细 胞 凋 亡 检 测.

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1 细 胞 凋 亡 检 测

2 细 胞 凋 亡 概 念 是多细胞有机体为维护内环境稳定，由基因控制的细 胞自主、有序的死亡过程 涉及一系列基因的激活、表达和调控
在生物体进化、维持内环境稳定、多系统发育等过程 中起着重要作用

3 细 胞 凋 亡 过 程

4 细胞凋亡的几种检测方法 形态学观察：普通光镜、荧光显微镜、透射电子显微镜 磷脂酰丝氨酸外翻分析（Annexin V法） 线粒体膜势能的检测
DNA片断化检测：大分子染色体DNA片段、 DNA Ladder 脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法 （terminal -deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling, TUNEL） 半胱氨酸蛋白酶Caspase家族活性的检测

5 形态学观察 光学显微镜和倒置显微镜：体积缩小、核深染、核碎裂、 荧光显微镜和激光共聚焦显微镜： DNA特异性染料
凋亡小体形成、无炎症反应 荧光显微镜和激光共聚焦显微镜： DNA特异性染料 （ Hoechest 33342/33258, DAPI） 透射电子显微镜：超微结构是诊断凋亡的最可靠指标

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7 Annexin V法 Annexin V:钙依赖性的磷脂结合蛋白，与PS可高亲和力特异性结合
磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine，PS）：细胞凋亡早期从内侧翻转到细胞膜表面 Annexin V:钙依赖性的磷脂结合蛋白，与PS可高亲和力特异性结合

8 Annexin V 与 PI联合 碘化丙啶(propidine iodide, PI)是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI能够透过细胞膜而使细胞核红染。因此将Annexin-V与PI匹配使用，就可以将凋亡早晚期的细胞以及死细胞区分开来。 已开发出多种荧光标记的试剂盒

9 荧光显微镜结果 流式细胞仪分析

10 线 粒 体 膜 势 能 检 测 线粒体跨膜电位DYmt的下降，被认为是细胞凋亡级联 反应过程中较早发生的事件，它发生在细胞核凋亡特征
（染色质浓缩、DNA断裂）出现之前 亲脂性阳离子荧光染料（如Rhodamine 123、Dioc6、JC- 1、TMRM等）可结合到线粒体基质，流式细胞仪检测 细胞的荧光强度 不能区分细胞凋亡或其他原因导致的线粒体膜电位的变 化

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12 DNA 片 断 化 检 测 细胞凋亡时主要的生化特征是其染色质发生浓缩, 染色质DNA在核小体单位之间的连接处断裂, 形成50~300kb长的DNA大片段, 或180~200bp整数倍的寡核苷酸片段, 在凝胶电泳上表现为梯形电泳图谱(DNA ladder)。

13 TUNEL 细胞凋亡中, 染色体DNA双链断裂或单链断裂而产生大 量的粘性3’-OH末端，可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶
（TdT）的作用下，将脱氧核糖核苷酸和荧光素、过氧化 物酶、碱性磷酸酶或生物素形成的衍生物标记到DNA的 3’-末端，从而可进行凋亡细胞的检测 是分子生物学与形态学相结合的研究方法，对完整的单 个凋亡细胞核或凋亡小体进行原位染色，能准确地反应 细胞凋亡典型的生物化学和形态特征

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15 Caspase活性的检测 在正常状态下， Caspase家族都以无活性的酶原(30～
50kD)形式表达，当细胞发生凋亡时Caspase可以被蛋白酶 裂解，大亚基和小亚基形成活化的Caspase 。一些Caspase 活化后可以次序激活其他Caspase形成Caspase级联反应， 促发细胞凋亡。在目前已知的14种Caspase中， Caspase- 3、Caspase-8和Caspase-9与凋亡的关系最为密切，在细 胞凋亡中起执行凋亡的作用。

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18 相关基因表达的检测 细胞凋亡时许多基因表达异常，检测这些凋亡相关调 控基因的表达水平也成为检测细胞凋亡的常用方法
Fas ；c-myc；Bcl-2 和bcl-X 表达水平比例 方法：Northern杂交、PCR、Western Blot、免疫组化 Amplifluor™ Apoptosis Gene Systems： 检测fas, bax-alpha 和 bcl-X (长的) 基因的 mRNA表 达水平

19 端 粒 酶 检 测 端粒酶是由RNA和蛋白组成的核蛋白，它可以自身 RNA为模板逆转录合成端粒区重复序列，使细胞获得 “永生化”。
作为有丝分裂的一种时钟，表明细胞年龄、复制衰老或 细胞凋亡的信号 TRAP-eze Telemerase Detection Kit：在提供特定的寡 核苷酸底物，分别与底物及端粒重复序列配对的引 物。如果待测样本中含有端粒酶活性，就能在底物上 接上不同个数的6碱基（GGTTAG）端粒重复序列， 通过PCR反应，产物电泳检测就可观察到相差六个碱基 的DNA Ladder现象     这种检测方法也不专对细胞凋亡，检测结果也不纯反 应细胞凋亡的发生

20 细胞内氧化还原状态检测 谷胱苷肽(GSH)是细胞的一种重要的氧化还原缓冲剂 许多细胞的细胞膜中有可被凋亡信号启动的ATP依赖的
荧光染料MCB体外检测凋亡细胞细胞质中谷胱苷肽的减 少来检测凋亡早期细胞内氧化还原状态的变化 HeLa 和3T3细胞等凋亡时没有明显的GSH水平变化，不能 用此法检测

21 细胞色素C的定位检测 凋亡信号刺激可使细胞色素C从线粒体释放至细胞液，结
合Apaf-1 （apoptotic protease activating factor-1）后启 动caspase级联反应 细胞色素C氧化酶亚单位Ⅳ（cytochrome c oxidase subunit Ⅳ：COX4）是定位在线粒体内膜上的膜蛋白， 凋亡发生时，它保留在线粒体内，因而它是线粒体富集 部分的一个非常有用的标志 ApoAlertTMCell Fractionation Kit（Clontech）   

22 流式细胞仪对细胞凋亡的分析 线粒体功能 Annexin V Assay Caspases DNA Fragmentation Assays
DNA Cycle 优缺点：速度快、定量、收集大量数据 、 多参数测 量；分选；从细胞整体上测量，不能定位

23 流式分析DNA含量

24 凋亡检测方法的选择 每种检测方法均有其优缺点，应对其原理有所了解 根据自己的研究目的、样本种类选择合适的方法 一般选择两种以上不同检测方法
针对不同检测方法已开发出多种商业试剂盒，简化 了实验步骤和操作程序