ELISA 基本原理.

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1 ELISA 基本原理

2 ELISA ( Enzyme-linked Immuno-sorbent Assay ):酵素免疫分析法

3 ELISA用的檢測盤

4 (Direct)Antigen detection
ELISA 實驗原理 (Direct)Antigen detection 呈色劑 鏈結酵素之抗體 抗原(sample) Coated 抗體 polystylene

5 (Indirect)Antibody detection
ELISA 實驗原理 (Indirect)Antibody detection 呈色劑 鏈結酵素之抗體 抗體(sample) Coated抗原 polystylene

6 Antibody? Name? Mouse anti-human IgG , HRP Labeled Human anti-virus A
Host:Mouse IgG Mouse anti-human IgG , HRP Labeled Label:HRP Host:human IgG Human anti-virus A Virus A

7 ELISA 實驗步驟 先將抗原coating在檢測盤的表面上4℃overnight，再進行blocking buffer處理
加入100ul sample, incubat 1hr 用wash buffer清洗3次(每次 ul) 加入100ul鍵結酵素之抗體, incubate 1hr 用wash buffer清洗 3次(每次 ul) 加入100ul呈色劑 ( substrate ) 10-15min後，加入50ul終止液(stop solution) ELISA reader進行OD(optical density)判讀

8 酵素與呈色劑的種類 Enzyme Substrate ABTS(405nm) HRP(Horseradish Peroxidase)
TMB(450nm) AP(Alkaline Phosphatase) pNPP(490nm)

9 Immunoassay 酵素免疫分析法( Enzyme Immunoassay ; EIA )
螢光免疫分析法( Fluorescence Immunoassay ; FIA ) 冷光免疫分析法( Luminescence Immunoassay ; LIA ) ELISA

10 EIA LIA FIA 激發光 呈色劑 吸光值 放射光 冷光劑 light 螢光劑

11 ELISA Reader 判讀原理

12 BEER`S LAW A = -logI/I0 = -logT =log1/T ( I0) Light Detector ( I )
filter Light Detector ( I ) A = -logI/I0 = -logT =log1/T A:吸光值 T:穿透率

13 BEER`S LAW 啤酒定律 A = -logI/I0 = -logT = log1/T A = abc A = 吸光值 a = 常數
b = 光徑 ( 1 cm ) c = 濃度 ( g / L )

14 原理 利用每一種物質皆有其獨特吸收波峰 如 : Protein 280 nm DNA ,RNA 260 nm pNPP 405 nm
TMB nm H2O nm

15 原理 A = abc 利用分光光度計在260 nm直接定量
若OD(吸光值) = , 已知 a(常數) = 0.02 mg/ml b(光徑) = 1 cm 公式 A=abc 因此 0.8 = 0.02 x 1 x c C = 0.8 x 50ug/ml = 40 ug/ml

16 Standard Curve(標準曲線)

17 應用 1. DNA RNA 定量 260 / 280 Ratio DNA RNA / Phenol Ratio
Lowry Protein Quant ( 660 nm ) Bradford Protein Quant ( 595 nm ) BCA Protein Quant ( 562 nm )

18 應用 2. ß-Galactosidase 定量 ( 420 nm ) NADH ( 340 nm ) ABTS ( 405 nm )
OPD ( 492 nm ) TMB ( 450 nm ) pNPP ( 405 nm )

19 應用 3. Urease 定量 ( 588 nm ) MTT ( 570 / 690 nm ) XTT ( 492 / 690 nm )
WST-1 ( 450 / 690 nm ) Methylene Blue ( 658 nm ) 專一測定樣本內,血清蛋白,荷爾蒙,藥物,細菌和病毒或其誘發之抗體的含量(須搭配ELISA實驗及ELISA reader)

20 Photometry 分類 photometry Filter 濾鏡 ELISA Reader 免疫酵素判讀儀 連續波長
Spectrophotometer 分光光度計 photometry Filter 濾鏡 ELISA Reader 免疫酵素判讀儀 連續波長

21 Horizontal Photometry
Light Source Detector Absorbing solution Vessel

22 Vertical Photometry Light Source Absorbing solution Detector

23 ELISA Reader 基本原理 Data

24 Spectrophotometer分光光度計
優點 : 連續性波長 ( 190 ~ 1100 nm ) 準確度高 , 可達 Abs 1 cm 光徑cuvette , 可直接換算濃度

25 Spectrophotometer分光光度計
缺點 : 一次只能操作一個sample 需要較多的sample量 無法進行真正的ELISA assay

26 ELISA Reader酵素免疫分析儀 優點 : 一次可處理大量sample ( 96 , 384 well plate ) 應用範圍廣
所需sample體積小( 100~200 ul )

27 ELISA Reader酵素免疫分析儀 缺點 : 精準度不及分光光度計 無法做快速光譜掃瞄工作 每個well光徑並不是1cm

28 ELISA 實驗步驟(競爭型) 取出已coating上抗原的96孔檢測盤 加入sample 100ul , incubate 90 mim
Coated抗原 鏈結酵素之抗體 基質 抗體(sample) 取出已coating上抗原的96孔檢測盤 加入sample 100ul , incubate 90 mim 清洗 ( washing 200ul)3次 加入鍵結酵素之抗體(conjugate) 100ul , incubate 60min 清洗 ( washing 200ul ) 3次 加入基質 ( substrate ) 100ul 15min , 使之呈色 加入終止液50ul ELISA reader進行450 nm 吸光值判讀