Western印迹.

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1 Western印迹

2 实验目的

3 实验原理 Western印迹杂交法是利用特异性抗体做探针，对附着于固相支持体上的某些特异性蛋白进行鉴别和定量的方法。它具有固相操作简便及不必对细胞进行放射性预标记等优点。原理为：将待测样品溶解于含有去污剂和还原剂的溶液中，SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳使蛋白变性并分离，用电转移方法转移到固相支持体上（NC膜、PVDF膜），滤膜与抗靶蛋白的非标记抗体反应，再用二级免疫学试剂进行检测。检测方法有放射性标记、酶标化学显色或酶标化学发光等。酶标化学发光法以其高敏感性、结果可在X光片上长期保存等优点而优于酶标化学显色法。

4 是蛋白水平检测，研究基因表达与功能的一种方法。
原理及步骤 T or cell 提取蛋白 聚丙烯酰胺凝胶电泳，分离蛋白（SDS-PAGE ) 转移（印迹）于硝酸纤维素膜 加抗体检测某种特异性蛋白质

5 Western Blot

6 Western blot 化学显色复合物 抗HRP HRP 抗生物素 生物素 ABC复合物 生物素化二抗 一抗 组织抗原

7 实验材料 1．29:1聚丙烯酰胺凝胶 2．Tris-甘氨酸电泳缓冲液： 25mM Tris 碱 250mM 甘氨酸
0.1%(m/v) SDS 3．1×SDS凝胶加样缓冲液： 50mmol/L Tris-Cl (pH6.8) 100 mmol/L 二硫苏糖醇（DTT） 2% (m/v) SDS 0.1% (m/v) 溴酚蓝 10% 甘油 临用前加DTT，DTT可用0.01M 乙酸钠（pH5.2）配成1mmol/L母液。 4．转移缓冲液： 193mM 甘氨酸 20% 甲醇 5．1×TBS： 20mM Tris-HCl 150mM NaCl 最后调pH值至7.4 6．TBST: TBS中加入0.05% Tween-20。 7．封闭液：用TBST配制5%脱脂奶粉。 8．Stripping Buffer： 100mM β巯基乙醇 2%(m/v) SDS 62.5mM Tris-HCl 最后调pH值至6.7

8 方法和步骤

9 一．配胶 注意一定要将玻璃板洗净，最后用ddH2O冲洗，将与胶接触的一面向下倾斜置于干净的纸巾晾干。
分离胶及浓缩胶均可事先配好（除AP及TEMED外），过滤后作为储存液避光存放于4℃，可至少存放1个月，临用前取出室温平衡（否则凝胶过程产生的热量会使低温时溶解于储存液中的气体析出而导致气泡，有条件者可真空抽吸3分钟），加入10%AP（0.7~0.8:100, 分离胶浓度越高AP浓度越低，15%的分离胶可用到0.5:100）及TEMED（分离胶用0.4:1000, 15%的可用到0.3:1000，浓缩胶用0.8：1000）即可，如室温较低可升高10%AP及TEMED浓度。 灌入2/3的分离胶后应立即封胶，胶浓度＜10%时可用0.1%的SDS封，浓度＞10%时用水饱和的异丁醇或异戊醇，也可以用0.1%的SDS。封胶后切记，勿动。 待胶凝后将封胶液倒掉，如用醇封胶需用大量清水及ddH2O冲洗干净，然后加少量0.1%的SDS，目的是通过降低张力清除残留水滴。片刻后倒掉SDS，将玻璃板倒立放置片刻控净。 灌好浓缩胶后1h拔除梳子，注意在拔除梳子时宜边加水边拔，以免有气泡进入梳孔使梳孔变形。拨出梳子后用ddH2O冲洗胶孔两遍以去除残胶，随后用0.1%的SDS封胶。若上样孔有变形，可用适当粗细的针头拨正；若变形严重，可在去除残胶后用较薄的梳子再次插入梳孔后加水拔出。30min后即可上样，长时间有利于胶结构的形成，因为肉眼观的胶凝时其内部分子的排列尚未完成。

