学等指标上均与天然胰岛素没有任何区别，而且还具有无免疫原性、注射吸收迅速等优点，充分展示了基因工程在生物医药领域中的巨大潜力。
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3. 重组人胰岛素的大肠杆菌工程菌的构建 （1）A链和B链分别表达法
3. 重组人胰岛素的大肠杆菌工程菌的构建 （1）A链和B链分别表达法 化学合成: A、B链的编码序列
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（1）A链和B链分别表达法 表达产物的后处理路线：
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（1）A链和B链分别表达法 生产技术的评价：
为了进一步降低生产成本，美国Ely LiLi公司随后又建立了第二条生产重组人胰岛素的工艺路线。
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3. 重组人胰岛素的大肠杆菌工程菌的构建 （2）人胰岛素原表达法
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（2）人胰岛素原表达法 表达产物的后处理路线：
胰岛素原是胰岛素的前身,需要经过酶切去除C 肽,方成为有功能的胰岛素。本实验室设计的人胰岛素原类似物,其C 肽通过两个Lys 分别与A 链的N 端和B 链的C 端相连接,经过Lys2C 酶酶切后,得到C 肽,再经过羧肽酶B 切除B 链N 端的6个His 构成的短肽,便可得到重组人胰岛素。在人胰岛素原的N 端插入6 个His 的短肽,可明显提高人胰岛素原的表达量短肽对普通蛋白酶的水解作用相对而言不敏感;由于极性的关系短肽位于胰岛素原分子结构的外围,保护胰岛素原的敏感部位,从而稳定了胰岛素原。
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（2）人胰岛素原表达法 生产技术的评价： 二硫键的正确配对率相应提高，折叠率高达80%以上。虽然这条工艺路线并不比AB链分别表达法更为简捷，而且还要使用两种高纯度的酶制剂，但理想的折叠率在很大程度上弥补了工艺繁琐的缺陷，使得每克最终产品的成本仅50美元。 目前美国Ely LiLi公司采用此工艺年产十几吨的重组人胰岛素。
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3. 重组人胰岛素的大肠杆菌工程菌的构建 （3）A链和B链同时表达法
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3. 重组人胰岛素的大肠杆菌工程菌的构建 （4）分泌型重组人胰岛素表达法
3. 重组人胰岛素的大肠杆菌工程菌的构建 （4）分泌型重组人胰岛素表达法 上述三种重组大肠杆菌的构建路线均采用胰岛素或胰岛素原编码序列与大肠杆菌b-半乳糖苷酶基因拼接的方法，所产生的融合型重组蛋白表达率高、稳定性强，但不能分泌，只要以包涵体的形式存在于胞质中。
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3. 重组人胰岛素的大肠杆菌工程菌的构建 （4）分泌型重组人胰岛素表达法
3. 重组人胰岛素的大肠杆菌工程菌的构建 （4）分泌型重组人胰岛素表达法 一种能促进融合蛋白分泌的工程菌构建策略，是将胰岛素或胰岛素原编码序列与b-內酰胺酶基因拼接，b-內酰胺酶通常能被大肠杆菌分泌到胞外。由此获得的工程菌同时具备了稳定高效表达可分泌型融合蛋白的优良特性，为胰岛素的后续分离纯化工序减轻了负担。
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第二节 外源基因在真核细胞中的表达 酵母菌、植物原生质体、动物培养细胞等。 外源基因 真核或病毒启动子 MCS PolyA信号 终止子
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一、真核生物表达的优越性和必要性 1、真核生物具有转录后加工系统，可识别并删除基因中的内含子，剪切加工为成熟mRNA
2、具备完善的翻译后加工系统，可进行糖基化、乙酰化等修饰，使蛋白形成正确的天然构型，因而真核生物表达系统产生的蛋白更接近天然状态，有利于其功能、生物活性的研究。
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一、真核生物表达的优越性和必要性 3、某些真核细胞可将基因表达产物分泌到细胞培养液中，简化了纯化工艺，降低了生产成本。
4、另外，真核生物表达的调控方式非常复杂，有助于我们深入了解基因调控机制。
