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第十二章 固相膜免疫测定
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第一节 概述
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标记免疫测定 放射免疫测定 1960’ 酶免疫测定 1970’ 荧光免疫测定 1980’－1990’ 化学发光免疫测定 1990’－
放射免疫测定 1960’ 酶免疫测定 1970’ 荧光免疫测定 ’－1990’ 化学发光免疫测定 1990’－ 膜固相免疫测定 ’－
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免疫测定分类 免疫浊度测定 Ag + Ab AgAb + Ab 标记免疫测定 Ag + Ab* Ag Ab* + Ab* （B） （F）
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免疫测定原理 利用抗原抗体反应检测标本中微量物质 抗原+抗体 抗原抗体复合物 Ag +Ab Ag * Ab
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固相免疫测定 B与F分离 Ab* Ab* Ag Ag + Ab* Ab Ab
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固相膜的特点 多孔性 毛细管作用 非共价键高度吸附抗体或抗原 高度敏感性 易于漂洗 操作简便
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常用的固相膜 玻璃纤维素(fiberglass)膜 尼龙(nylon)膜
聚偏氟乙稀( polyvinylidene fluoride ，PVDF)膜 硝酸纤维素（nitrocellulose，NC）膜
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固相膜的技术要求 孔径：0.2~0.6 μm 流速：以ml/cm2/min表示 蛋白质结合力：吸附力很强，以μg/cm2表示 均一性
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固相NC膜
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第二节 免疫金标记技术
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免疫金标记技术 免疫金标记技术(Immunogold labelling techique) 主要利用了金颗粒具有高电子密度的特性，在金标蛋白结合处，在显微镜下可见黑褐色颗粒，当这些标记物在相应的配体处大量聚集时，肉眼可见红色或粉红色斑点，因而用于定性或半定量的快速免疫检测。这一反应也可以通过银颗粒的沉积被放大，称之为免疫金银染色（immunogold silver staining，IGSS）。
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胶体金制备原理 胶体金（colloidal gold）的制备一般采用还原法，常用的还原剂有柠檬酸钠、鞣酸、抗坏血酸、白磷、硼氢化钠等。向一定浓度的金溶液内加入一定量的还原剂使金离子还原成金原子，形成金颗粒悬液，也称金溶胶（gold solution）。
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胶体金的制备及特性 胶体金粒径 1%柠檬酸钠加入量 胶体金特性 （nm) （ml)* 呈色 lmax(nm) 16 2.00 橙色 518
24.5 1.50 橙红色 522 41 1.00 红色 525 71.5 0.70 紫色 535 *还原100 ml0.01%HAuCl4 所需量
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胶 体 金（Colloidal Gold） 15~60 nm 优质 劣质
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胶体金结合物（Conjugate）
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第三节 膜载体免疫测定的种类与原理
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固相微孔膜测定种类 斑点金免疫渗滤试验(dot immunogold filtration assay, DIGFA)
免疫层析试验（immunochromatography assay, ICA） 斑点ELISA (dot enzyme linked immunosorbent assay, Dot-ELISA) 酶联免疫斑点试验(enzyme linked immunospot , ELISPOT) 免疫印迹法(immunoblotting test, IBT) 放射免疫沉淀试验(radioimmunoprecipitation assay, RIPA)
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IFA 和ICA 免疫渗滤测定 （IMMUNOFILTRATION ASSAY，IFA） 免疫层析测定
（IMMUNOCHROMATOGRAPHIC ASSAY，ICA）
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IFA 穿流（FLOW THROUGH） ICA 横流（LATERAL FLOW）
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免疫渗滤测定(IFA)
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双抗体夹心法测抗原 IFA A B
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免疫层析测定 ICA
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ICA 试剂条 结 合 物 垫 样 品 垫 吸 水 垫 NC 膜
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双抗体夹心法测抗原 ICA
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间接法测抗体ICA
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ICA 结果观察 阳性 阴性 无效
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IFA与ICA的比较 IFA ICA 试剂形式 渗滤装置及附加试剂 试剂条 试剂保存 4~8℃ 6个月 室温一年 操作步骤 3~5 1
4~8℃ 6个月 室温一年 操作步骤 3~5 1 观察时间 3 min 3~20 min 阳性反应颜色浓度 操作结束颜色不变 颜色逐渐加深
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膜固相免疫测定的特点 优点 不足之处 简便，快速 敏感度略低，价格略高（与ELISA比） 单份测定 精密度较差，质控困难
保存期长（优质试剂） 稳定性较差（普通试剂） 可测定物范围广（主要为定性试验） 不易制备定量、半定量试剂 感染性疾病的诊断 妊娠、排卵的诊断 肿瘤标志 心肌标志 滥用药物
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GIFA技术的发展（间接法测抗体） 快速检测（渗滤法）原理图 固相膜 固相抗原 待测抗体 人IgG 固相抗人IgG抗体 金标记抗人IgG抗体
阳性 阴性 固相膜 固相抗原 待测抗体 人IgG 固相抗人IgG抗体 金标记抗人IgG抗体 快速检测（渗滤法）原理图
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GIFA技术的发展 第一代 1988 HIVCHEK（DuPont） 单点， 5~10分钟， 血清， 金标试剂瓶装冻干品
第八代 INSTANTCHEK HIV 1+2 2点（测试+控制） 金标试剂：单人份、液体 样品： 血清、血浆、全血、 尿液 第九~十二代 研制中 单一试剂
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ICA技术的发展 1990年 ABBOTT公司 胶体硒标记ICA Unipath公司 CLEARVIEW 立明衣原体 彩色胶乳标记ICA
ROCHE Cardiac Reader TnT 定量 0.1~3 ng/ml 合成TnT质控点
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半定量测定 IFA ICA S C 肌红蛋白 双孔法 S：测定孔 C：定量质控 100μg/L 微量白蛋白 单孔法 T：测定孔
C1：定量质控 30 mg/L C2：定量质控 200 mg/L 结果判定： （-） <30 （+） ~100、 （++） ~200 （+++） >200 mg/L ICA 甲胎蛋白（AFP） 参考值：30 μg/L 肝癌诊断值：>400 μg/L （-） <30 （+） 30~200 （++） 200~400 （+++） >400 μg/L 测 定 线 对 照 线 T C C1 S C
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Dot-ELISA
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ELISPOT 检测原理 细胞受到刺激后局部产生细胞因子，此细胞因子被特异单克隆抗体捕获。细胞分解后， 被捕获的细胞因子与生物素标记的二抗结合，其后再与碱性磷酸酶标记的亲和素结合。 BCIP/NBT 底物孵育后， PVDF 孔板出现“紫色”的斑点表明细胞产生了细胞因子，通过 CTL 公司生产的 ELISPOT 酶联斑点分析系统对斑点的分析后得出结果。
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ELISPOT 分析仪解决以下问题 哪些斑点是抗原特异性 T 细胞产生的（此斑点具有进一步分析价值），哪些是无关细胞产生的（此斑点没有 T 细胞研究价值） 斑点大小的意义 在对不同细胞因子计数和分析时，如何定义斑点最大和最小尺寸 如何从单个细胞基础上分析 实验精确度有多高？如果一个细胞产生相似的细胞因子，在多大程度上会干扰分析结果？ 几次重复实验才能使结果更有意义？
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Elispot
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Elispot结果判断
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方法学评价
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Westernblot原理
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Westernblot缺点 抗原表位可能被破坏而漏检
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放射免疫沉淀试验原理
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放射免疫沉淀试验 抗原表位不会破坏
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