10 二．样品处理 1．培养的细胞（定性）： ⑴ 去培养液后用温的PBS冲洗2~3遍（冷的PBS有可能使细胞脱落）。
⑵ 对于6孔板来说每孔加200~300μl，60~80℃的1×loading buffer。 ⑶ 100℃，1min。 ⑷ 用细胞刮刀刮下细胞后在EP管中煮沸10min。 ⑸ 用干净的针尖挑丝，如有团块则将团块弃掉，如果没有团块但有拉丝现象，则可以将EP管置于0℃后在4000~16000g离心2min，再次挑丝。若无团块也无丝状物但溶液有些粘稠，可通过使用1ml注射器反复抽吸来降低溶液粘滞度，便于上样。 ⑹ 待样品恢复到室温后上样。 2．培养的细胞（定量）： ⑵ 加入适量的冰预冷的裂解液后置于冰上10~20min。 ⑶ 用细胞刮刀刮下细胞，收集在EP管后超声（100~200w）3s，2次。 ⑷ 12000g离心，4℃，2min。 ⑸ 取少量上清进行定量。 ⑹ 将所有蛋白样品调至等浓度，充分混合沉淀后加loading buffer后直接上样最好，剩余溶液（溶于1×loading buffer）可以低温储存，-70℃一个月，-20℃一周，4℃ 1~2天，每次上样前98℃，3min。 3．组织： ⑴ 匀浆：对于心肝脾肾等组织可每50~100mg加1ml裂解液，肺100~200mg加1ml裂解液。可手动或电动匀浆。注意尽量保持低温，快速匀浆。 ⑵ 12000g离心，4℃，2min。 ⑶ 取少量上清进行定量。 ⑷ 将所有蛋白样品调至等浓度，充分混合沉淀加loading buffer后直接上样最好，剩余溶液（溶于1×loading buffer）可以低温储存，-70℃一个月，-20℃一周，4℃ 1~2天，每次上样前98℃，3min。

11 三．电泳 1．上样前将胶板下的气泡赶走。 2．所有蛋白样品调至等浓度后上样，样品两侧的泳道用等体积的1×loading buffer上样，Marker也用1×loading buffer调整至与样品等体积。 3. 以初始电压为45V时的电流强度进行稳流电泳，当电压达65V时改为稳压电泳。 4. 在目的蛋白泳动至距胶下缘1cm以上结束。

12 四．转膜 1．电泳结束前20分钟左右戴上手套开始准备：
浸泡NC膜：将NC膜平铺于去离子水面，靠毛细作用自然吸水后再完全浸入水中10min以排除气泡，随后浸泡入转移液中。PVDF膜则在M-OH中浸泡20min以上后转入转移液中。将滤纸也浸入转移液中。 2．取胶： 将胶卸下，保留30-100KD或分子量范围更广些的胶（以便以后杂其他感兴趣的蛋白），左上切角，在转移液中稍稍浸泡一下，置于洁净玻璃板上，按“滤纸—凝胶—NC膜—滤纸”（从上到下）的顺序装置好。注意用玻棒逐出气泡，剪去滤纸与膜的过多部分（尤其是干转，以防止短路） 3．转膜： 湿转：电转槽用去离子水淋洗晾干，加入1,000ml电转液。将胶平铺于海绵上，滴加少许电转液再次驱赶气泡，封紧后放入电转槽，注意膜在正极一侧。降温，将电泳槽置于冰水混合物中。恒流100mA过夜，或400mA，4h。注意不同蛋白的要求不同。 干转：用电转液淋洗石墨电极，滤纸吸干，铺上胶，再滴少许电转液，以1.5mA/cm2凝胶面积转移1-2小时。负载电压不宜超过1V/cm2胶面积。

13 五．封闭及杂交 1．封闭： 将膜从电转槽中取出，去离子水与TBST稍加漂洗，浸没于封闭液中缓慢摇荡一小时。必要时可先用丽春红染色（2%乙酸，0.5%丽春红的水溶液）观察蛋白条带，再用去离子水和TTBS将丽春红洗脱后封闭，如用蛋白marker则可省略此步。 2．结合一抗： 一抗的准备：使用反贴法时每张3×9cm2膜约需2ml一抗稀释液。 反贴法的操作：含一抗的封闭液滴加于摇床的塑料膜上，将Western膜从封闭液中取出，滤纸贴角稍吸干，正面朝下贴在一抗上，注意不要留下气泡，室温下轻摇孵育一小时或4℃静置过夜。在反应体系外面罩一湿润平皿以防止液体过多蒸发。 3．洗涤： 一抗孵育结束后，用TBST漂洗膜后再浸洗四次，每次10min。 4．结合二抗： 根据一抗来源选择合适的二抗，根据鉴定方法选择HRP或AP标记的抗体，按相应比例稀释（1:1000~1:10000），室温轻摇一小时。 5．洗涤： 二抗孵育结束后，用TBST漂洗膜后再浸洗六次，每次10min。