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二、真核生物表达系统 （一） 外源基因在酵母中表达 （二）植物细胞表达系统 （三）昆虫培养细胞表达系统 （四） 哺乳动物细胞表达系统
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（一）外源基因在酵母中表达 １．酵母菌表达外源基因的优势 ２．酵母转化和表达的一般过程 ３．在啤酒酵母中表达的重组蛋白
４．广泛用于外源基因表达的酵母宿主菌 ５．利用重组酵母生产乙肝疫苗
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1. 酵母菌表达外源基因的优势 全基因组测序，基因表达调控机理比较清楚，遗传操作简便； 具有原核细菌无法比拟的真核蛋白翻译后加工系统；
1. 酵母菌表达外源基因的优势 全基因组测序，基因表达调控机理比较清楚，遗传操作简便； 具有原核细菌无法比拟的真核蛋白翻译后加工系统； 已经分离出很强的启动子； 能将外源基因表达产物分泌至培养基中； 生长迅速、大规模发酵历史悠久、技术成熟、工艺简单、成本低廉； 不含有特异性的病毒、不产内毒素,美国FDA认定为安全的基因工程受体系统。 FDA：美国食品药物管理局
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2. 酵母转化和表达的一般过程 CaCl2 PEG 酶去壁 酵 母 原生质体 感受态 带有目的基因的重组载体 转化 整合到染色体上
2. 酵母转化和表达的一般过程 CaCl2 PEG 酶去壁 酵 母 原生质体 感受态 带有目的基因的重组载体 转化 Ura3+营养缺陷型 培养基筛选 整合到染色体上 或独立在酵母细胞内 转化子克隆生长 鉴定克隆 发酵表达 外源基因产物 分离、纯化
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将目的基因克隆至载体 1. 基因及载体分别用限制酶切割； 2. 回收切割的基因和载体，然后用T4 DNA连接酶连接； 3. 将构建的重组质粒转化至大肠杆菌受体菌； 4. 提取重组质粒DNA，酶切鉴定重组质粒，筛选出阳性重组菌株。
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3. 在啤酒酵母中表达的重组蛋白 HIV-1抗原 丙肝病毒蛋白 诊断试剂 HIV-1外壳蛋白 疟原虫环子孢子蛋白 乙肝病毒表面抗原 疫苗 名称 种类 凝血因子VIIIa 1抗胰蛋白酶 集落刺激因子 成纤维细胞生长因子 胰岛素前体 血小板源生长因子 类胰岛素生长因子 胰岛素 上皮生长因子 人类治疗用蛋白药物
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4. 广泛用于外源基因表达的酵母宿主菌 其中酿酒酵母的遗传学和分子生物学研究最为详尽， 但巴斯德毕赤酵母表达外源基因最理想。
4. 广泛用于外源基因表达的酵母宿主菌 酵母属 如酿酒酵母 克鲁维酵母属 如乳酸克鲁维酵母 毕赤酵母属 如巴斯德毕赤酵母 裂殖酵母属 如非洲酒裂殖酵母 汉逊酵母属 如多态汉逊酵母 其中酿酒酵母的遗传学和分子生物学研究最为详尽， 但巴斯德毕赤酵母表达外源基因最理想。
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5. 利用重组酵母生产乙肝疫苗 （1）乙型肝炎病毒的结构
5. 利用重组酵母生产乙肝疫苗 （1）乙型肝炎病毒的结构 蛋白包裹的双链DNA病毒，具有感染力的病毒颗粒呈球面状，直径为42 nm，基因组仅为3.2 kb。病毒颗粒的主要结构蛋白是病毒的表面抗原多肽（HBsAg）或S多肽。颗粒内的蛋白成份包括核心抗原（ HBcAg ）、病毒DNA聚合酶、微量病毒蛋白。 由乙型肝炎病毒（HBV）感染引起的急慢性乙型肝炎是一种严重的传染病，每年约有200万病人死亡，并有3亿人成为HBV携带者，其中相当一部分人可能转化为肝硬化或肝癌患者。目前对乙型肝炎病毒还没有一种有效的治疗药物，因此高纯度乙型疫苗的生产对预防病毒感染具有重大的社会效益，而利用重组酵母大规模生产乙型疫苗为其广泛应用提供了可靠的保证。
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5. 利用重组酵母生产乙肝疫苗 （1）乙型肝炎病毒的结构
5. 利用重组酵母生产乙肝疫苗 （1）乙型肝炎病毒的结构 除此之外，被乙肝病毒感染的人的肝脏还能合成并释放大量的22nm的空壳亚病毒颗粒，其免疫原性是未装配的各种包装蛋白组份的1000倍。包装蛋白共有三种转膜糖蛋白：S、M、L多肽。 免疫原性（immunogenicity），是指能够刺激机体形成特异抗体或致敏淋巴细胞的能力。即指抗原能刺激特定的免疫细胞，使免疫细胞活化、增殖、分化，最终产生免疫效应物质抗体和致敏淋巴细胞的特性。
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5. 利用重组酵母生产乙肝疫苗 （2）乙型肝炎病毒的包装蛋白编码基因
5. 利用重组酵母生产乙肝疫苗 （2）乙型肝炎病毒的包装蛋白编码基因 S区的翻译产物为S多肽，由226个氨基酸残基组成；M多肽和L多肽（pre-S2-S和pre-S1-pre-S2-S)则分别由281个和389个氨基酸残基组成，Dane病毒颗粒除了含有大量的S多肽外，还有少量的M多肽和L多肽参与包装。
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5. 利用重组酵母生产乙肝疫苗 （3）传统乙肝疫苗的制备
5. 利用重组酵母生产乙肝疫苗 （3）传统乙肝疫苗的制备 乙肝病毒在体外细胞培养基中并不能繁殖，因此第一代的乙肝疫苗是从病毒携带者的肝细胞质膜上提取出来的。虽然这种质膜来源的疫苗具有较高的免疫原性，但由于原材料的限制难以大规模产业化。
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5. 利用重组酵母生产乙肝疫苗 （4）产乙肝表面抗原的重组酿酒酵母
5. 利用重组酵母生产乙肝疫苗 （4）产乙肝表面抗原的重组酿酒酵母 20世纪80年代开始选择酿酒酵母表达重组HBsAg，将S多肽的编码置于ADH1启动子控制下，转化子能表达出具有免疫活性的重组蛋白，它在细胞提取物中以球形脂蛋白颗粒的形式存在，平均颗粒直径为 22 nm，其结构和形态均与慢性乙肝病毒携带者血清中的病毒颗粒相同。
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5. 利用重组酵母生产乙肝疫苗 （4）产乙肝表面抗原的重组酿酒酵母
5. 利用重组酵母生产乙肝疫苗 （4）产乙肝表面抗原的重组酿酒酵母 目前，由酿酒酵母生产的重组HBsAg颗粒已作为乙肝疫苗商品化，重组产物的最终产量可达细胞总蛋白量的1%~2%。进一步的研究表明，M多肽和L多肽对S型疫苗具有显著的增效作用，由三者（或两者）构成的复合型乙肝疫苗还可以诱导那些对S抗原缺乏响应的人群的免疫反应。
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（5）产乙肝表面抗原的重组巴斯德毕赤酵母 利用甲基营养菌巴斯德毕赤酵母作为受体细胞表达HBsAg，显示出比酿酒酵母系统更大的优越性。重组菌的构建过程如下：将HBsAgd 编码序列和用于选择标记的巴斯德毕赤酵母组氨醇脱氢酶基因PHIS4插入到甲醇可诱导型的AXO1启动子和AXO1终止子之间，构成环状重组质粒pBSAG151。用Bgl Ⅱ打开pBSAG151,使得AOX1启动子和AXO1终止子分别位于线型DNA片段的两端，并转化HIS ˉ的受体细胞。在HIS 的转化子中，重组DNA片段与受体染色体上的AOX1基因发生同源交换，单拷贝的HBsAg编码序列稳定地整合在染色体上。由于巴斯德毕赤酿酒酵母染色体DNA上还拥有表达水平较低的第二个乙醇氧化酶基因AOX2，因此转化子仍能在含有甲醇的培养基上生长。重组菌现在含有一定浓度的甘油培养基中培养，待甘油耗尽时，加入甲醇诱导HBsAg的表达，最终S蛋白的产量可达到受体细胞可溶性蛋白总量的2% ~3%，比含有多拷贝表达单元的重组酿酒酵母要高近一倍。
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5. 利用重组酵母生产乙肝疫苗 （5）产乙肝表面抗原的重组巴斯德毕赤酵母
5. 利用重组酵母生产乙肝疫苗 （5）产乙肝表面抗原的重组巴斯德毕赤酵母 重组菌经甲醇诱导表达HBsAg，最终S蛋白的产量可达细胞可溶性蛋白总量的2~3%，在大规模的生产过程中，巴斯德毕赤酵母工程菌在一个240L的发酵罐中培养，最终可获得90克 22nm的HBsAg颗粒，足够制成900万份乙肝疫苗。
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（二）植物细胞表达系统 1. 植物受体系统的特点
1. 植物受体系统的特点 （1）细胞具有全能性 （2）光合作用，培养条件简单，生产成本低 （3）表达产物具有免疫原性和生物活性 （4）灵活性及实用性强 （5）稳定的外植体来源
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2. 在植物品种改良中的应用 （1）控制果实成熟 （2）抗病虫害的转基因植物
