Isolation and characterization of antagonists against Rhizoctonia sp.

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1 Isolation and characterization of antagonists against Rhizoctonia sp.
報告學生：楊麗燕、白瓊文

2 前言 * Rhizoctonia sp. （立枯絲核菌）屬於不完全菌綱，以菌核進行感染，是重要的植物病原菌。
* 在純培養下不形成有性與無性胞子，其營養菌絲具有下列特徵： 1. 菌絲的分枝在其起源處有縊縮； 2. 菌絲分枝在距分枝點處不遠有隔膜； 3. 菌絲常成直角或銳角分枝； 4. 菌絲無色至黃褐色，菌落最初為白色至乳白 色，最後呈黃褐色。

3 * 本菌可為害植株根、莖、葉，造成下位葉黃化，嚴重時，黃化現象向上蔓延，造成立枯病，也可在葉緣或葉鞘上造成不規則黃褐色
條斑等病徵。 * 本菌在水稻上會造成水稻紋枯病，在其他冬 季作物、田間雜草和其他植物上會造成種子 腐爛、根腐病和苗猝倒病，危害範圍相當廣泛，故其防治辦法也有許多研究報告。

4 * 前人研究 Bacillus spp.、Pseudomonas sepacia、Flavobacterium odoratum、Trichoderma spp.等都具有程度不一的防治效果。

5 目的 * 分離並初步鑑定具有能夠對 Rhizoctonia sp. （立枯絲核菌）產生拮抗作用的菌株。

6 材料 土樣 無菌生理食鹽水 培養基 本組與第五組土樣，故宮路上、青青農場旁及明水路上的菜園。
（1）1/10 TSA（＋cycloheximide 100 ppm） （2）1/10 TSA （3）MRB（+ streptomycin 30 ppm） （4）PDA （5）WA （6）WA（玻璃紙） （7）NA

7 生理及生化測試 ( 1 ) MacConkey agar ( 2 ) Simmons citrate agar slant
( 3 ) Trypticase nitrate broth ( 4 ) Gelatin ( 5 ) Phenol red glucose broth ( 6 ) Phenol red manniol broth ( 7 ) SIM agar ( 8 ) Starch agar

8 實驗架構 採樣 初步篩菌 細菌 真菌（Trichoderma spp.） 對峙培養 選效果明顯者 觀察菌絲纏繞 生化測試鑑定 分生孢子柄特徵

9 實驗方法 採樣 ↓ 篩菌 分離 純化 自不同農地取得土樣 土樣稀釋後推平板 細菌：由菌落外觀挑選 真菌：只取 Trichoderma
細菌：1/10 TSA + cycloheximide 100 ppm 真菌：MRB + streptomycin 30 ppm 土樣稀釋後推平板 細菌：由菌落外觀挑選 真菌：只取 Trichoderma 細菌：1/10 TSA 真菌：PDA, WA

10 ↙ ↘ Trichoderma sp. 細菌 玻璃紙 Rhizoctonia sp. Rhizoctonia sp. ↓ 生化測試 ↓ 鏡檢

11 表一、菌株資料與拮抗實驗結果 類 別 編 號 來 源 對 R. solani 生長抑制距離 （㎝） NA PDA 細 菌 P-1 本組 －
類 別 編 號 來 源 對 R. solani 生長抑制距離 （㎝） NA PDA 細 菌 P-1 本組 － P-2 P-3 P-4 P-5 0.5 G-1 青青農場 G-2 G-3 G-4 0.4 G-5 G-6 1.5 1.2 G-8 G-9 －：無抑制

12 表二、菌株資料與拮抗實驗結果 類 別 編 號 來 源 對 R. solani 生長抑制距離 （㎝） NA PDA 細 菌 B-1 故宮路 －
類 別 編 號 來 源 對 R. solani 生長抑制距離 （㎝） NA PDA 細 菌 B-1 故宮路 － N B-2 B-3 B-4 B-5 B-6 M-1 明水路 M-2 M-3 M-4 M-5 M-6 －：無拮抗效果 N：不生長

13 表三、菌株資料與拮抗實驗結果 類 別 編 號 來 源 對 R. solani 生長抑制距離 （㎝） NA PDA 細 菌 F-1 第五組
類 別 編 號 來 源 對 R. solani 生長抑制距離 （㎝） NA PDA 細 菌 F-1 第五組 0.8 － F-2 F-3* 0.6 F-4 F-6 F-7 F-8 F-9 F-10 F-11 F-12 F-13 F-16 －：無拮抗效果 * F-3後來證明為真菌

14 表四、菌株資料與拮抗實驗結果 類 別 編 號 來 源 對 R. solani 生長抑制距離 （㎝） NA PDA 放線菌 AB-7 故宮路
類 別 編 號 來 源 對 R. solani 生長抑制距離 （㎝） NA PDA 放線菌 AB-7 故宮路 1.3 － AG-7 青青農場 0.5 AG-10 N AF-5 第五組 AF-14 AF-15 AF-17 －：無拮抗效果 N：不生長