14 六．发光鉴定 一般使用辣根过氧化物酶HRP-ECL发光法或碱性磷酸酶AP-NBT/BICP显色法。 1．HRP-ECL发光法：
将A、B发光液按比例稀释混合。膜用去离子水稍加漂洗，滤纸贴角吸干，反贴法覆于A、B混合液滴上，熄灯至可见淡绿色荧光条带（5min左右）后滤纸贴角吸干，置于保鲜膜内固定于片盒中，迅速盖上胶片，关闭胶盒，根据所见荧光强度曝光。取出胶片立即完全浸入显影液中1-2min，清水漂洗一下后放在定影液中至底片完全定影，清水冲净晾干，标定Marker，进行分析与扫描。 2．AP-NBT/BICP显色法： 每片NBT/BICP可溶解于30ml水中，使用前将一片分装在30个 EP管中，每张3×9cm的膜取一管配成1ml即可。将PBST或TTBS洗涤过的膜用去离子水稍加漂洗，滤纸贴角吸干，反贴法覆于NBT/BICP溶液液滴上，并用不透明物体（如报纸）遮挡光线，显色20s后每10s观察一次，至条带明显或有本底出现时将膜揭起置去离子水中漂洗后放滤纸上晾干即可观察与扫描。

15 七．膜再生 如前次杂交结果条带距离本次杂交的蛋白的预计位置差别较大则只需用TBST洗涤掉发光液（10min×3次）后从一抗杂交开始，后续步骤同前。 如前次杂交结果条带距离本次杂交的蛋白的预计位置较近则需更强的洗涤，可用 strip液（可用杂交袋）于室温摇动洗涤30min~60min，然后用TBST洗涤10min×3次，再从封闭开始，后续步骤同前。 对于杂交若干次的膜，如果常规洗涤方法不易去掉众多条带，可用强度更强的自配的strip液（可用杂交袋）于50℃洗涤30min，然后用TBST洗涤10min×3次，再从封闭开始，后续步骤同前。

16 四、注意事项 内参即是内部参照，对于哺乳动物细胞表达来说一般是指由管家基因编码表达的蛋白，它们在各组织和细胞中的表达相对恒定，在检测蛋白的表达水平变化时常用它来做参照物。其作用是校正蛋白质定量、上样过程中存在的实验误差，保证实验结果的准确性。 在Western Blotting中使用内参其实就是在WB过程中的另外用内参对应的抗体检测内参，这样在检测目的产物的同时可以检测内参的表达，由于内参在各组织和细胞中的表达相对恒定，借助检测每个样品内参的量就可以用于校正上样误差，这样半定量的结果才更为可信。此外使用内参可以作为空白对照，检测蛋白转膜情况是否完全、整个Western Blot显色或者发光体系是否正常。 常用的蛋白质内参有GAPDH和细胞骨架蛋白beta-actin或beta-tubulin。一般要选择一个在处理因素作用的条件下蛋白含量不会发生改变的蛋白作内参。 1. 为了让实验更加严谨有说服力都要设计对照实验，对照分为：阳 性对照（最好有标准品（比如β-actin，GAPDH）或阳性血清）；阴性 对照（测血时用相应小鼠未免疫血清（即正常血）；空白对照（不加一抗，用PBS代替）；无关对照（用无关抗体） 2. 一抗、二抗的浓度一般要参照抗体说明书选择最适当的比例，一抗二抗的选择直接影响实验结果以及背景的深浅。 3. 实验设计时所釆用的抗原批次要一样，尽量的避免人为的带来个体差异。特别在做裂解液时更要注意所釆用的操作条件，尽可能的排除可变因素给实验带来不确定性。 4. 凝胶的质量直接影响以后的实验结果，要特别注意几点：凝胶要均一没有气泡；积层胶与分离胶界面要水平；AP和TEMED的量不能过多，太多会导致胶易脆裂；拔梳子时要快，尽量保证点样孔平整。 5. 电泳、转膜时特别要注意正负极，电压电流都不能过高；转膜时“三明治”的叠放次序不错，同时要防止产生气泡；尽量让电转温度保持在10度以下，冰浴为宜。 6. 封闭时一般在室温下2h就够了，但是要注意如果是生物素标记的二抗就不宜用牛奶，因为牛奶中含有生物素，用BSA效果更好。 7. 加一抗二抗要严格保证反应时间，洗膜要注意尽可能地将一抗二抗洗净，有利于降低背景；还要注意一抗二抗的匹配。 8. 在显色发光时要特别注意二抗所对应的显色方法，特别是在发光时要注意发光时间和显影时间的控制，以看得清楚目的条带为标准。

17 五、思考题 1．Western Blot的实验原理是什么？ 2．在Western Blot实验时有哪些注意事项？