乙烯由S-腺苷甲硫氨酸经氨基环丙烷羧酸合成酶和乙烯合成酶催化裂解而成。 （2）抗病虫害的转基因植物 苏云金芽孢杆菌的BT基因、蛋白酶抑制剂基因、凝集素基因、脂肪氧化酶基因、几丁质酶基因、蝎毒素、蜘蛛毒素基因等40多个。
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2. 在植物品种改良中的应用 （3）抗除草剂的转基因植物 （4）抗环境压力的转基因植物
抑制农作物对除草剂的吸收、降低敏感性靶蛋白对除草剂分子的亲和性 （4）抗环境压力的转基因植物 高效表达能提高植物胞内渗透压的同源或异源蛋白，提高植物细胞渗透压。 长期的植物生理学研究结果表明，植物对盐、碱、旱、寒、热等环境不利因素的自我调节能力很大程度上取决于细胞内的渗透压，提高渗透压往往能改善植物对上述环境不利因素的耐性。为达到此目的至少有两种战略可供选择：一是高效表达能提高植物胞内渗透压的同源或异源蛋白；二是借助于蛋白质工程技术改变植物细胞内丰度较高的蛋白质的氨基酸组成，如在不影响蛋白质结构与功能的前提下适当提高脯氨酸残基的含量等。
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2. 在植物品种改良中的应用 （5）提高粮食中必需氨基酸的含量 （6）改变花卉的颜色
将蚕豆中一种富含赖氨酸和甲硫氨酸的蛋白编码基因植入玉米中。 （6）改变花卉的颜色 抑制矮牵牛细胞内的苯基苯乙烯酮合成酶CHS基因表达，使花冠的颜色由野生型的紫红色变成了白色，及一系列中间类型的花色。 花卉的颜色是由花冠中的色素成分决定的。大多数花卉的色素为黄酮类物质，由苯丙氨酸通过一系列的酶促反应合成，而颜色主要取决于色素分子侧链取代基团的性质和结构，如花青素衍生物呈红色，翠雀素衍生物呈蓝色等。在黄酮类色素的生物合成途径中，苯基苯乙烯酮合成酶（CHS）是一个关键酶。利用反义RNA技术可有效抑制矮牵牛花属植物细胞内的CHS基因表达，使转基因植物花冠的颜色由野生型的紫红色变成了白色，并且对CHS基因表达抑制程度的差异还可产生一系列中间类型的花色。
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3. 植物生物反应器 （1）转基因烟草表达人葡萄糖脑苷脂酶
3. 植物生物反应器 （1）转基因烟草表达人葡萄糖脑苷脂酶 治疗高歇斯症遗传病，称得上当今世界最昂贵的药物。每生产一个剂量的hGC要消耗 只人类胎盘，将克隆的hGC基因经改造导入到烟草中，每克新鲜叶片中，hGC的含量高达1mg。
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3. 植物生物反应器 （2）转基因烟草生产植酸酶 饲料中添加植酸酶则可以提高动物对植酸磷元素的利用率，减少动物粪便中磷酸盐含量。从黑曲霉菌中克隆到植酸酶基因，导入到烟草的种子中表达。在饲料中添加这种转基因烟草的种子便可达到良好的效果。 在许多植物的种子中，磷元素主要是以肌醇-6-磷酸（即植酸）的形式存在。单胃动物如猪和家禽几乎不能利用这些磷元素，因此必须在饲料中添加无机磷以满足动物营养的需要。在饲料中添加植酸酶则可以提高动物对植酸磷元素的利用率，减少动物粪便中磷酸盐含量，改善畜牧业发达地区磷酸盐富集化污染的程度。荷兰科学家从黑曲霉菌中克隆到植酸酶基因，并将之导入到烟草的种子中表达。在饲料中添加这种转基因烟草的种子便可达到良好的效果。
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3. 植物生物反应器 （3）转基因拟南芥生产聚羟基丁酸
3. 植物生物反应器 （3）转基因拟南芥生产聚羟基丁酸 将真养产碱菌的聚羟基丁酸PHB生物合成基因导入拟南芥中，转基因植物在整个生命周期中，PHB的含量逐步增加，每克湿重植物产PHB高达10mg ，大约相当于细胞干重的14%。
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转基因植物的潜在的安全隐患？ ① 转基因植物的“基因漂移“风险 产生超级杂草、新的病毒、病虫害等。如加拿大“超级杂草”事件。
产生超级杂草、新的病毒、病虫害等。如加拿大“超级杂草”事件。 ② 转基因植物的“杂草化”问题 即作物与野生近缘种天然杂交形成恶性杂草。如海甜菜和甜菜杂交形成的恶性杂草曾对欧洲甜菜生产造成很大影响。 ③ 基因工程产品对人类健康的潜在影响 ④ 可能使生物多样性受到损害
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思 考 题 1、酵母作为真核基因的高效表达系统有什么优缺点？
2、有哪些方法可以将外源目的基因转移到植物体内？转基因植物的潜在的安全隐患主要表现在哪些方面？
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