15 表五、真菌菌株資料與對峙實驗結果 類別 編號 來源 纏繞現象 Trichoderma spp. TG-1 青青農場 ＋* TF-1 第五組
－ TF-2 TM-1 明水路 TM-2 TP-1 本組 TT-1 助教 TT-2

16 F-1 G (+) 桿菌，菌落為霧面白色不透明且扁平，會隨畫線方向生成紡綞狀，直徑約 cm，邊緣粗糙，產孢時菌體會膨大。 G-4 G (+)桿菌，菌落為霧面白色不透明且扁平，直徑 cm，邊緣不規則，產孢。 G-5 G (+)桿菌，菌落為霧面白色不透明且扁平，直徑0.3 cm左右，邊緣不規則，產孢。

17 P-5 F-3 G (-)球桿菌，菌落為有光澤的乳白色，呈圓形突起，直徑0.1 cm ，具有黏性，不產孢。
絲狀真菌，起先為白色，成熟後菌落中間呈墨綠色，鏡檢後有帚狀的分生孢子柄。

18 TF-2 Trichoderma sp. ，產孢後菌落顏色偏黃綠色，分生孢子柄為短瓶狀，孢子是圓形。 TG-1 Trichoderma sp. ，產孢後顏色偏綠色，分生孢子柄為瓶狀，孢子為略尖的圓形。

19 表三、具拮抗能力菌株之生化測試 B. subtilus F1 G4 G5 P5 30℃ ＋ 50℃ － mobility citrate
nitrate catalase starch gelatin glucose ＋－ mannitol

20 Gram’s stain － ＋ P-5 F-1 G-4 G-5 coccobacilli (+) catalase endospore, rod (+) motility (-) glucose (-) Bacillus spp. 5 genera and 1 family

21 F-1 G-4 G-5 Bacillus spp. （－） Grow at 50℃（＋） 23 species 11 species (-)
Mannitol (±) F-1 G-4 G-5 B. pantotenticus (±) Glucose (+) G-5 G-4 B. brevis B. licheniformis

22 結果 1. 拮抗實驗所得到的有明顯效果者，在五十三株不同類型的測試菌中共有 10 株，其中Trichoderma spp.有兩株，放線菌有三株，其他種類細菌有四株，還有一株 Penicillium sp.。 2. 經生理生化測試後得知 F-1、G-4、G-5屬於 Bacillus spp.，而剩下一株 P-5 經推論認定屬於 Flavorbacterium sp.。

23 3. B. subtilus 作為 Gram’s stain 的正對照，經試驗後亦發現有拮抗 R. solani 的能力。
4. 三株 Bacillus spp. 經過進一步的測試後，判斷 F-1、G-4、G-5分別為 B. pantotenticus、B. licheniformis 以及 B. brevis。

24 5. Trichoderma spp.八株中僅 TF-2 及 TG-1 有菌絲纏繞現象
6. F-3 菌絲起先為白色，成熟後菌落中間呈墨綠色，鏡檢後有帚狀的分生孢子柄，故認定為 Penicillium sp.。 7. 三株放線菌並未再作進一步鑑定。

25 討論 1. 多數的細菌菌株在 PDA平板上不生長，而有拮抗能力的細菌菌株在 PDA 上的表現也多較 NA上差，推斷是因為 pH 值太低，不適合細菌生長。 2. Trichoderma spp.和 Rhizoctonia sp. 之間的拮抗無法直接從菌落外表看出，必須經由鏡檢才能確定是否有菌絲纏繞的現象。

26 3. F-3是真菌 Penicillium sp.，但卻能在添加cycloheximide 的 1/10 TSA 上生長，也許是它對 cycloheximide 具有抗性。

27 有明顯拮抗效果的菌株

28 有明顯拮抗效果的菌株

29 真菌在分離平板上之形態

30 顯微鏡下Trichoderma sp. 對 Rhizoctonia sp. 纏繞的情形

31 生化測試

32 參考文獻 Hebbar, P., Berge, O., Heulin, T. and Singh, SP Bacterial antagonists of sunflower (Helianthus annuus L.) fungal pathogens. Plant soil 133: Hoitink, HAJ Production of disease suppressive compost and microorganism culture for use therein. US Patent 4,642,131. Nielsen, Preben, and Sørensen, Jan Multi-target and medium-independent fungal antagonism by hydrolytic enzymes in Paenibacillus polymyxa and Bacillus pumilus strains from barley rhizosphere. FEMS Microbiology Ecology 22: Yu G.Y., Sinclar, J.B., Hartman, G.L., and Bertagnolli, B.L Production of iturin A by Bacillus amyloliquefaciens suppressing Rhizoctonia solani . Soil Biology and Biochemistry 34: